硝基阿司匹林纠正肿瘤宿主的免疫功能障碍，并通过癌症疫苗接种促进肿瘤根除

摘要

确定有效的癌症治疗方法是临床的首要任务。尽管临床前模型中有大量证据，但最先进的免疫治疗，无论是主动还是被动，在人类临床试验中的成功率都有限(1). 这一结论的基础似乎至少部分涉及骨髓细胞的进行性积累，骨髓细胞对肿瘤生长的抗肿瘤淋巴细胞具有强大的抑制活性。例如，在肿瘤宿主中，肿瘤进展通常与造血改变有关，这导致骨髓细胞在肿瘤部位、血液、次级淋巴器官和骨髓中积聚(2–4).

小鼠骨髓细胞表达CD11b和Gr-1标记，具有成熟-不成熟混合骨髓表型，并负责诱导肿瘤特异性和非特异性T细胞功能障碍，这不仅在可移植肿瘤中常见，而且在组织限制性癌基因转基因表达的自发肿瘤中也常见(2,5). 这些细胞被称为髓样抑制细胞（MSCs），来源于骨髓和其他造血器官，暴露于作用于骨髓单核细胞前体的系统性释放因子（在参考文献中综述）。2,三，以及6). 此外，MSC是对肿瘤免疫产生负面影响且需要自然杀伤T细胞参与的回路的最终效应器。最近发现CD11b释放的TGF-β下调了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的肿瘤免疫监测⁺/等级-1⁺细胞，一种由CD1d限制性自然杀伤T细胞释放细胞因子IL-13驱动的事件(7). 该电路在肿瘤进展的早期被激活，不需要MSC在次级淋巴器官中积聚。

消除MSC，或者在体外或体内，完全逆转CD8的抑制⁺在一些实验模型中，T细胞反应并防止肿瘤复发，这表明肿瘤特异性免疫在肿瘤宿主中并未受损，而是暂时受损(7–10). 尽管有这一初步证据，但仍缺乏明确证据证明阻断MSC依赖性抑制可恢复肿瘤宿主中肿瘤特异性T淋巴细胞的免疫反应性。此外，抗MSC治疗没有选择性，部分原因是缺乏独特的MSC标记物。另一种方法是通过生物活性分子干扰MSCs的抑制过程。通过使用克隆的髓样抑制细胞系和新分离的MSCs作为工具来定义限制T淋巴细胞活化的抑制途径，我们发现MSCs通过一种需要关键酶的机制来抑制抗原活化但非静止的T细胞反应我-精氨酸代谢：一氧化氮合酶（NOS）2和精氨酸酶（ARG1）的诱导形式(11,12). NOS2和ARG1可以单独或协同作用。NOS2产生NO，阻止IL-2受体的信号级联(13)，而我-ARG1活性诱导的精氨酸耗竭导致T细胞受体的zeta链丢失，从而导致其信号特性受损(14,15). 在有限的条件下，NOS2诱导两种酶产生过氧亚硝酸盐我-精氨酸的可用性，导致活化的T细胞发生凋亡(三,11,12).

干扰活性氧生成的这些酶或分子的选择性拮抗剂已被证明在控制髓细胞依赖性抑制方面是有益的在体外在小鼠和人类肿瘤中(三,16,17)但往往具有严重的副作用，妨碍了他们的系统管理。试图将NO-释放部分与传统的非甾体抗炎药或其他抗炎药偶联，以降低这些化合物的胃肠毒性(18). 这些新分子具有有趣的特性，例如抗氧化活性、抑制活性氧生成(19)，抑制单核细胞释放促炎细胞因子(20)NOS2催化活性的反馈抑制(21)和抑制癌细胞增殖(22)所有这些都使其成为缓解MSC诱导的肿瘤宿主免疫系统改变的安全候选药物。

材料和方法

细胞系。CT26（H-2^d日)，一种BALB/c致癌物诱导的结肠癌；MBL-2（H-2^b条)是一种Moloney病毒诱导的淋巴瘤；P815（H-2^d日)肥大细胞瘤；C26-GM，一种来源于C26结肠癌（H-2）的细胞系^d日)转基因释放粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子；和线路N2C（H-2^d日)，一种原代乳腺癌细胞系，已在参考文献中描述。11,13,23，以及24.293-L^d日细胞系是稳定转染pL的人胚胎肾细胞系^d日-表达H-2 L的444质粒^d日I类分子。MSC-2线（H-2^d日)如参考文献所述，被永久化和克隆。13细胞在DMEM（Invitrogen）或添加2 mM的RPMI培养基1640（Euroclone，Wetherby，U.K.）中生长我-谷氨酰胺/10 mM Hepes/20μM 2-巯基乙醇/150单位/ml链霉素/200单位/ml青霉素/10%热灭活FBS（Invitrogen）。

质粒构建和小鼠。这个环境从质粒pcDL-Srd296-H52中切下插入物Acc公司一、 在pBluescript中进行子克隆，然后在pcDNA3（Invitrogen）中克隆生态RI和Xho公司我(23). 对于质粒p185，编码突变大鼠p185的细胞外和跨膜结构域的部分^neu（新）在pcDNA3中克隆，如参考文献所述。25.BALB/c（H-2^d日)和C57BL/6（H-2^d日)小鼠（8周龄）购自Harlan（意大利乌迪内SanPietro al Natisone）。在左侧皮下接种肿瘤细胞的小鼠，每天用药物治疗两次，并每隔一天检查一次，以通过卡尺测量跟踪肿瘤生长。9天后，或当肿瘤溃疡或其面积大于1或2 cm时，将动物杀死²（分别进行预防和治疗实验）。动物护理和程序符合国家和国际法规的机构指南。

化学制品。NicOx提供了NO-氧化阿司匹林[NCX 4060，2-（乙酰氧基）苯甲酸2-（硝基甲基）苯酯；NCX 4016，2-（乙氧基）安息香酸3-（硝基甲氧基）苯基酯]、NCX 4016[NCX 4017，2-（甲氧基基）苯酸3-（羟甲基）苯基酯的脱硝类似物和阿司匹灵。将NO阿司匹林溶解在二甲基亚砜（Sigma–Aldrich）中，然后在2.5%羧甲基纤维素（Sigma-Aldrich）中稀释至最终浓度。N个^G公司-一甲基-我-精氨酸(我-NMMA；钙生物化学）在500μM下使用，并且我-去甲缬氨酸(我-诺夫；钙生物化学）在5 mM下使用。胍基乙基二硫碳酸氢盐（Sigma–Aldrich），S公司-亚硝基-N个-乙酰青霉胺（分子探针）、锰-（III）-四（4-苯甲酸）-卟啉（钙生物化学）和单硝酸异山梨酯（Sigma–Aldrich）的使用浓度为图1.

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图1。

NO阿司匹林可恢复骨髓抑制因子抑制的T淋巴细胞功能。(A类)骨髓间充质干细胞抑制同种异体反应细胞在MLR中刺激的正常脾细胞。NCX 4016恢复增殖反应。数据表示为在没有MSC和药物的对照MLR中检测到的增殖百分比。报告了在对照培养物中对T淋巴细胞增殖没有负面影响的最低药物浓度。(B类)用同种反应细胞刺激BALB/c荷瘤小鼠的脾细胞池。结果显示为裂解单位的分数₃₀在存在各种抑制剂的无瘤小鼠的MLR中测定。(C类)MSCs抑制抗CD3和抗CD28诱导的脾细胞增殖，不同NO阿司匹林异构体可恢复脾细胞增殖。数据表示为三份的cpm平均值（±SE）。快照，S公司-亚硝基-N个-乙酰青霉胺；GED，胍基乙基二硫碳酸氢盐；MnTBAP，锰-（III）-四-（4-苯甲酸）-卟啉(天)通过分别口服或腹腔注射NCX 4016或NCX 4060，荷瘤小鼠的同种异体反应性得以恢复。显示了来自无肿瘤小鼠（无肿瘤）或用NCX 4017通过灌胃处理的对照小鼠的MLR衍生的淋巴细胞的细胞毒性进行比较。

DNA免疫和CTL反应评估。将质粒DNA重新悬浮在浓度为1 mg/ml的无核水中，与6 mg/ml聚乳酸混合-我-谷氨酸和150 nM氯化钠。BALB/c小鼠通过静脉注射Avertin（Sigma–Aldrich）进行麻醉，并双侧胫骨肌肉注射50μg p185或100μg pcDNA3-环境将两个不锈钢平行板卡尺电极连接到T820 Electro Square Porator（BTX，San Diego），并在DNA递送后立即应用于肌肉以进行电穿孔(26). 脾细胞（3×10⁶)来自BALB/c小鼠，其中一些之前用NO阿司匹林治疗，用3×10孵育⁶γ射线照射的C57BL/6脾细胞。五天后，对培养物进行裂解2×10的能力测试⁴5小时内同种异体（MBL-2）或对照（P815）靶细胞⁵¹参考文献中所述的铬释放试验。11.

增殖试验。BALB/c脾细胞（7.5×10⁵每个孔的细胞数）用7.5×10刺激⁵在96周的平底板（BD Falcon labware，Becton Dickinson）中，γ辐照C57BL/6脾细胞与γ辐照MSC-2细胞（2.25×10⁴)以前用IL-4治疗过(23)不含或不含阿司匹林。或者，在涂有3μg/ml抗CD3（2C11，ATCC）和2μg/ml抗CD28（克隆37.5，ATACC）的微孔中刺激脾细胞。培养3天后，用1μCi（1 Ci=37 GBq）的^三每口井18小时的H-TdR（PerkinElmer），以及^三用闪烁计数法测定H-TdR掺入量。

MHC/肽四聚物的合成。MHC I类L^d日-采用自动固相法合成了与gp70的423–431氨基酸相对应的限制性肽（AH1肽）(23). 由Technogen（Naples）合成并纯化了β-Gal蛋白876–884氨基酸对应的肽。藻红蛋白标记的H-2肽四聚体是通过将生物素化复合物与外源性藻红蛋白（Sigma–Aldrich）混合产生的，并通过对具有适当特异性的CTL克隆进行染色验证(11).

混合白细胞肽培养、ELISA、NO生成和ARG活性测定。脾细胞（2.5×10⁷)用gp70L刺激^d日肽（1μM）在10 ml DMEM 10%FBS中25 cm中放置5天²37°C、5%CO条件下的组织培养瓶（BD Falcon labware，Becton Dickinson）₂脾细胞（10⁶细胞）混合白细胞肽培养物与10个白细胞肽共培养24小时⁵靶细胞；然后按照制造商的说明，采集上清液，并在夹心ELISA试验（Endogen，Boston）中测试释放的IFN-γ。通过Griess反应测量培养物中释放的NO作为NO的量_三^–和否₂^–使用硝酸盐/亚硝酸盐检测试剂盒（开曼化学公司，密歇根州安阿伯）生产。如上所述，在细胞裂解物中测量ARG活性，1个单位的ARG定义为每分钟催化1μg尿素形成的量。

组织学和免疫组织化学。用抗NOS2（肯塔基州列克星敦市转导实验室）或抗硝基酪氨酸（Chemicon）对丙酮固定的冷冻切片进行免疫染色。对于CD11b/Gr-1双重免疫染色，冷冻切片与大鼠IgG孵育_2亿抗CD11b的单克隆抗体（英国莱斯特郡Harlan Sera-Lab）和山羊抗鼠IgG的FITC-结合Fab片段（Jackson ImmunoResearch）。冲洗后，将切片与山羊抗大鼠IgG的未标记的阻断Fab片段（Jackson ImmunoResearch）孵育。然后用大鼠IgG孵育切片_2亿单克隆抗体抗Gr-1（克隆RB6-8C5，ATCC）和Alexa Fluor 546结合的山羊抗鼠IgG（分子探针）。

结果

NO阿司匹林纠正T淋巴细胞功能障碍体外.我们开发了一个简单的在体外快速检测NO非甾体抗炎药以寻找干扰MSCs免疫抑制活性的分子的分析。建立了一种混合白细胞反应（MLR）检测方法，该方法使用和不使用经γ射线照射的MSC克隆，其浓度足以完全抑制同种异体刺激T淋巴细胞的增殖。对不同剂量的NO供体分子进行测试，以比较其相对疗效。只有NCX 4060，一种无阿司匹林，恢复了在体外MSC存在下T淋巴细胞增殖对同种异体抗原的反应(图1A类). 阿司匹林没有效果（数据未显示）。

接种转染表达粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的C26腺癌的BALB/c小鼠中，同种反应性CTL的生成受到损害，这是已知的诱导MSC积聚和免疫无反应的因素之一(图1B类) (9,11). 如前所示(11)，T淋巴细胞抑制依赖于我-精氨酸代谢，并被NOS和ARG1抑制剂的混合物逆转，我-NMMA和我-分别为norv(图1B类). NCX 4060单独使用可有效消除MSC诱导的T细胞无反应性并恢复荷瘤小鼠的同种反应性CTL(图1B类). NCX 4017是一种不含NO-氧化基的硝基阿司匹林间隔分子，在这些研究中用作对照，但没有效果，这表明NO的释放对于在体外NO阿司匹林活性(图1B类).

NCX 4060是以芳香间隔物为特征的NO-氧化阿司匹林的原型。有不同的NO阿司匹林立体异构体，包括NCX 4016。这两种化合物都能恢复受刺激的T淋巴细胞的增殖在体外在MSC存在下用抗CD3和抗CD28(图1C类). 相反，NO供体(S公司-亚硝基-N个-乙酰青霉胺）和NCX 4017在所有测试浓度下均无效，表明单独释放NO或水杨酸均不足以逆转抑制。MSCs在以下条件下产生的过氧亚硝酸盐我-精氨酸缺乏，如ARG1激活(11,16)已知对T淋巴细胞具有极高毒性(17)参与MSC抑制途径(三,11). 因此，ARG和NOS抑制剂的组合或过氧亚硝酸盐扫描剂[胍基乙基二硫化物碳酸氢盐和锰-（III）-四-（4-苯甲酸）-卟啉]恢复了MSCs受损的增殖反应，表明ARG和NOS酶联合活性产生的过氧亚硝酸盐对MSC抑制活性有相关贡献。

NO阿司匹林纠正系统性T淋巴细胞功能障碍在体内.评估他们的体内我们在荷瘤小鼠中测试了NCX 4016和NCX 4060。NCX 4016先前被证明在动物和人类中口服时非常有效(18). 事实上，尽管NCX 4060仅在静脉注射时才有效，但NCX 4016在连续9天以12.5至50 mg·kg的浓度经口灌胃给药时，恢复了受损的同种异体反应性CTL反应^–1·天^–1在携带结肠癌C26-GM的小鼠中(图1天). 因为MLR是在没有任何药物的情况下进行的，所以我们可以得出结论，来自NCX 4016治疗的荷瘤小鼠的MSCs已经失去了其免疫抑制活性，而NCX 4015是有效的体内NCX 4016未改变脾脏中MSC的数量和百分比（11±3.2%vs.12.9±6.5%CD11b⁺/等级-1⁺分别用载体或NCX 4016治疗的荷瘤小鼠），表明其影响MSC积聚下游的事件（见下文）。恢复同种异体抗原免疫反应的相同剂量仅导致肿瘤生长轻微迟缓（图5，发表于支持信息在PNAS网站上）。当NCX 4016灌胃终止时，肿瘤进展，各组之间的存活率无统计学差异（数据未显示）。服用NCX 4017或NO供体对T淋巴细胞反应性和肿瘤生长没有影响，因此证实了NO阿司匹林的特殊生物活性（图。​（图1天1天和5）。

NO阿司匹林对荷瘤小鼠ARG活性和NOS活性的影响。因为ARG1和NOS2是MSC对T淋巴细胞抑制活性的核心(11,12)，我们评估了体内NO阿司匹林对这些酶的影响。如前所述(11)，CD11b⁺与从无瘤小鼠分离的相同细胞组分相比，来自荷瘤小鼠的脾细胞的ARG和NOS活性显著增加(t吨测试，P（P）< 0.01 (图2A类). 口服NCX 4016降低CD11b中的两种酶活性⁺荷瘤小鼠脾细胞CD11b水平⁺从无瘤小鼠中分离的细胞。有趣的是，NCX 4017并不影响肿瘤携带CD11b的NOS活性⁺但在同一细胞中，ARG显著降低了同一细胞的尿素生成，这表明NO阿司匹林的不同部分具有不同的药理活性：NO释放对NOS抑制至关重要，而阿司匹灵间隔区部分负责ARG依赖性效应。从接受NCX 4016治疗的小鼠中提取的s.c.C26-GM肿瘤标本的细胞浸润中也没有NOS2(图2B类). 由于缺乏试剂，我们无法通过免疫组织化学检测肿瘤浸润中ARG1蛋白的变化；然而，在CD11b中检测到ARG酶活性升高⁺通过口服NCX 4016，浸润肿瘤的细胞减少（图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。在生理pH值下，过氧亚硝酸盐发生异构化裂解，形成羟基阴离子和氮离子，硝酸化蛋白质酪氨酸残基(27). 因此，蛋白质上硝基酪氨酸的存在可以作为体内过氧亚硝酸盐的形成。口服NCX 4016可完全消除肿瘤内过氧亚硝酸盐的生成，组织切片中的硝基酪氨酸几乎完全消失(图2B类). 最后，经NCX 4016治疗的肿瘤的CD11b含量较低⁺和Gr-1⁺细胞（34.57±11.67 vs.58.5±17.17，×400视野，0.180 mm²每个字段；P（P）<0.01），表明肿瘤内MSC招募减少或生存率降低（图6）。

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图2。

NO阿司匹林治疗抑制NOS和ARG活性体内.(A类)口服NCX 4016和NCX 4017对CD11b中ARG和NOS活性的影响⁺从荷瘤小鼠分离的脾细胞。数据来自三个单独的实验，以平均值±SE表示(B类)取自NCX-4016治疗和未治疗（无NCX）小鼠的C26-GM肿瘤的免疫组化结果与NOS2和ARG活性的丧失一致A类NOS2和硝基酪氨酸（红色）主要存在于未经治疗的小鼠肿瘤中，而在经过治疗的小鼠中几乎不存在。

NO阿司匹林缓解肿瘤特异性无反应。为了确定接受NO阿司匹林的小鼠的抗肿瘤反应，我们监测了几种小鼠肿瘤对内源性逆转录病毒gp70 env蛋白及其免疫原性AH1肽的特异性免疫反应(23). 用AH1 L刺激C26-GM荷瘤小鼠的脾细胞^d日-来自gp70抗原的限制性肽，培养5天后，用AH1-L染色^d日H-2四聚体（AH1-TET）用于枚举肿瘤特异性T淋巴细胞，并测试针对AH1产生的IFN-γ，如参考文献所述。23.

肿瘤特异性CD8⁺在单独接受载体或对照NCX 4017的荷瘤小鼠中未检测到T淋巴细胞（数据未显示），而AH1-TET的数量增加⁺/CD8（CD8）⁺用连续9天的NO-释放NCX 4016治疗的荷瘤小鼠的淋巴细胞迅速恢复(图3A类). 接种γ射线照射的CT26（一种gp70阳性的结肠癌）可诱导AH1-TET的出现⁺在无瘤小鼠中的淋巴细胞，但在荷瘤小鼠中没有。有趣的是，γ射线细胞疫苗并没有显著增加AH1-TET的数量⁺NCX 4016处理小鼠的细胞(图3A类)但它确实增强了NCX 4016（而不是NCX 4017）的作用，与单独接种NCX 4015或疫苗的荷瘤小鼠相比，改善了对AH1抗原的整体功能反应(图3B类).

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图3。

口服NO阿司匹林可恢复肿瘤特异性CD8的数量和功能⁺癌症疫苗诱导的T细胞。(A类)减去阴性对照β-Gal获得的背景染色后，计算门控CD3/CD8-阳性细胞中AH1-TET阳性细胞的绝对数量_876–884-L（左）^d日/四。(B类)通过释放IFN-γ评估肽刺激T淋巴细胞的功能。IFN-γ释放值报告为肽脉冲和非脉冲293-L存在时获得的值之间的差异^d日在24小时试验中用作刺激物的细胞。数据表示为平均值±SE(n个= 5).

NO阿司匹林增强重组肿瘤疫苗的作用。基于这些发现，我们测试了将gp70疫苗接种与NCX 4016治疗结合是否会增强抗肿瘤活性。我们之前已经证明，在缺乏佐剂的情况下，用gp70抗原进行DNA免疫是很弱的(23)尽管诱导了AH1特异性T淋巴细胞，但并未产生显著的抗肿瘤作用。CT26细胞系是一种未分化结肠癌，与C26密切相关，之前研究表明C26在其进展过程中具有免疫抑制活性(9,28). 在这个实验中，用空的pcDNA3质粒（对照）或pcDNA3给小鼠接种疫苗-环境（编码全长环境基因），用CT26激发，然后在激发后1至18天用NCX 4016或NCX 4017灌胃治疗。仅接受pcDNA3的小鼠-环境并且被口服NCX 4016显示出显著延长生存期；此外，当实验终止时，20%的患者在长达120天的时间内保持无肿瘤状态(P（P）< 0.01) (图4A类).

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图4。

口服NO阿司匹林对重组肿瘤疫苗的辅助作用。(A类)口服NO阿司匹林增强内源性逆转录病毒（pcDNA3）的DNA疫苗编码-环境)以防止结肠癌的挑战。仅接种pcDNA3小鼠的存活率-环境与NCX 4016治疗组相比差异显著（Mantel–Haenszel试验，P（P）<0.01）。(B类)口服NO阿司匹林可提高DNA疫苗对已确诊癌症的治疗效果。只有经NCX 4016和p185编码DNA疫苗联合治疗的小鼠显示出显著的生存延长（Mantel–Haenszel试验，P（P）< 0.01). 在DNA疫苗接种后70天，对照组年龄匹配的小鼠和拒绝肿瘤的小鼠分别在对侧侧翼和同侧上肢受到N2C或CT26细胞的攻击（箭头所示）。

这些实验表明，NO阿司匹林增强了针对弱抗原的抗肿瘤反应，至少在肿瘤发展的初始阶段是这样的。为了研究NCX 4016和疫苗接种对已建立肿瘤的影响，我们使用了一种不同的肿瘤模型，该模型先前显示可以诱导大量MSC。原代乳腺癌细胞株N2C来源于雌性BALB-neuT小鼠，这些小鼠自发形成乳腺肿瘤，用于转基因表达活化的大鼠HER-2/neu（新）p185癌基因(24). 用编码HER-2细胞外和跨膜部分的质粒DNA进行免疫，可治愈s.c.N2C肿瘤/neu（新）（p185）在平均肿瘤面积<20±0.9 mm时接种²（未显示数据）。然而，当肿瘤的平均大小达到48毫米时²(图4B类和图7，发布为支持信息在PNAS网站上），MSCs在脾脏和血液中积累（分别占总细胞的22.1±6.5%和60±2.5%），DNA疫苗不再有效。与之前的模型一样，口服NCX 4016（而非NCX 4017）恢复了疫苗效力，延长了接种小鼠的存活时间，其中56%的小鼠肿瘤治愈(图4B类). 这些治愈的小鼠在初始DNA疫苗接种70天后拒绝了N2C细胞的第二次攻击，但没有拒绝无关的CT26细胞，这表明存在肿瘤特异性记忆反应（图。​（图4B类4B类和7）。

讨论

不同的策略被用来纠正髓系抑制因子诱导T淋巴细胞的免疫功能障碍(7,29,30)但没有一种药物能够恢复肿瘤宿主对肿瘤相关抗原的免疫反应性。在本研究中，我们证明，通过药物干预MSCs抑制T淋巴细胞功能的途径，可以揭示对肿瘤抗原的免疫反应，并增强主动免疫治疗的疗效。NO阿司匹林是一类免疫调节剂的原型，它不像传统佐剂那样通过促进T淋巴细胞启动而起作用，而是通过中和抑制肿瘤宿主T淋巴细胞膨胀的负信号而起作用。据我们所知，没有其他单分子具有这种性质体内.

我们的实验中使用了两种NO-氧化阿司匹林衍生物：NCX 4060和NCX 4016，它们是间隔物上带有NO-氧化基团的位置异构体。将这些化合物的活性与对照药物（包括NO供体和NCX 4017）的活性进行了比较，NCX 4016是一种不含NO-氧化基的类似物。NO阿司匹林的主要活性是抑制脾脏和肿瘤相关骨髓细胞中的ARG和NOS活性。先前证实NO阿司匹林对NOS活性和表达的反馈抑制(21)并且，正如预期的那样，完全取决于NO捐赠，因为在用对照NCX 4017治疗后没有观察到NO捐赠。相反，ARG抑制是由NO-lacking部分NCX 4017执行的，该部分由阿司匹林和芳香间隔物组成。当将NCX 4016和4017分子添加到IC的细胞裂解液中时，这两种分子都降低了ARG活性₅₀给荷瘤小鼠的剂量是给药剂量的10倍以上（数据未显示），剂量过高，无法推测体内NO阿司匹林水杨酸部分的直接活性。水杨酸盐更有可能通过抑制细胞因子（如IL-4和IL-13）触发的细胞内信号转导器和转录激活物6介导的信号间接起作用，这些细胞因子是髓系细胞中有效的ARG诱导剂(7,31–34).

我们的研究结果表明，抑制这两种酶对NO阿司匹林的药理作用至关重要。MSC中ARG1或NOS2的激活在不同的肿瘤模型中显示出抑制作用：ARG1耗竭我-局部微环境中的精氨酸导致T淋巴细胞CD3 zeta链丢失及其抗原识别后的功能瘫痪(15)而NOS2产生的NO通过阻止细胞内信号蛋白信号转导子和转录激活子5、Akt和细胞外信号调节激酶的磷酸化，阻断T淋巴细胞IL-2受体的信号传导(12). 然而，这些酶也有协同作用。细胞溶质耗尽我-ARG1的精氨酸含量触发NOS2还原酶域产生超氧物，最终导致形成过氧亚硝酸盐，这是一种高活性氧化剂，可使硝酸蛋白与酪氨酸结合，并破坏包括T淋巴细胞在内的不同生物靶点(17,35). 研究表明，NCX 4016而非NCX 4017可降低肿瘤内硝基酪氨酸的含量，进一步支持过氧化亚硝酸盐主要由肿瘤浸润髓样细胞中ARG1和NOS2的联合活性生成的观点(图2B类).

考虑到亚硝基化合物的极端多效性效应，可以假设其他作用机制。例如，已知NO非甾体抗炎药可抑制中性粒细胞对趋化因子的反应而粘附在血管内皮上(36); 这可能解释了口服NO阿司匹林的小鼠肿瘤部位髓样细胞流量减少的原因（图6）。非甾体抗炎药，尤其是NO阿司匹林在几种癌细胞系中也具有有趣的抗增殖/促凋亡活性(22,37)，在某些模型中体内化学致癌(38)或者是自发的，比如转基因空气污染指数^分钟/+老鼠(39). NO阿司匹林是一种非常有效的血管平滑肌细胞增殖抑制剂(40)因此，从理论上讲，可能会减少肿瘤生长的血液供应。然而，必须指出的是，在我们的实验中，口服NO阿司匹林对我们使用的所有可移植肿瘤的生长影响很小（图。​（图445），而它完全缓解了肿瘤引起的免疫功能障碍。此外，用CD31染色计数经NCX 4016治疗的小鼠的内皮细胞，与未经治疗的小鼠相比没有任何差异（分别为87±13和80±6个细胞，未经治疗和NCX 4015；×400视野；0.180 mm²每字段），表明依赖于生长肿瘤释放的因子的新生血管生成没有改变。最后，尽管我们观察到肿瘤浸润的间充质干细胞减少，但我们没有检测到脾脏间充质干细胞数量的任何变化，脾脏间充质干细胞是全身免疫抑制的原因。所有这些发现清楚地表明，NO阿司匹林的辅助作用与直接抗肿瘤活性无关。

在本研究中，我们在两个肿瘤模型中证明了NO阿司匹林的佐剂活性，以证明其在治疗小或大肿瘤时的活性，无论是否进行全身MSC扩增。在第一种模型（CT26结肠癌）中，DNA疫苗诱导的反应微弱，不足以治愈已建立的肿瘤，但可能对有限的肿瘤负担有用(图4A类). 在第二种模型中，N2C乳腺癌允许皮下生长一段时间，这导致血液和脾脏中MSCs的系统性积累，并损害同种异体反应性T淋巴细胞反应（数据未显示）。在这个模型中，肿瘤抗原诱导了一种强大的免疫反应，这种免疫反应对患有小肿瘤的小鼠有治疗作用，但在晚期与弥漫性疾病同时发生时不再有效(图4B类). 这种情况在许多人类临床试验中很常见，在这些试验中，患者进入转移性疾病的免疫治疗方案。

我们的结果与癌症患者直接相关；事实上，NO阿司匹林异构体NCX 4016实际上正处于外周血管疾病的临床关键II期发展阶段，并且在临床试验中已经证明其比阿司匹灵更安全(41)其中大量志愿者/患者接受了治疗，没有出现重大副作用。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：P.Z.和V.B.设计的研究；C.D.S.、P.S.、I.M.、L.D.、C.M.和M.I.进行研究；C.D.S.、P.S.、PDS.、M.P.C.、P.M.、P.Z.和V.B.分析数据；M.B.、P.D.S.和C.G.贡献了新的试剂/分析工具；C.D.S.、M.P.C.、P.M.和V.B.撰写了论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：ARG，精氨酸酶；骨髓抑制细胞；TET、L^d日H-2四聚体；MLR，混合白细胞反应；一氧化氮合酶；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；我-NMMA、，N个^克-一甲基-我-精氨酸；我-诺夫，我-去甲缬氨酸。

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