跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
BMC细胞生物学。2005; 6: 8.
2005年2月17日在线发布。 doi（操作界面）：10.1186/1471-2121-6-8
预防性维修识别码：项目编号C553973
PMID：15717924

纤维连接蛋白和玻璃体凝集素上新的肝细胞生长因子（HGF）结合域协调内皮细胞中不同且扩增的Met-整合素诱导的信号通路

萨勒曼·拉赫曼,通讯作者#1 亚丁·帕特尔,#1 杰奎琳·默里,2 柯蒂·五·帕特尔,1 鲁西卡·苏马提帕拉,1 索布尔,2和Error S Wijelath公司#2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

成年生活中新生血管的生长除了需要循环内皮祖细胞的招募和分化外，还需要从已有血管开始内皮细胞迁移和增殖。生长因子和细胞外基质发出的信号在调节这些过程中很重要。

结果

在这里，我们报道了纤维连接蛋白（FN）和玻璃体凝集素（VN）调节内皮细胞对HGF（分散因子）的反应，HGF是一种重要的促血管生成介质。在FN和VN上都发现了新的HGF结合位点，它们产生具有增强生物活性的分子复合物，并且在脱颗粒血小板悬浮液的上清液中发现了这些结合位点，这些上清液与HGF的释放和形成有关体内在没有与ECM糖蛋白共同刺激的情况下，HGF不能促进内皮细胞迁移，但保留了利用Map激酶途径诱导增殖反应的能力。通过促进Met-Integrin协会，HGF-FN和HGF-VN复合物通过激活涉及Ras依赖机制的PI-3激酶途径来协调和增强内皮细胞迁移，而Ras依赖和减弱的迁移反应则通过与HGF和非结合伙伴ECM糖蛋白（如胶原蛋白-1）共同刺激细胞来促进。

结论

这些研究确定了内皮细胞中HGF信号转导的新机制和途径，涉及Met和整合素之间以Ras依赖的方式合作。这些发现对健康和疾病中新生血管的调节都有意义。

背景

成人血管的生成和修复需要通过多种血管活性物质（包括生长因子、细胞因子和细胞外基质（ECM））的协同作用来调节内皮细胞的存活、迁移、增殖及其与血统承诺祖细胞的分化[1-4]. 阐明这些信号的分子介质及其作用机制对于理解新血管发育和维持的精细调控至关重要。

越来越多的证据表明，生长因子和ECM在包括血管生成和产后血运重建在内的几个生物过程中密切协作。研究表明，细胞对血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和表皮生长因子（EGF）等生长因子的反应通过与特定ECM糖蛋白的整合素连接而增强[5-8]. 在之前的一份报告中，我们发现VEGF诱导的内皮细胞迁移被纤维连接蛋白（FN）增强[9]. 我们还提供了证据，证明VEGF/VEGFR-2通路与整合素α5β1通过一种涉及整合素α促进的机制5β1-VEGFR-2信号部分由VEGF-FN复合物的受体连接产生。这些事件促进了与迁移反应耦合的Erk激酶的持续活性。最近，我们提供的数据表明，FN显著增强了VEGF介导的CD34迁移+细胞及其向内皮细胞的分化[10]. 除了VEGF途径外，在体外研究强调了肝细胞生长因子（HGF）作为促血管生成介质的重要性。HGF，也称为散射因子，在肿瘤发生中具有公认的作用，但可能是新生血管形成的重要介质，因为研究表明HGF诱导内皮细胞中VEGF的表达在体外HGF与VEGF协同促进胶原基质中毛细血管的组装[11,12]. 此外，与单独使用的两种生长因子相比，联合使用HGF和VEGF也可以提高大鼠角膜的新生血管生成[11]. 最近一项对大量患者（1090名患者，CAPTURE试验）的研究进一步强调了HGF作为促血管生成介质的重要性急性冠脉综合征患者的血清HGF水平是患者预后的积极指标，与事件发生率显著降低和靶血管侧支化增加相关[13]. 虽然HGF的促血管生成作用已知，但HGF对血管细胞作用的详细机制，包括细胞内介质的身份，仍不清楚。

在本研究中，我们表明HGF与FN和VN形成一种特殊的物理复合物，这些复合物存在于脱颗粒血小板悬液中，可能起到某种作用体内值得注意的是，我们发现HGF-FN和HGF-VN分子复合物利用Ras诱导了独特且增强的细胞内信号，从而突出了生长因子受体酪氨酸激酶和整合素协同促进促血管生成反应的重要机制。

结果

FN和VN上新的HGF结合域的鉴定

我们最近在FN上发现了VEGF的结合域，它在促进VEGF活性方面发挥了重要作用[9]. 由于HGF也是一种重要的血管生成因子，因此设计了实验来确定HGF是否具有特定的ECM结合伙伴。使用固相分析，我们测量了125I标记HGF，用于固定在塑料孔上的各种ECM分子。如图所示。​图1A，1安培,125I标记的HGF与FN和VN特异结合，与胶原蛋白-1或层粘连蛋白有残留结合。使用固定在聚苯乙烯微孔上的纯化FN蛋白水解酶片段进行进一步实验，以定位FN分子上的HGF结合位点。在这些实验中125I标记的HGF与70kDa N末端片段和40kDa C末端片段结合。未观察到与含有内部细胞结合域的120kDa片段的显著结合（图。​（图1B）。1B年). 为了进一步分析HGF和FN之间的关联，通过表面等离子体共振分析（SPR）实时测量HGF与FN片段的相互作用。如图所示。​图1C1摄氏度&一维，HGF与固定在传感器芯片上的70kDa N末端FN片段结合，以特定和饱和的方式与K结合d日对于单场地模型，约为300±93 nM。图中所示的数据。​图1D一维可以应用于显示K的等概率双站点模型d日高亲和力位点和低亲和力位点的值分别为15 nM±2 nM和4μM。SPR无法直接测量HGF与40kDa片段的结合，因为在传感器芯片上固定40kDA片段似乎掩盖了HGF结合位点（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-1.jpg

FN和VN上HGF结合域的鉴定以及血小板上清液中HGF-FN和HGF-VN复合物的存在。面板A-将涂有各种基质蛋白或BSA（10μg/ml）的塑料孔与125I标记HGF至平衡，然后洗涤并在γ计数器中计数。面板B-塑料孔涂有FN和FN衍生的蛋白水解片段或BSA。125在这些孔中培养I-标记的HGF，以平衡结合，清洗并使用γ计数器测定结合的HGF-水平。面板C&D类-通过SPR实时将HGF与FN 70kDa片段结合。面板C-HGF浓度增加的实时结合等温线（0，16.5，31.25，62.5，125，188，250，315，375，500 nM），结合和解离阶段，用于单个代表性实验，箭头指示注射开始和结束。面板D-将面板C的数据绘制为HGF浓度（30–500 nM）的函数。插图显示了通过Scatchard方法分析的数据，该方法显示了一个带有K的单一结合位点dapp公司=300毫微米。这些数据也同样适用于双站点模型（详见正文）。n=3。面板E-血小板悬液（20.0×108/ml）在室温下用生理盐水（-）或1 U/ml凝血酶（+）刺激5分钟，以允许脱颗粒。通过离心（100000×g）清除细胞和膜物质，用FN单克隆抗体或同型匹配的对照试剂（对照IgG）免疫沉淀上清液。免疫复合物通过SDS-PAGE和免疫印迹探针与HGF（Santa Cruz）抗体进行分析。将印迹剥离并用FN抗体进行再验证，以确认初级免疫沉淀步骤的特异性。面板F-从凝血酶刺激的血小板中提取的上清液用对FN、VN或同型匹配的对照试剂具有特异性的抗体进行免疫沉淀。如图E所示，对免疫复合物进行了分析。下表显示了相同的印迹剥离，并用VN单克隆抗体进行了重新免疫，以确认初步沉淀。通过化学发光显影印迹。所示数据是重复三次实验的典型斑点。

血小板释放与FN和VN复合的HGF

确定HGF-FN和HGF-VN分子复合物是否发生体内我们检测了富含生长因子的血小板中是否存在这些复合物。用凝血酶（1 U/ml）刺激洗涤的人血小板悬液以促进脱颗粒，并用针对FN或VN的抗体免疫沉淀衍生上清液。分析产生的免疫复合物以共同沉淀HGF（图。​（图1E1E级&1楼). 凝血酶刺激的血小板上清液中FN的免疫沉淀导致HGF的显著共沉淀（图。​（图1E）。1E级). 相反，当实验中使用同型匹配的对照抗体时，从未刺激的血小板上清液或从凝血酶刺激的血小板上清液获得的样品中观察到最低水平的HGF。用FN抗体进行相同的印迹检测，证实FN的初级沉淀是HGF共沉淀的原因（图。​（图1E，1E级，下面板）。在平行实验中，VN的免疫沉淀也共同沉淀HGF，其程度与FN相似，甚至更大（图。​（图1F）。1楼). 这些实验表明，HGF从血小板中释放出来，并以可溶性分子复合物的形式与FN和VN结合，证实了配体结合研究的结果在体外.

HGF诱导的内皮细胞迁移依赖于与ECM的共同刺激

接下来，我们试图确定内皮细胞对HGF的反应是否可以通过其ECM结合伙伴进行调节。在细胞迁移分析中，人类微血管内皮细胞（HMVEC）单独或与固定浓度的FN、VN或胶原蛋白-1结合，与最佳浓度的HGF孵育（图。​（图2A）。2安培). 值得注意的是，在没有ECM的情况下，用HGF（10 ng/ml）刺激细胞时，很少或没有观察到内皮细胞迁移超过基础水平（对照）。在胶原-1（非HGF结合ECM）存在的情况下，观察到内皮细胞对HGF的中度迁移反应，其比基础水平高出不到2倍。当HGF与FN或VN联合用药时，内皮细胞迁移显著增强4-5倍。由于HGF刺激的内皮细胞与ECM糖蛋白包被的转染孔同样粘附良好，因此这些ECM糖蛋白存在时的迁移量差异与转染孔过滤器上不同程度的细胞粘附无关（图。​（图2B）。2B型). HGF的迁移反应是剂量反应性的，在10–20 ng/ml的浓度下观察到最大反应（数据未显示）。此外，当在没有HGF的情况下用这些ECM分子刺激HMVEC时，观察到可忽略的迁移反应，这与我们之前的报告一致（数据未显示，参考9）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-2.jpg

ECM分子对HGF诱导的内皮细胞迁移的影响。面板A-染色HMVEC悬浮液（9×104/在改良的Boyden小室试验中，在存在或不存在ECM分子、FN或VN或胶原蛋白-1的情况下，用HGF（10 ng/ml）处理。在3小时时测量细胞迁移。数据表示为相对迁移，迁移响应表示为在无刺激的情况下与基础迁移的比率。面板B-测定了细胞对涂有聚赖氨酸（PLL）或各种ECM糖蛋白的Fluorblok transwell过滤器的粘附水平。染色HMVEC（105细胞）用HGF（10 ng/ml）处理30分钟，然后将其应用于横孔的上腔。在广泛清洗后，使用荧光板阅读器测定粘附细胞的数量。整合素在HGF和FN刺激的细胞中介导迁移反应的作用和特性（C组）和HGF与VN（D组）通过用具有整合素α特异性的抗整合素单克隆试剂（10μg/ml）预处理HMVEC悬浮液来证明5β1（JBS5），α五β三（LM609）和α五β5（LM142）在室温下放置30分钟，然后将其应用于上横向套管室。数据以荧光单位表示为特定迁移反应，从总迁移反应中减去基本迁移反应。（n=2）。

为了进一步表征整合素参与观察到的迁移反应的程度和特性，我们研究了在HGF-ECM刺激之前用特定整合素抗体阻断HMVEC上整合素受体的后果。针对整合素α的抗体5β1完全抑制HGF-FN诱导的内皮细胞迁移（图。​（图2C）。2摄氏度). 相反，对αv亚单位（LM142）具有特异性的抗体对内皮细胞迁移没有抑制作用。然而，α的抗体五β三整合素（LM609）确实抑制内皮细胞向HGF-FN迁移20%，这表明整合素在介导HGF-FN反应中起辅助作用。当HGF-VN复合物诱导内皮细胞迁移时，整合素依赖性如预期发生改变（图。​（图2D）。二维). 在这些条件下，内皮细胞迁移主要依赖于αv-整合素介导迁移信号，并明显涉及整合素α5β1（约30%）。后一种效应可能是整合素信号串扰（转导整合素调节）的结果，如前所述[14,15]. 这些实验表明，对于HMVEC，HGF诱导的细胞迁移依赖于ECM分子对整合素的连接。

Met与α相关五β三和α5β1整合素

以前的工作[5-7,9]已经证明，生长因子受体酪氨酸激酶和整合素的物理结合促进了增强的细胞反应。因此，我们推测，本研究中HGF-FN和HGF-VN诱导的细胞迁移升高可能是由于一种信号机制，涉及Met和内皮细胞上整合素之间的物理联系。如图所示。​图3A，3A级，来源于暴露于胶原-1、FN或VN的样品的内皮细胞裂解物，在存在HGF的情况下，当与整合素α的抗体免疫沉淀时2β1, α5β1和α五β三分别主要与整合素α共沉淀Met5β1和α五β三相反，Met与整合素α共沉淀2β1对HGF和胶原蛋白-1刺激的细胞产生的裂解物来说是最小的。用HGF和ECM分子的不同组合处理细胞，不会改变这些样品中Met的表达水平（图。​（图3A3A级下部面板）不考虑Met共沉淀水平的差异是由于其抗原表达水平的差异造成的可能性。在没有HGF的情况下，Met与整合素α共沉淀5β1和α五β三尽管存在ECM糖蛋白，但最小，表明整合素与其同源配体的连接不足以诱导与Met的关联。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-3.jpg

Met与整合素的结合由HGF-FN和HGF-VN复合物驱动。面板A-HMVEC（1×106/ml）接种到胶原蛋白-1、FN或VN涂层塑料孔上，并在室温下用生理盐水或HGF（10 ng/ml）刺激60分钟。对细胞进行裂解，并用整合素α抗体对相应的裂解产物（500μg蛋白质）进行免疫沉淀2β1（车道1和4），α五β三（车道2和5）和α5β1（3号和6号车道）。免疫复合物通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析，抗Met抗体使用化学发光检测（顶面板）。底部面板显示了通过SDS-PAGE（40μg/lane）分析后相应细胞裂解液中Met的抗原水平，在实验期间，使用Met抗体进行的Western blotting探针基本上没有改变。面板B-HMVEC（5×106)在室温下的指定时间段用HGF或HGF-FN或HGF-VN复合物刺激。用磷酸酪氨酸Met多克隆抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀，并使用Met单克隆抗体通过SDS-PAGE和Western blotting分析免疫复合物。用化学发光法检测Met抗原。面板C-HMVEC（5×106)在室温下用HGF或HGF-FN或HGF-VN复合物刺激15分钟。用整合素α单克隆抗体对细胞进行裂解并对裂解产物进行免疫沉淀5β1和α五β三通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析免疫复合物和Met多克隆抗体。

为了阐明Met激活在Met-整合素信号复合物形成中的作用，在不含ECM糖蛋白的情况下用HGF处理内皮细胞，用HGF-FN和HGF-VN复合物处理内皮细胞并研究Met-酪氨酸磷酸化的动力学（图。​（图3B）。3B公司). 这些实验表明，在没有ECM糖蛋白的情况下，HGF可以瞬时激活Met，在15分钟时出现强信号，但在1小时时消失。相反，用HGF-FN和HGF-VN刺激的细胞在15分钟时显示出Met的强烈激活，这种激活在1小时时持续，并且在刺激后2小时时明显，尽管减少了。还评估来源于刺激15分钟的样品的细胞裂解物是否存在Met整合素复合物。如图所示。​图3C，3C公司HGF在缺乏FN或VN的情况下并没有促进Met与整合素α5β1或αvβ3的显著关联。然而，用HGF-VN和HGF-FN处理15分钟的细胞含有大量Met，与这些整合素有物理联系。这些研究表明，HGF激活Met不足以促进与整合素的物理联系。

FN和VN上的HGF结合域促进细胞内信号增强

接下来，我们研究了Met与整合素的结合是否调节了HGF/ECM诱导的细胞内信号传导，重点是ERK和PI-3激酶途径。Erk-1/2对HGF单独或HGF/ECM组合的磷酸化动力学分析显示了不同的激活模式（图。​（图4A）。4A级). 在单独使用HGF的情况下，Erk 1/2磷酸化显示出动力学，在刺激后60分钟具有峰值信号，并且在120分钟时显著降低，尽管磷酸化仍然明显。当细胞被HGF和胶原蛋白-1（非HGF结合ECM）刺激时，可以观察到明显的激活特征，Erk 1/2水平在30分钟达到峰值，在120分钟后恢复到接近基础的磷酸化水平。然而，用HGF-FN或HGF-VN复合物刺激内皮细胞可促进Erk 1/2的快速但持续的磷酸化，在刺激后120分钟达到接近最大水平。PI-3激酶途径的激活分析通过测定血清中Akt/PKB的磷酸化状态进行评估473（图。​（图4B）。4B类). 有趣的是，在这些样品中观察到Akt磷酸化的不同水平和动力学。当在没有ECM共同刺激的情况下用HGF刺激内皮细胞时，观察到Akt的磷酸化几乎不高于基础水平。然而，当用HGF加胶原蛋白-1处理细胞时，Akt磷酸化在5分钟时迅速检测到，在30分钟时达到峰值，并显著降低120分钟。相比之下，用HGF-FN或HGF-VN复合物处理的细胞，Akt磷酸化动力学似乎反映了Erk 1/2磷酸化动力学，暗示了这两种途径的共同调控机制。与Erk 1/2磷酸化一样，Akt磷酸化在刺激后30分钟达到峰值，即使在120分钟也能保持这种激活水平。值得注意的是，这些样品中的Akt磷酸化水平提高了约3倍，（通过密度测定法评估）与HGF加胶原蛋白-1刺激的细胞中观察到的水平相比（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-4.jpg

HGF-FN和HGF-VN复合物通过PI3激酶途径增加HMVEC迁移。面板A-HMVEC悬浮液（1×106/ml）在不存在ECM分子或存在胶原蛋白-1、FN或VN（2μg/ml）的情况下，在室温下用HGF（10 ng/ml）刺激不同的时间间隔（2–120分钟）。通过快速离心和细胞颗粒裂解停止反应。用SDS-PAGE和Western blotting探针分析细胞裂解物样品，并用对磷酸化Erk 1/2具有特异性的抗体进行分析（顶面板）。用Erk 2抗体（底部面板）重制印迹。面板B-A组的样品也用一种对磷酸化Akt（顶面板）具有特异性的抗体同时进行了检测，这些印迹被剥离并用Akt抗体重新进行了验证。通过化学发光进行可视化。面板C&D类-抑制剂对HMVEC迁移的影响，分别对应于HGF-FN和HGF-VN。该数据是一个使用三份样品的代表性实验，实验进行了三次，得出了基本相似的结果。

HGF/ECM诱导的内皮细胞迁移与PI-3激酶途径耦合

为了确定与迁移反应耦合的细胞内途径，用MEK和PI-激酶的特异性抑制剂处理HMVEC。在细胞迁移实验中，LY294002而不是U1026抑制HGF-FN诱导的内皮细胞迁移（图。4摄氏度)和HGF-VN（图。4天)，清楚地表明PI-3激酶途径主要与迁移反应耦合，而不是Map激酶途径。还测试了潜在下游效应物的其他抑制剂。用PP1、U73122和piceatannol预处理的HGF-FN刺激的细胞显示出最大的迁移反应，表明Src、PLCβ和Syk不是迁移信号的成分（数据未显示）。

HGF诱导的内皮细胞增殖与Erk通路耦合

还研究了ECM分子与HGF联合给药对内皮细胞增殖的影响。与细胞迁移相反，在没有ECM分子的情况下，HGF诱导了显著的增殖反应（图。​（图5A）。5A级). 然而，在FN或VN存在的情况下，与HGF单独或与胶原蛋白-1联合使用相比，HGF诱导的内皮细胞增殖增强。与迁移反应一样，内皮细胞增殖对HGF具有剂量反应，在浓度为10-20 ng/ml时观察到最大反应（数据未显示）。然后使用化学抑制剂确定HGF诱导内皮细胞增殖的信号通路。在这些研究中，MEK抑制剂U1026显著损害HGF诱导的内皮增殖（50-80%的抑制作用），无论是否与ECM分子共同刺激。这表明，与上述PI-3激酶依赖的迁移不同，Erk通路在介导HGF诱导的内皮细胞增殖中起着重要作用。虽然LY294002和FPT-III都阻止HMVEC增殖，但这似乎是由于凋亡（数据未显示）。这一观察结果与PI-3激酶在促进细胞存活方面的作用以及Ras在调节这些细胞中PI-3激酶方面的作用是一致的[16,17].

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-5.jpg

HGF诱导的HMVEC增殖需要Map激酶途径.面板A-将MCDB-131培养基中的HMVEC镀在密度为2.5×10的聚-D-赖氨酸涂层48-well板上三在存在或不存在ECM分子FN、VN或胶原蛋白-1的情况下，用HGF（10 ng/ml）刺激。用非补充培养基处理的细胞测量基底细胞增殖。使用CyQuant试剂在刺激后48小时对细胞数量进行量化。数据显示为HGF-FN和HGF-VN处理的样品与单独使用HGF处理的细胞相比，其增殖显著增加的细胞数，通过单向方差分析确定（p<0.05）n=3。面板B-HMVEC被镀到聚-D-赖氨酸涂层的微孔上（1×104/well）在补充培养基中过夜。然后用含有0.1%FBS和HGF（20 ng/ml）的培养基培养细胞，培养基中存在或不存在ECM蛋白（10μg/ml），如图所示，不含抑制剂（白色条）或MEK抑制剂U1026（10μM，黑色条）。使用CyQuant试剂在48小时后对细胞数量进行量化。

Ras是HGF-FN和HGF-VN复合物刺激的细胞中Erk和PI-3激酶途径的特异上游调节器

上述数据表明，HGF诱导的内皮细胞迁移和增殖分别由PI-3激酶和Erk途径介导。接下来我们研究了Ras在调节HGF-FN和HGF-VN复合物诱导的这两条通路中的作用。由于Ras是p85 PI-3激酶和Erk的一个有充分记录的调节器，也是Met和整合素受体的下游效应器，因此我们通过测量在有无ECM分子的情况下用HGF刺激内皮细胞后GTP-负载Ras的比较水平来评估Ras的激活状态（图。​（图6A6A级&6亿). 仅用HGF刺激的内皮细胞在刺激后60分钟显示出高水平的GTP-Ras，即使在120分钟也持续存在（图。​（图6A）。6A级). 相比之下，与HGF和胶原蛋白-1共同刺激的细胞在刺激后60分钟显示Ras激活，但激活程度明显较低（与单独使用HGF相比约为50%。​图6B），6亿)在HGF-FN和HGF-VN共同刺激下，GTP-Ras水平比用HGF-胶原蛋白-1共同刺激细胞时高出两倍以上（图。​（图6B）。6亿). 值得注意的是，GTP-Ras水平在120分钟时保持不变，这与MAP激酶和PI-3激酶途径的激活谱观察结果一致。这些研究表明，在HGF-FN和HGF-VN复合物刺激的细胞中抑制Ras会表现出降低的迁移反应。为了验证这一假设，用膜透性法尼基转移酶抑制剂FPT-III处理细胞，该抑制剂在法尼基化缺失的情况下，由于膜定位丢失而抑制Ras功能。在用HGF-FN刺激后，与未刺激细胞的基础水平相比，经FPT-III（100μM）处理的内皮细胞在HGF-FF刺激后Ras的激活很少（图。​（图7A）。第7页). 相比之下，香叶基香叶酰基转移酶抑制剂GGTI（2μM）预处理细胞对HGF-FN诱导的Ras活化几乎没有抑制作用。在内皮细胞迁移试验中测试了这些抑制剂的作用。与用GGTI预处理的细胞相比，用FPT-III预处理的内皮细胞在用HGF-FN和HGF-VN复合物刺激时分别显示出50%和73%的细胞迁移显著减少（图。​（图7B）。7亿). 相反，FPT-III对HGF加胶原-1诱导的迁移几乎没有抑制作用，这表明Ras在这种刺激的迁移信号调节中没有显著作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-6.jpg

HGF-FN和HGF-VN复合物增强和持续激活Ras面板A-动力学GTP-Ras下拉分析。HMVEC悬浮液（3×106/如图所示，在无ECM分子（2μg/ml）和有ECM分子（10 ng/ml）的情况下，用HGF（10 ng/ml）在室温下刺激5、60和120分钟。Lane Rest.表示GTP Ras的静息（未刺激）水平。细胞在冷MLB缓冲液中造粒并溶解（参见方法）。将无细胞裂解物样品与RBD-Sepharose孵育，然后通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析Ras。使用柯达成像站通过化学发光进行可视化。面板B-通过使用ImageQuant软件（Kodak）进行密度分析，对面板A中显示的凝胶在60分钟时间点的GTP-Ras水平进行量化。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-7.jpg

HGF-FN和HGF-VN诱导的HMVEC迁移依赖于Ras。面板A-GTP-Ras下拉分析显示FPT III（100μM）和GGTI（2μM）抑制剂对GTP-Ras水平的影响。HMVEC悬浮液（3×106/ml）在室温下用FPT III和GGTI抑制剂预处理45分钟，然后在室温下使用HGF-FN复合物刺激60分钟。样品分析如图2图例所示。面板B-Ras抑制对细胞迁移的影响。Calcein M负载HMVEC悬浮液（1×105/ml）在应用于transwell过滤器的顶部腔室之前，用上述抑制剂进行预处理。如图所示，用HGF加ECM蛋白刺激细胞（放置在底部室中）。在刺激后3小时使用荧光板阅读器测量细胞迁移。数据显示为相对迁移，是两个独立实验的组合数据，样本井一式三份。

为了进一步表征Ras在调节内皮细胞对HGF/ECM反应中的作用，研究了FPT-III抑制剂对Erk 1/2和Akt磷酸化水平的影响。在仅用HGF刺激的细胞中，Erk 1/2被FPT-III抑制剂激活并显著抑制，而GGTI在较小程度上抑制了Erk 1/2（图。​（图8A）。8安). HGF-FN刺激的细胞也观察到类似的抑制曲线（图。​（图8A）8安)和HGF-VN（未显示）。相反，当用FPT-III抑制剂预处理时，HGF和胶原蛋白-1刺激的细胞没有表现出Erk 1/2磷酸化水平的明显降低，表明Ras很少参与Erk 1/2的激活。这些样品还评估了Akt磷酸化作为PI-3激酶活性的指示。与我们的观察结果一致，在没有ECM的情况下用HGF刺激HMVEC并没有导致Akt的显著激活（图。​（图8B）。8B类). 然而，在存在胶原蛋白的情况下，观察到Akt活化，但这不受FPT-III预处理细胞的影响，这意味着Ras不是PI-3激酶活化的上游调节器。相比之下，HGF-FN复合物促进了Akt磷酸化的3倍增强，并且用FPT-III处理细胞后，这被抑制了约50%（图。​（图8B）。8B类). 这些观察结果表明，抑制Ras活化可降低HGF-FN复合物刺激的细胞而非HGF和胶原蛋白-1刺激的细胞的PI-3激酶活化。因此，数据可以预测，当用HGF-FN和HGF-VN复合物刺激HMVEC时，特定的整合素被用来招募Ras，而Ras反过来又会调节PI-3激酶的激活。为了验证这一假设，我们分别从HGF-FN和HGF与胶原-1刺激的细胞中免疫沉淀整合素α5β1和α2β1，并分析这些整合素免疫复合物用于Ras的共沉淀。高水平的Ras与α5β1免疫复合物特异性相关，这似乎与HGF刺激无关。很少或没有Ras与整合素α2β1共沉淀（图。​（图8C8摄氏度).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-8.jpg

HGF-FN诱导的Map激酶和PI-3激酶途径的激活是Ras依赖性的面板A&B类-HMVEC悬浮液用缓冲液（无抑制剂）或抑制剂FPT III（100μM）预处理，并在室温下控制GGTI（2μM）45分钟，然后在室温下用不含ECM蛋白的HGF或HGF+胶原蛋白-1或HGF-FN复合物刺激60分钟。将细胞沉淀并在冰冷的裂解缓冲液中裂解。通过SDS-PAGE和Western blotting探针对样品进行磷酸化Erk 1/2（面板A）和磷酸化AKT（面板B）分析。通过图像分析软件测量的相对带强度被放置在每个带的上方，作为在不存在抑制剂的样品中获得的信号的比率。剥离印迹物，并用Erk 2和Akt抗体进行再验证，以确认载量相等。面板C-HMVEC悬浮液（5×106/ml）与FN或胶原蛋白在有或无HGF的情况下在室温下孵育60分钟。细胞在裂解缓冲液中成粒并裂解。用整合素α5β1和α2β1抗体对裂解产物进行免疫沉淀分析，用SDS-PAGE和免疫印迹探针对免疫复合物进行Ras抗体分析。通过化学发光进行可视化。

讨论

本报告的主要发现是，通过生长因子与ECM糖蛋白FN和VN之间形成分子复合物，HGF诱导的内皮细胞反应显著增强。HGF导致内皮细胞迁移，如果没有来自ECM的额外信号，则不会发生PI-3激酶偶联反应。然而，在缺乏ECM发出的信号的情况下，HGF诱导的内皮细胞增殖是明显的。这些观察结果使我们提出了HGF诱导内皮细胞反应机制的模型（图。​（图9）。9). 该模型表明，HGF单独通过其受体Met通过激活Ras-Erk激酶途径诱导内皮细胞增殖（图。​（图9A）。9安). 然而，该信号不足以促进显著的细胞迁移，对于这种迁移，通过特定整合素连接来自ECM的额外信号似乎是激活PI-3激酶途径所必需的（图。​（图9B9亿&9摄氏度). 独特的是，在用HGF-FN或HGF-VN复合物刺激的细胞中，促进Met与整合素的结合，Ras的募集和持续激活产生了增强的独特细胞内信号，可能同时激活p85 PI-3激酶和Raf（图。​（图9C）。9摄氏度). 这与HGF在胶原蛋白-1存在下诱导PI-3激酶途径激活的机制相反，胶原蛋白-1与Ras无关（图。​（图9B9亿).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为1471-2121-6-8-9.jpg

HGF诱导内皮细胞反应的机制。面板A-在没有ECM分子的情况下，HGF可以通过Met受体酪氨酸激酶激活Map激酶途径，从而导致增殖反应。面板B-HGF和与胶原蛋白的共同刺激通过一种未知的机制诱导Map激酶和PI-3激酶途径的激活，可能是通过整合素连接实现的，这与Ras无关。面板C-HGF-FN（以及类似的HGF-VN）复合物通过促进整合素与Met受体的结合促进增强细胞反应，从而导致Ras、Erk 1/2激酶和PI-3激酶的招募和增强激活，从而促进增殖和迁移反应的增强。

图中的模型。​图9C9摄氏度以下观察结果支持。HMVEC对HGF-FN和HGF-VN复合物的增强反应与以下观察结果一致：在这些细胞中，Ras、PI-3激酶（AKT磷酸化）和Erk 1/2磷酸化的活性持续存在，而在Ras和AKT的情况下，其活性是HGF和胶原蛋白-1刺激的细胞的2-3倍（图。​（图6）。6). 在存在结合和非结合ECM糖蛋白伙伴的情况下，内皮细胞与HGF共同激活所诱导的独特信号机制也得到了以下观察结果的支持：用Ras法尼基化抑制剂FPT III、，减少HGF-FN刺激的细胞中Erk 1/2和Akt激酶的磷酸化，而不是HGF加胶原蛋白-1刺激的细胞（图。​（图8A8安&8B类). 此外，Ras与整合素α共沉淀5β1来源于用HGF-FN复合物刺激但不用整合素α刺激的内皮细胞裂解物2β1来源于HGF和胶原蛋白-1刺激的细胞（图。​（图8C）。8摄氏度). 这些结果与Rodriquez-Viciana及其同事的开创性工作一致，他们证明Ras通过直接分子相互作用调节p85 PI-3激酶。众所周知，所有1型PI-3激酶的调节亚单位都包含一个与激活Ras（GTP-Ras）相关的Ras结合域[17-20]. 因此，我们的数据和模型表明，通过HGF-FN和HGF-VN复合物刺激内皮细胞，Ras和PI-3激酶持续激活，这与之前的工作一致，表明Ras是PI-3激酶的关键调节器。目前正在研究在我们的细胞系统中调节PI-3激酶的Ras亚型的身份。

本研究的结果支持并扩展了我们之前关于VEGF-FN分子复合物诱导内皮细胞迁移增强的观察[9]. 在该研究中，在FN上识别的VEGF结合域推动了VEGF-FN复合物的形成，在受体连接后促进了整合素α的结合5β1使用VEGFR-2。这种共受体激活导致Erk激酶活性的持续激活，从而促进增强的迁移反应。同样，本研究表明，HGF-FN和HGF-VN分子复合物诱导形成Met-整合素信号复合物，促进独特Ras依赖信号的转导。一些研究表明，整合素和生长因子受体酪氨酸激酶之间的合作在介导细胞反应中具有重要意义。例如，在VN存在下，成纤维细胞对PDGF-BB的反应增殖和迁移增强，并伴有α五β三PDGF-β受体整合素[5,7]. 此外，最近的研究表明，HGF与FN结合可延长GM克隆阳性细胞的存活时间[21]增强MTLn3乳腺癌细胞的粘附和运动[22]. 此外，整合素α五β三和α五β5通过对Erk激酶途径成分的差异调节，证明对分别介导FGF-2和VEGF介导的血管生成是必要的[23]. 然而，本研究扩展了这些观察结果，据我们所知，这是第一次描述生长因子-ECM分子复合物活性所采用的独特信号通路，而不是生长因子和ECM蛋白通过连接各自的受体独立发挥作用。在HGF-FN和HGF-VN复合物特异性激活的内皮细胞中，与在胶原蛋白-1存在下的HGF相对，Ras依赖性途径的鉴定意义重大，并与Met-整合素相关。虽然Met酪氨酸激酶和整合素之间相互作用的确切性质尚未阐明，但Ras在该系统中的作用对于PI-3激酶和Erk激酶途径的持续和增强激活似乎很重要。

与VEGF-FN分子复合物促进的迁移信号相反[9]HGF-FN和HGF-VN复合物在内皮细胞中诱导反应，其特征是PI-3激酶途径与细胞迁移紧密耦合。一些额外的促血管生成介质，如1-磷酸鞘氨醇和NO，或其反配体激活CD40和Eph B4受体，通过激活PI-3激酶途径促进内皮细胞迁移[24-28]. 此外，HGF本身被证明以PI-3激酶依赖的方式刺激平滑肌细胞迁移[29]. 然而，缺乏显著的迁移反应，加上本研究中观察到的Akt磷酸化缺失，表明在原代内皮细胞中，Met受体在没有来自ECM/整合素的协同信号的情况下无法激活PI-3激酶。考虑到Met已被证明通过Gab-1的募集和激活激活上皮细胞中的PI-3激酶，而Gab-1与p85亚单位直接相互作用，这一观察结果非常有趣[30]. 与我们对信号转导的整合素依赖性的观察一致，Trusolino等人表明，在癌细胞系中，Met诱导的信号因其与整合素α6β4的组成性关联而显著放大。有趣的是，在该系统中，作者表明整合素α4亚单位的作用独立于细胞外整合素连接，因为缺乏细胞外部分的截短α4结构可以介导HGF/Met反应和下游效应器的信号，前提是其招募适配器Shc的能力不受影响[31]. 相反，我们使用原代内皮细胞的研究表明，整合素连接对于通过PI-3激酶产生显著的迁移信号至关重要，对于HGF-FN和HGF-VN复合物，对于促进Met与整合素α的结合至关重要5β1和α五β三分别是。事实上，Met与整合素α5β1和αvβ3的结合依赖于Met和整合素通过连接其同源配体而被激活，因为单独HGF对Met的酪氨酸磷酸化不能诱导整合素的结合（图。​（图3C）。3C公司). 这些观察结果支持了信号传导机制的论点，该机制需要形成HGF-ECM分子复合物作为Met整合素结合和随后的信号放大的先决条件，如图所示。​图9C。9摄氏度然而，整合素细胞质域在招募Ras和Ras-binding伴侣中的重要性似乎反映了这些细胞系统之间HGF信号转导的共同机制。

结论

本研究结果证明了整合素与内皮细胞上生长因子受体酪氨酸激酶协作的重要机制，并预测FN和VN上的HGF结合域可能在促进伤口愈合和出生后新生血管形成方面发挥重要作用。为了支持这一论点，从脱颗粒血小板悬液的上清液中鉴定出HGF-FN和HGF-VN复合物，表明这些复合物确实存在体内并可能沉积在船只扰动或受伤的地方。这一观察结果与我们先前报告中血小板上清液中VEGF-FN分子复合物的鉴定相似[9]并提示HGF和VEGF可能协同作用体内事实上，最近的研究表明，HGF与VEGF协同作用，促进胶原基质中毛细血管的组装和大鼠角膜中的新生血管[11]. 此外，HGF积极调节VEGF的表达并下调血管生成抑制剂TSP-1，从而促进血管生成[32]. 值得注意的是，FN的HGF结合域位于与VEGF相同的蛋白水解片段中，即N末端70 kDa和C末端40 kDa片段。进一步研究VEGF和HGF在FN和VN上的结合域的精细定位和特征，将有助于破译这些重要促血管生成介质之间相互作用的机制。

方法

固相分析和表面等离子体共振分析（SPR）

ECM蛋白和FN肽购自Sigma和Gibco，并通过凝胶过滤和离子交换色谱进一步纯化。按照前面所述进行分析[9].125将结合缓冲液（含2%BSA的PBS）中的I-HGF（NEN）添加到微量平板中，并在室温（RT）下培养30分钟，然后清洗和计数，以确定结合放射性。如前所述，对BIAcore X（BIAcore Herts UK）进行SPR分析[9]. 将HGF（30–500 nM）注入CM5芯片上固定的FN 70 kDa片段，注入HEPES盐水（pH 7.4）中，并补充1 mM MgCl2，2 mM氯化钙2并记录了传感器图。该数据由ASSAY程序（英国Biosoft）进行分析，以确定EC50值和Kd日.

迁移和增殖分析

人皮肤微血管内皮细胞（HMVEC）保存在EBM-2生长培养基（Clonetics Corp）中。迁移研究基本上如前所述进行[9]使用制造商描述的Fluorblok transwell chambers（BD Bioscience）改良Boyden chambers分析法中的缺血清钙蛋白AM-载HMVEC。通过荧光测量检测细胞迁移（在下腔室内）。在4°C的温度下，用FN或VN或胶原蛋白-1（10μg/ml）涂敷过夜，并进行初步实验，以评估HGF和ECM蛋白的最佳剂量。在抗体抑制研究中，用聚L-赖氨酸（Sigma）覆盖跨阱室，以促进细胞粘附到过滤器上，而不是使用ECM糖蛋白粘附。HMVEC用α预处理五β三和α5β1整合素封闭抗体在室温下放置30分钟，然后将其应用于上transwell室。通过让HGF刺激的HMVEC粘附于转染孔（用ECM糖蛋白（10μg/ml）涂敷过夜，然后在基础培养基中的3.5 mg/ml BSA中培养1小时，然后用基础培养基进行大量洗涤，从而测定细胞对ECM涂层转染孔过滤器的粘附水平。使用荧光板阅读器测量剩余的细胞（测量上跨阱室中的荧光）。对于增殖实验，通过DNA荧光标记（CyQuant，Molecular Probes）测量细胞分裂。HMVEC被镀在聚-D-赖氨酸涂层的48-well板上，并在含有5%FBS的MCDB-131培养基中培养过夜。用PBS洗涤板后，内皮细胞在含有或不含有VN、FN或胶原蛋白-1（10μg/ml）的MCDB131培养基+0.1%FBS（10 ng/ml）中培养。培养48小时后，每24小时添加一次HGF/ECM。使用荧光平板阅读器对细胞增殖进行定量。

磷酸化分析和ras激活

使用针对Erk（Thr）的磷酸化特异性抗体（细胞信号技术）评估HMVEC的Erk1/2和Akt激活谱202/提尔204)和Akt（Ser473)分别通过Western blotting检测。这些研究是在悬浮细胞和粘附细胞群中进行的。细胞生长到80%的汇合处，在收获前将血清饥饿2小时。将细胞重悬于补充有浓度为1-5×10的0.1%BSA（重悬缓冲液）的无血清MCDB-131培养基（BioWhittaker）中6细胞/毫升。细胞悬液在室温下用添加2μg/ml胶原蛋白-1或FN或VN的10 ng/ml HGF激发2至120分钟。在4°C下通过离心收集细胞，并在10 mM Tris pH 7.4、145 mM NaCl中溶解，添加0.1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂。在抑制剂研究中，在室温下用HGF和ECM分子刺激HMVEC悬浮液60分钟之前，用抑制剂预处理缺血清HMVEC悬液45分钟。将细胞造粒，在不含BSA的冰镇再悬浮缓冲液中洗涤，并在含有1%（v/v）Triton X-100的裂解缓冲液中裂解。根据制造商的建议，使用针对磷酸特异性抗体的特定方案，通过Western印迹分析细胞裂解产物。沿着适当的标记区切割印迹，并用phopho-Erk1/2和Akt（Ser473)（细胞信号技术）。对于GTP-Ras下拉分析，用HGF和ECM分子刺激缺乏血清的HMVEC达到所需的时间点，将细胞旋转下来，并在不含BSA的冰镇再悬浮缓冲液中清洗。在MLB缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，1%Igepal CA-630，10%甘油，25 mM NaF，10 mM MgCl）中溶解细胞颗粒2将1 mM EDTA、1 mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物）和500μg细胞裂解液与10μl RBD-Sepharose（Upstate Biotechnology）悬浮液混合，在4°C下每次反应60分钟。在溶解之前，将Sepharose珠纺下来并在MLB中清洗，然后使用单克隆抗体通过Western blotting探针对Ras进行分析（Upstate Biotechnology）。对于Ras抑制研究，细胞预先与FPT-III（100μM）和GGTI（2μM）孵育（约40×IC50值）在室温下持续45分钟，然后用HGF和ECM刺激细胞60分钟。

Met-Integrin免疫沉淀

在无血清MCDB-131培养基（BioWhittaker）中添加0.1%BSA的人微血管内皮细胞（HMVEC）在室温下，在不含或含有HGF（50 ng/ml）的情况下，在胶原蛋白、FN和VN涂层的培养皿上培养15分钟至1小时。然后按照上述方法采集细胞[9]用α2β1（克隆JBS2），α5β1（克隆JBS5）和α五β三克隆（LM609）。通过SDS-PAGE和蛋白质转移分析后，用Met单克隆抗体（克隆DL-21，Upstate Biotechnology）检测印迹，并用化学发光法进行开发。对于甲基酪氨酸磷酸化分析，在室温下用HGF单独或HGF-FN和HGF-VN复合物刺激细胞15分钟到2小时的不同时间点。用多克隆抗磷Met抗体（Cell Signaling）免疫沉淀溶解样品，并用单克隆抗Met抗体通过SDS-PAGE和Western印迹分析免疫复合物（Upstate）。使用化学发光技术（Pierce）对Met进行可视化。

从血小板上清液中免疫沉淀FN-HGF和VN-HFF复合物

如前所述，从非刺激性和凝血酶刺激的洗涤血小板悬液中制备上清液[9]. 用FN或VN抗体（Chemicon）或同型匹配对照试剂（IgG）对上清进行免疫沉淀。在SDS-PAGE和免疫印迹后，通过化学发光显影用多克隆抗体（Santa Cruz）检测HGF。

缩写

HGF、肝细胞生长因子、FN纤维连接蛋白、VN玻璃体凝集素、Col-1、胶原蛋白-1、HMVEC、人微血管内皮细胞。

作者的贡献

SR、研究设计、HMVEC迁移研究、SPR配体结合分析、HMVEC信号研究、联合免疫沉淀研究（整合素-Ras）、原稿制备。ESW，研究设计，HMVEC增殖研究，固相配体结合研究，共免疫沉淀（整合素Met），手稿制备。YMP，研究设计，共沉淀研究（HGF-FN/VN）。JM、蛋白质纯化和制备、KVP、GTP-Ras下拉分析、RS、技术支持。理科硕士，研究设计。

致谢

SR和YP分别感谢Grifols UK和Centeon的赞助。这项研究的部分资金来自美国心脏协会对ESW的拨款

工具书类

  • Ausprunk DH，Folkman J.肿瘤血管生成期间预成型和新形成血管中内皮细胞的迁移和增殖。微血管研究。1977;14:53–65. doi:10.1016/0026-2862（77）90141-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Carmeliet P，Jain RK。癌症和其他疾病中的血管生成。自然。2000;407:249–257. doi:10.1038/35025220。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rafii S、Lyden D、Benezra R、Hattori K、Heissig B。血管和造血干细胞：抗血管生成治疗的新靶点？Nat Rev癌症。2002;2:826–835. doi:10.1038/nrc925。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Stupack DG，Cheresh DA。细胞外基质的凋亡线索：血管生成的调节器。癌基因。2003;22:9022–9029. doi:10.1038/sj.onc.1207110。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Schneller M、Vuori K、Ruoslahti E.Alphavbeta3整合素与激活的胰岛素和PDGFβ受体相关，并增强PDGF的生物活性。Embo J。1997;16:5600–5607. doi:10.1093/emboj/16.18.5600。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Soldi R、Mitola S、Strasly M、Defilippi P、Tarone G、Bussolino F。α-β3整合素在血管内皮生长因子受体-2激活中的作用。Embo J。1999;18:882–892. doi:10.1093/emboj/18.4.882。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Woodard AS、Garcia-Cardena G、Leong M、Madri JA、Sessa WC、Languino LR。alphavbeta3整合素和PDGF受体的协同活性增加了细胞迁移。细胞科学杂志。1998;111（第4部分）:469–478.[公共医学][谷歌学者]
  • Miyamoto S、Teramoto H、Gutkind JS、Yamada KM。整合素可与生长因子协作，以磷酸化受体酪氨酸激酶和MAP激酶激活：整合素聚集和受体占据的作用。细胞生物学杂志。1996;135:1633–1642. doi:10.1083/jcb.135.61633。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wijelath ES、Murray J、Rahman S、Patel Y、Ishida A、Strand K、Aziz S、Cardona C、Hammond WP、Savidge GF、Rafii S、Sobel M。纤维连接蛋白的新型血管内皮生长因子结合域增强了血管内皮生长素的生物活性。圆形Res。2002;91:25–31. doi:10.1161/01.RES.0000026420.22406.79。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wijelath ES、Rahman S、Murray J、Patel Y、Savidge G、Sobel M.纤维结合蛋白促进VEGF诱导的CD34细胞分化为内皮细胞。血管外科杂志。2004;39:655–660. doi:10.1016/j.jvs.2003.10.42。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Xin X，Yang S，Ingle G，Zlot C，Rangell L，Kowalski J，Schwall R，Ferrara N，Gerritsen ME。肝细胞生长因子增强血管内皮生长因子诱导的体内外血管生成。美国病理学杂志。2001;158：1111–1120。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Van Belle E，Witzenbichler B，Chen D，Silver M，Chang L，Schwall R，Isner JM。通过诱导血管内皮生长因子增强散射因子/肝细胞生长因子的血管生成作用：血管生成的旁分泌扩增的情况。循环。1998;97:381–390.[公共医学][谷歌学者]
  • Heeschen C、Dimmeler S、Hamm CW、Boersma E、Zeiher AM、Simoons ML。急性冠脉综合征患者血清血管生成生长因子水平的预后意义。循环。2003;107:524–530. doi:10.1161/01.CIR.0000048183.37648.1A。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Blystone SD、Slater SE、Williams MP、Crow MT、Brown EJ。整合素串扰的分子机制：alphavbeta3抑制钙/钙调素依赖性蛋白激酶II调节alpha5beta1功能。细胞生物学杂志。1999;145:889–897. doi:10.1083/jcb.145.4.889。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kim S、Harris M、Varner JA。整合素α5beta1和蛋白激酶A对整合素alpha-vbeta3介导的内皮细胞迁移和血管生成的调节。生物化学杂志。2000;275:33920–33928. doi:10.1074/jbc。M003668200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Gerber HP、McMurtrey A、Kowalski J、Yan M、Keyt BA、Dixit V、Ferrara N。血管内皮生长因子通过磷脂酰肌醇3'-激酶/Akt信号转导途径调节内皮细胞存活。Flk-1/KDR激活要求。生物化学杂志。1998;273:30336–30343. doi:10.1074/jbc.273.46.30336。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rodriguez-Viciana P、Warne PH、Dhand R、Vanhaesebroeck B、Gout I、Fry MJ、Waterfield MD、Downward J.磷脂酰肌醇-3-OH激酶是Ras的直接靶点。自然。1994;370:527–532. doi:10.1038/370527a0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rubio I，Rodriguez-Viciana P，Downward J，Wetzker R.Ras与磷脂酰肌醇3-激酶γ的相互作用。生物化学杂志。1997;326（第3部分）:891–895. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rodriguez-Viciana P，Warne PH，Vanhaesebroeck B，Waterfield MD，Downward J.通过与Ras的相互作用和点突变激活磷脂酰肌醇3-激酶。Embo J。1996;15:2442–2451. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rodriguez-Viciana P、Warne PH、Khwaja A、Marte BM、Pappin D、Das P、Waterfield MD、Ridley A、Downward J.磷脂酰肌醇3-OH激酶在细胞转化中的作用以及Ras对肌动蛋白细胞骨架的控制。单元格。1997;89:457–467. doi:10.1016/S0092-8674（00）80226-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Weimar IS、Miranda N、Muller EJ、Hekman A、Kerst JM、de Gast GC、Gerritsen WR。肝细胞生长因子/分散因子（HGF/SF）由人骨髓基质细胞产生，可促进人造血祖细胞（CD34+）的增殖、粘附和存活实验血液学。1998;26:885–894.[公共医学][谷歌学者]
  • HGF在MTLn3乳腺癌细胞中诱导FAK活化和整合素介导的粘附。国际癌症杂志。1999;83:640–649.[公共医学][谷歌学者]
  • Hood JD，Frausto R，Kiosses WB，Schwartz MA，Cheresh DA。两种血管生成途径中α-整合素介导的Ras-ERK信号传导差异。细胞生物学杂志。2003;162:933–943. doi:10.1083/jcb.200304105。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Morales-Ruiz M、Lee MJ、Zollner S、Gratton JP、Scotland R、Shiojima I、Walsh K、Hla T、Sessa WC。1-磷酸鞘氨醇通过内皮细胞中的Gi蛋白/磷酸肌醇3-激酶途径激活Akt、一氧化氮产生和趋化性。生物化学杂志。2001;276：19672年至19677年。doi:10.1074/jbc。M009993200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Purdie KJ、Whitley GS、Johnstone AP、Cartwright JE。肝细胞生长因子诱导的内皮细胞运动是通过诱导型一氧化氮合酶表达上调介导的。心血管研究。2002;54:659–668. doi:10.1016/S0008-6363（02）00255-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kawasaki K、Smith RSJ、Hsieh CM、Sun J、Chao J、Liao JK。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶Akt通路的激活介导一氧化氮诱导的内皮细胞迁移和血管生成。分子细胞生物学。2003;23：5726–5737。doi:10.1128/MCB.23.16.5726-5737.2003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Deregibus MC、Buttiglieri S、Russo S、Bussolati B、Camussi G.磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的CD40依赖性激活介导内皮细胞存活和体外血管生成。生物化学杂志。2003;278:18008–18014. doi:10.1074/jbc。M300711200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Steinle JJ、Meininger CJ、Forough R、Wu G、Wu MH、Granger HJ。Eph B4受体信号通过磷脂酰肌醇3-激酶途径介导内皮细胞迁移和增殖。生物化学杂志。2002;277:43830–43835. doi:10.1074/jbc。M207221200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ma H、Calderon TM、Kessel T、Ashton AW、Berman JW。肝细胞生长因子介导血管平滑肌细胞迁移的机制。圆形Res。2003;93:1066–1073. doi:10.1161/01.RES.0000102867.54523.7F。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Holgado-Madruga M、Moscatello DK、Emlet DR、Dieterich R、Wong AJ。Grb2相关结合物-1通过神经生长因子介导磷脂酰肌醇3-激酶激活和促进细胞存活。美国国家科学院院刊。1997;94:12419–12424. doi:10.1073/pnas.94.23.12419。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Trusolino L，Bertotti A，Comoglio PM。α6beta4整合素在控制HGF依赖性侵袭性生长中的信号适配器功能。单元格。2001;107:643–654. doi:10.1016/S0092-8674（01）00567-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zhang YW，Su Y，Volpert OV，Vande Woude GF。肝细胞生长因子/分散因子通过正VEGF和负血小板反应蛋白1调节介导血管生成。美国国家科学院院刊。2003;100:12718–12723. doi:10.1073/pnas.2135113100。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自BMC细胞生物学由以下人员提供BMC公司