用于确定预测神经元命运因素的自动显微镜系统

摘要

神经系统给那些试图了解其在健康和疾病中功能的生化基础的人带来了艰难的实验挑战。大脑由数量惊人的不同细胞类型组成(1–4). 因为相关的变化通常发生在一小群神经元中，所以原始信号可能很小，很难通过标准的生化或分子生物学分析检测到。此外，一个神经元亚群的变化可以触发邻近细胞或遥远但突触连接的神经元亚群中的额外变化。由于不同类型的细胞经常混合在一起，而且信号的来源无法解析，因此出现的图像可能很复杂，容易产生误导。

阐明致病机制可能特别具有挑战性。首先，特定神经元死于疾病的时间可能是随机的(5)减少可测量信号并增加其可变性。第二，最初的病理事件可能会在受影响的细胞、相邻细胞及其突触伙伴内激发无数稳态反应。因此，与病理状态相关的变化必然是异常的，但不一定是致病性的。然而，依靠静态“快照”的标准方法可能无法确定变化是致病性的、偶然的还是有益的应对反应。第三，疾病本身可能会限制检测。随着退行性疾病的进展，脆弱的神经元死亡，可产生可检测生化信号的神经元也越来越少。最终，主要的生化变化是剩余细胞的应对反应。最后，许多致病过程缓慢，进一步减少了可以在任何一个时间点测量的信号。

克服这些局限性的一个策略是使用能够解析单个细胞信号的分析。然而，标准的单细胞测定通常耗时，易受用户偏见的影响，并且通常比基于人群的测定更不定量。为了克服这些问题，我们构建了一个能够在任意时间间隔内重复准确地解析单个细胞内信号的系统。我们的系统结合了单细胞方法的特异性和基于人群方法的吞吐量，使我们能够系统地定量地阐明中间变化和细胞长期命运之间的关系。

方法

试剂和质粒。海康酸来自Sigma–Aldrich，乙炔同二聚体（EtHD）来自Molecular Probes，Lipofectamine 2000来自Invitrogen。我们使用了以下质粒：pCMV6-Myr-Akt-hemagglutin（纽约哥伦比亚大学Thomas F.Franke的礼物；参考。6)、pCMV4（来自旧金山格莱斯顿病毒学和免疫学研究所华纳·格林的礼物）、pGW1-GFP（来自洛杉矶南加州大学唐·阿诺德的礼物），pGW1-CFP和pGW1-YFP（来自加利福尼亚州斯坦福大学里卡多·多梅奇的礼物）以及编码dsRED1的哺乳动物表达质粒（克隆泰克）。

神经培养。如参考文献所述，从大鼠胚胎（E16–18）制备皮层神经元的原代培养物。7解剖大脑皮层，用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂处理，然后在Optimem/葡萄糖培养基中轻轻研磨以分离单个神经元。电池（6×10⁵)在24孔组织培养板的每个孔中进行培养；2h后，用含血清的生长培养基代替电镀培养基。（有关更多详细信息，请联系S.F.。）

转染。在6-7天转染神经元在体外如参考文献所述。7转染前1h更换生长培养基。美国加利福尼亚州²⁺/形成质粒DNA的磷酸盐共沉淀物（1–4μg），并添加到24孔板的每个孔中。GFP与AKT或空质粒以1:3的比例共沉淀。添加沉淀约20分钟后，去除培养基，用含有2%二甲基亚砜的培养基短暂处理细胞，冲洗两次，并保持在无血清培养基中。对于一些转染，将Lipofectamine 2000和DNA混合在一起，添加到神经元中5小时，并用无血清生长介质替换。

机器人显微镜。成像系统采用尼康TE300 Quantex底座，配备Super Fluor×40[数值孔径（N.a.）1.3]和CFI Plan Achromat×100（N.a.1.3）物镜，长工作距离物镜×20（N.a.0.45）和×40（N.a.0.6），以及低倍率×10（N.a.0.3）和×4（N.a.0.13）物镜。探测器是哈马松Orca II 12/14位数字冷却电荷耦合器件相机（新泽西州米德尔塞克斯）。收集图像并用变形（宾夕法尼亚州唐宁镇的Universal Imaging）和用编写的自定义程序垫子实验室和可视化cUniblitz百叶窗（Vincent Associates，Rochester，NY）限制透射光照明。电动舞台和焦点旋钮控制器（带线性编码器的ProScan II）来自Prior Scientific（马萨诸塞州罗克兰）。照明来自氙灯（175 W），通过液体光导管。荧光激发和发射通过使用两个10位电动滤光片轮（Lambda 10-2，Sutter Instruments，Novato，CA），通过光学滤光片组（Chroma Technology，Rockingham，VT）独立控制。该系统安装在隔振台上（马萨诸塞州皮博迪市技术制造厂）。图像暂时存储在计算机硬盘上，然后刻录到数字视频光盘上，以便进一步进行离线自动分析。

图像采集和分析的软件控制。为了确定平板的倾斜，我们编写了一个程序来测量单个阱内三个不同位置或多阱平板内三个不同位置处焦平面的相对位置。该程序使用三个测量点及其相对焦点之间的横向距离来计算焦平面的斜率。记录板位置的程序指示舞台将制造商创建的板上基准标记的位置成像，聚焦，然后收集标记的参考图像。然后，我们将采集程序中的每个其他点与该基准标记相关联。当板返回到板架时，我们重新定位它以恢复信托标记的注册。

阈值由以下等式确定：

哪里T型是计算出的阈值，k个₁,k个₂、和k个_三是经验确定的常数，A类是组成图像的数字化像素值数组的标准偏差，以及B类是数组中的最小像素值。

结果

图像采集。我们构建了一个高效的宽场外荧光成像系统，该系统具有机动舞台和焦点控制。摄像机被放置在倒置显微镜的底座端口，以最小化光路的复杂性，并最大限度地增加检测到的光子数量。使用固定的多波段通二向色镜和10位激发和发射滤光片轮来检查选定光谱中的荧光信号。在自动图像采集期间，滤光片轮由计算机控制。我们还使用了一个14位电荷耦合器件相机来解析特定带宽光的宽范围信号强度。

利用这种结构，我们生成了生长在塑料组织培养板上并转染了多种荧光蛋白的神经元的高分辨率图像(图1). 组织培养塑料对某些波长的光（例如UV）的传输不如玻璃好，并且可以散射更多的光，从而降低图像分辨率。然而，塑料有几个优点。首先，神经元在塑料上生长时比在玻璃上生长时存活得更好，看起来更健康。其次，塑料板非常适合廉价的高通量分析。最后，神经元直接附着在平板上有助于开发软件算法，使我们能够在任意时间间隔内精确返回到相同的神经元或神经元场。

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图1。

在塑料组织培养皿上生长并表达各种荧光蛋白的神经元的高分辨率图像。(A类)用dsRED转染的皮层神经元树突上的脊柱（箭头）。（×40，N.A.0.60；比例尺，15μm）(B类)含有CFP的一组神经元的胞体和突起。（×10，N.A.0.30；比例尺，150μm）(C)纹状体神经元上表达GFP的生长锥和神经突起（箭头）。（×20，N.A.0.45；比例尺，50μm）(D类)用GFP转染的皮层神经元的细胞体（箭头）。（×4，N.A.0.13；比例尺，300μm）(E类)转染后以大约每天的间隔收集的图像（×4）显示了返回相同神经元区域的能力。一个神经元（开放箭头）在整个实验中存活；另一个（实心箭头）在第4天到第5天之间死亡。（比例尺，300μm）(F类)单个神经元的细胞内和细胞外结构（如神经突）可以随着时间的推移进行解析和监测。（×20，N.A.0.45；比例尺，60μm）

为了自动化图像采集，我们编写了计算机程序来控制舞台和调焦旋钮电机。这些程序指定了扫描多孔板的单个阱并生成一系列具有不同目标（×4、×10、×20和×40）的非重叠图像所需的步进电机运动次数。其他程序移动板，以便系统地扫描多孔板的每个孔。为了在舞台运动之间实现自动对焦，我们结合了一种商用算法(变形，通用成像）。它通过比较在不同焦距旋钮位置收集的图像来识别焦平面。基于内容的数学算法，用于识别沿焦平面的一系列相邻图像中对应焦平面的图像z（z）-参考文献中描述了轴。8–10如参考文献所述，其中一些算法已在高内容筛选系统中实现。11–14.

最初，自动对焦不可靠、光毒性大、速度慢，在执行单周期成像和横向舞台移动的时间中占90%。这个过程包括通过相机的电荷耦合器件芯片收集图像，将电子信息传输到计算机，通过计算机进行分析，以及根据分析移动焦距旋钮。将电子信息传输到计算机是最耗时的步骤。因此，我们通过改变我们使用的电荷耦合器件芯片的分立元件数量来测试降低图像空间分辨率对自动对焦的影响。将空间分辨率降低≈95%，在不降低精度的情况下，将聚焦周期加快了5倍。

使用荧光照明聚焦可能会产生光毒性且不可靠。对于缺乏荧光的场，显微镜可以在离焦平面很远的地方进行搜索，以至于无法恢复。通过使用相位控制光学和来自低强度白炽灯的20毫秒光脉冲，我们可以生成一个具有足够空间对比度的图像，以锐利聚焦显微镜，无论该图像是否包含荧光(8).

为了获取多孔培养皿单孔内多个神经元场的图像，我们将培养台以螺旋模式从孔中心向外移动。然而，介质的弯月面会干扰相位控制光学，随着距离井中心径向距离的增加，图像会退化。自动对焦很快就变得不可能了。

我们设计了两个相关的解决方案，使自动对焦更加可靠，并大大加快了图像采集程序。在一种方法中，我们使用的物镜具有如此低的N.a.，因此具有很高的景深，使得24孔板井中相邻场内的所有物体都保持清晰聚焦。此解决方案特别适用于高通量应用（例如，计算神经元数量以测量神经元存活率）。横向空间分辨率足以分辨单个神经元，低放大率使其能够在单个场中对许多神经元进行成像。然而，这种方法在更高的N.A.目标中失败了，因为这些目标的视野深度较窄，无法再聚焦相邻的视野。相反，我们对显微镜进行了编程，以测量平板的倾斜。然后，我们使用测量值为舞台的每个横向运动引入目标的补偿垂直运动，从而使所有相邻场保持焦点。该程序使用斜面来修改自动舞台移动，以便即使有较高的N.a.目标，场也能保持焦点。

接下来，我们开发了一种方法来返回到完全相同的神经元或神经元场。尽管步进电机的运动是精确的，但当我们移除并更换支架上的板时，相应图像中的微观场的内容是不同的，或者只是部分重叠。试图将钢板固定在钢板架内的位置是不切实际的，而且基本上是无效的。相反，我们开发了一个简单的程序，将我们的收购计划的变动与板块上的信托标记联系起来。可以使用下面描述的自动程序执行重新注册。该策略允许我们在几乎任何时间间隔内返回到完全相同的神经元或神经元场(图1E类和F类).

图像分析。为了避免用户的偏见，我们通过在图像中选择“正”像素并将其分组为对象来进行进一步分析，从而实现了分析的自动化。我们测试了图像的简单特征是否可以用于准确计算正像素的阈值。可以根据图像中像素的最小值和总方差计算出阈值的相对较好的估计值（见图5A类–E类，发布为支持信息在PNAS网站上）。该程序准确地选择了不相关图像和同一神经元场在不同时间的图像的适当阈值，并且在具有≥30个感兴趣对象的图像上比常用的商用算法表现更好。对于对象较少的图像，后一种算法更可靠。这一发现很重要，因为绿色荧光蛋白（GFP）的荧光可以在转染后2–3小时内检测到，并且由于稳态GFP水平的增加，转染后100小时内荧光持续增加（图5F类和G公司). 我们的程序补偿了GFP表达水平的变化，使其能够从不同时间采集的图像中识别相同的物体（例如神经元）（图5F类). 这种补偿还可以独立于GFP的绝对水平，更准确地测量神经元的真实尺寸（图5F类).

一旦确定了截止点，强度超过此值的相邻像素将被分组为不同的对象。这些物体可以通过软件过滤器、测量物体形状和尺寸的程序进行进一步评估(变形，通用成像）。我们仅根据物体的面积和可忽略性构建了软件过滤器，可以在显微镜视野中常规识别和测量93-98%的活神经元，同时排除>99%的荧光碎片。如果两个或多个阳性细胞距离太近，我们的阈值算法和商业阈值算法将相邻的正像素作为单个对象处理。对阳性神经元簇形成的相邻阳性像素区域的经验测量表明，这些区域往往位于相对狭窄的范围内，这与簇内神经元的数量成正比。利用这些信息，我们构建了软件过滤器来计算由两个、三个和四个神经元组成的簇，从而得出一个区域内细胞数量的准确（±1%）估计值。

蛋白质产生的生物反应通常取决于其浓度。因此，未能捕捉到单个细胞水平上的基因表达与其产生的生物反应之间的关系，可能会使检测或描述这种关系变得困难。大脑的细胞异质性使这些问题复杂化，因为同一基因可能具有显著不同的影响，这取决于浓度和细胞类型。因此，能够识别转染细胞并估计转染基因在每个细胞内的表达水平是很有价值的。

因此，我们评估了作为共同转染基因表达替代物的标记基因的表达水平(15). 我们用不同数量的黄色荧光蛋白（YFP）和蓝色荧光蛋白（CFP）共同转染神经元，测量每个神经元中每个蛋白的荧光，并确定一个基因的表达是否与另一个基因表达相关。我们证实，我们可以独立测量每个蛋白质的荧光（见图6，该图发布为支持信息在PNAS网站上）。然后，我们以不同比例将YFP和CFP共转染到神经元中。虽然这两种蛋白的表达在细胞间差异很大，但一种蛋白的荧光几乎总是与另一种蛋白荧光高度相关(第页²=0.99），并与转染质粒DNA的比率直接相关(图2A类). 然后，我们通过成像GFP荧光和免疫细胞化学来测量单个神经元中GFP的表达。这两个测量值高度相关(16)(图2B类). 因此，标记基因的荧光体内是其表达水平的良好指标，可用于估计共转染基因的表达。

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图2。

布尔图像分析。(A类)神经元与CFP、YFP或两者共同转染。对不同比例转染CFP和YFP的神经元的CFP和YFP荧光进行细胞-细胞比较，结果表明几乎所有神经元都是共转染的，并且这两种转染蛋白的荧光强度高度相关(第页²= 0.99). (B类)通过直接测量GFP荧光和针对GFP的免疫荧光来评估GFP表达的细胞间比较。(C)注册两幅图像的矩阵算法。这里，两幅图像在x个–年将其平面化，然后使用计算机算法计算两幅图像的乘积矩阵之和。当两幅图像进行配准时，总和最大。A.U.，任意单位。

在之前的实验中，我们在逐个神经元的基础上比较了CFP和YFP的荧光。准确地自动进行这些和其他（例如布尔值）比较需要两幅图像中的精确像素位置相对应。然而，滤光片轮的自动移动偶尔会导致同一显微镜视野中不同荧光图像的微小错误配准。我们开发了一种简单的自动算法来纠正错误注册。采集每个荧光图像后，还采集了同一显微镜场的12位数字相控图像。将相控图像二值化，生成矩阵，其中每个矩阵的大约一半数字为零，一半数字为一。选择一个矩阵的子集，并将其与另一矩阵的子集相乘；对乘积矩阵进行求和。当图像（和子集矩阵）相同时（即，当它们处于完美配准时），总和最大(图2C). 因此，我们可以从经验上对一组电位进行采样x个–年错误配准量并计算产生最佳配准的数量。然后，最佳值用于注册原始图像中重叠的部分，可用于直接比较。

生物过程的自动纵向分析。为了确定该系统是否可用于纵向监测神经元存活或其他长期适应性反应，我们比较了几天或几周内定期收集的图像。有时，一幅图像中神经元的GFP荧光会在随后的图像中突然消失。Erb和同事(17)最近的研究表明，GFP的丢失是某些非神经元细胞类型不同死亡类型的一个敏感而特异的标志。如果GFP的丢失对应于神经元的死亡，则可以随着时间的推移进行量化，作为神经元存活的衡量标准(17,18). 为了测试这种可能性，我们同时使用膜不渗透核染料EtHD测量了转染神经元中GFP的损失和膜完整性的损失。在广泛使用的LIVE/DEAD分析中，细胞核的EtHD染色表明死亡。在细胞外EtHD的存在下，GFP转染神经元的细胞体对神经毒素红藻氨酸产生反应，细胞体变圆并肿胀，神经突开始收缩。最终，特定神经元的荧光突然消失，此时其细胞核被EtHD阳性染色(图3A类). 最近，一种可溶性细胞溶质荧光蛋白GFP的丢失与一种共同转染的可溶性细胞溶体荧光蛋白红色荧光蛋白（mRFP）的丢失相一致(16). 反过来，细胞凋亡标记物膜联蛋白V对神经元的染色紧接在mRFP丢失之前。因此，GFP荧光的丧失与两种广泛接受的细胞死亡指标密切相关。

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图3。

神经元存活的自动成像。(A类)GFP转染的神经元（箭头）在膜不导核染料EtHD存在下用红藻氨酸处理。GFP荧光损失与膜完整性损失和EtHD核染色相关(n个= 12). （比例尺，50μm）(B类)自动成像测量的频率对生存率没有明显影响。姐妹培养中的神经元(1)每天从培养箱中取出并成像(2)每天从培养箱中取出，每三天进行一次成像，或(三)每三天从培养箱中取出并成像一次，同样存活良好。(C)同时，在实验结束时对一个转染神经元培养物进行一次成像（金条），在转染后1天和实验结束时，对另一个培养物进行成像（蓝色条）。存活率几乎相同。N.S.，不显著。(D类)GFP的表达不能检测到对存活的影响。确定每个神经元的存活时间，并根据该神经元死亡前的GFP表达水平绘制。相关分析显示GFP表达与神经元存活无关(n个= 2). A.U.，任意单位。(E类)自动成像和分析显示红藻氨酸神经毒性(n个= 2). 比较了三种姊妹培养物中转染神经元的存活率。在第一个（蓝色方块）中，神经元未经处理。在第二个（金色三角形）和第三个（绿色三角形）中，分别在转染24小时或76小时后添加红藻氨酸（10μM）。在红藻氨酸治疗后，两种治疗培养物的神经存活率均显著下降。(F类)自动成像和分析检测CA-Akt促进神经元存活的能力(n个= 3). 用GFP和CA-Akt表达质粒（金三角）或空白对照载体（绿三角）转染神经元。

为了监测神经元存活和其他长期反应，我们需要知道周期性成像或GFP标记物是否影响神经元存活(19,20). 首先，我们发现不同频率成像的姊妹培养神经元之间没有显著的存活差异(图3B类和C)这表明我们的成像方法不会干扰神经元存活。接下来，我们测试GFP的表达是否影响生存率。对GFP及其变体潜在毒性的研究得出了相互矛盾的结论(17–19,21). 如果GFP有毒，GFP荧光测定的GFP表达水平应与生存期呈负相关。通过使用机器显微镜追踪GFP荧光和GFP转染神经元的存活时间，我们发现单个神经元的存活与GFP表达水平之间没有相关性(图3D类，第个²=0.047），表明对生存率没有显著影响。

如果这种方法能够准确地测量神经元存活率，那么它还应该检测调节存活率的分子的影响。为了测试这种可能性，我们用GFP转染神经元，并在模拟治疗或红藻氨酸治疗前后定期对细胞成像。如GFP阳性神经元的自动分析所示，应用红藻氨酸后神经元存活率下降(图3E类)并在共同转染前生存激酶Akt的组成活性形式后增加(图3F类). 这些结果表明，自动显微镜是一种敏感而有效的方法，可以测量细胞外或细胞内分子对神经元存活的影响。

定期返回到完全相同的显微镜视野的能力为数据分析创造了前所未有的机会。神经元队列可以纵向追踪，而在干预期间死亡的神经元数量可以通过自动分析程序的简单减法得出。通过确定特定神经元群的存活时间，我们为应用称为存活分析的强大统计技术奠定了基础。为了生存分析的目的和惯例，将在该间隔期间死亡的神经元分配一个生存时间，该时间相当于转染和它们从图像中消失之间的时间。例如，我们推导了转染空载体或活性Akt的神经元队列的存活时间(图3F类)然后使用非参数Kaplan–Meier分析估计潜在生存功能，S公司(t吨)，对于每个条件(图4A类). 经log-rank检验分析，生存功能差异显著（χ²= 4,086).

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图4。

生存分析的应用。(A类)基于人群的Akt生存数据的Kaplan-Meier分析。从一系列纵向低放大率（×4）图像中，以不同的间隔确定用CA-Akt或空载体转染的存活神经元的数量。通过比较间隔前后相同的显微镜视野，推断出每个间隔期间死亡的神经元数量。按照惯例，在特定时间间隔内死亡的神经元被分配一个与该时间间隔结束时间相对应的事件（即存活）时间。这些事件时间用于构建Kaplan–Meier累积生存图，并通过log-rank（Mantel–Cox）检验进行统计显著性分析(n个= 2). (B类)单细胞Akt存活数据的Kaplan-Meier分析。与A类纵向收集。在这三张图像中，每一张都能识别出单个神经元。中描述的方法A类通过比较在不同时间点采集的神经元图像来确定每个神经元的事件时间，并构建Kaplan-Meier生存图(n个= 2). (C)对共转染GFP和血凝素标记的CA-Akt的神经元进行免疫染色，并测量荧光信号，并逐个细胞进行关联。GFP和CA-Akt的表达显著相关，提示GFP荧光体内可以用作CA-Akt表达式的代理项。(D类和E类)GFP荧光与CA-Akt共转染神经元的寿命相关并预测其寿命(D类)但在那些与空载体共转染的病毒中没有(E类). A.U.，任意单位；N.S.，不显著。

为了证实我们的自动图像分析程序准确地量化了神经元存活率，我们手动进行了纵向分析。我们随机选择了三个显微镜视野，并在实验过程中检查了这些视野的每个图像。确定每个区域中每个神经元的存活时间，然后进行Kaplan–Meier分析(图4B类). 尽管样本大小（83个对照神经元和88个Akt神经元）仅为自动分析中样本大小的≈1%，但存活曲线非常相似。这些结果支持了两个结论。首先，我们的自动化分析程序可以快速准确地测量神经元存活率，并可以生成数据集，这些数据集的巨大规模使得统计分析极其敏感。其次，即使对非常小的神经元样本进行生存分析，也可以检测和准确测量生物效应。

单细胞纵向分析以确定预测命运的因素。虽然比我们的自动化方法慢，但单细胞的纵向分析为阐明因果机制提供了独特的机会。例如，可以在单个神经元内测量任意数量的变量，并纵向跟踪，直到观察到重要的生物命运。额外的统计技术，如生存数据的比例风险回归分析，使量化特定因素对神经元命运的贡献成为可能。小样本单细胞分析的灵敏度和准确性表明，这种方法是可行的和值得的。对于存活研究，自动化和单细胞分析使识别和区分神经元内预测存活或死亡或与神经元命运无关的早期变化成为可能。

接下来，我们确定神经元中活性Akt的表达是否能预测其寿命。我们预计标记蛋白（例如GFP）的荧光体内可以用作共同转染Akt表达水平的替代物(图2A类和B类). 然而，由于编码GFP和组成活性Akt（CA-Akt）的表达质粒使用不同的启动子，GFP和CA-Akts的表达可能不相关。我们用GFP和血凝素标记的CA-Akt共同转染神经元，进行双标记免疫细胞化学，并逐细胞定量每个标记细胞的荧光。GFP和CA-Akt表达显著相关(图4C). 因此，我们使用纵向单细胞分析来检测用GFP和空载体或CA-Akt共转染的神经元。通过测量图像的平均像素强度值来估计每个神经元的GFP荧光。在CA-Akt和GFP共同转染的神经元中，GFP荧光与寿命高度相关(图4D类)但在转染GFP和空载体的神经元中没有(图4E类). 这些结果表明，根据GFP荧光水平估计，单个神经元内CA-Akt的表达水平是促进存活的关键因素，而不是GFP本身，并且可以预测神经元的寿命。共同转染的GFP作为表达的替代物，避免了将GFP融合到感兴趣的分子中可能产生的意外影响，并提高了系统的多功能性和效率。

讨论

我们开发了一种具有多种功能的机器人显微镜。它可以快速、自动地获取图像，适合于高吞吐量应用。采集足够精确，可以获得神经元或其他细胞类型的精细特征(16)进行空间解析，并允许在任意时间间隔后对同一神经元或神经元场进行重新成像。自动分析程序可以提取每个显微镜视野内神经元的关键形态特征，对同一视野的不同荧光图像进行布尔分析，并纵向跟踪神经元队列，以确定这些神经元的特征如何随时间变化。在我们的例子中，布尔分析指的是逻辑运算，它确定同一物体的不同特征之间的符号关系（例如，AND、OR、NOT），正如用不同荧光滤光片收集的该物体图像所揭示的那样(22). 这样的分析可以扩大从多通道高内容筛选中获得的信息量。通过适当的分析程序，该系统也应适用于细胞的非荧光图像(22). 最后，我们的单细胞分析方法可以识别和区分神经元内预测其命运的早期变化，从而可以评估潜在的因果关系。

图像采集和分析的自动化提高了测量的质量和速度。它消除了手动聚焦时的强烈荧光照明，从而减少了相关的光漂白和光毒性。因此，可以观察到低强度荧光团，并且可以收集更多图像，而不会影响神经元的健康。自动生存分析为量化分子对长期生物反应的调节作用提供了一种极其快速和敏感的方法。最近，我们使用该系统评估了与疾病相关的亨廷顿蛋白的有害影响(16)并发现，单个神经元的存活率可以通过其所含突变型亨廷顿蛋白分子的数量来预测。在这里，我们检测到活性Akt的促生存作用，其神经元数量为原始报告中使用的神经元数量的10%，但具有更大的统计意义(23). 自动生存分析更快，统计显著性比单细胞分析大近20倍。这种速度和额外的灵敏度对于高通量筛选可能特别有用。因此，自动显微镜系统的图像采集和处理程序的范围包括生存和死亡基因和分子。

纵向分析在神经科学中特别有用，因为与静态测量相关的变异性可以掩盖重要的影响。变异可能由多种因素引起，包括细胞多样性、潜在生化过程的随机性以及许多长期适应性和不适应性反应的缓慢速度(20). 这里，利用事件的随机性来确定对特定结果贡献最大的因素。阐明疾病机制可能比研究生理途径更加复杂。与疾病相关的变化可能代表原发性致病性变化与受影响细胞或邻近细胞的有益和有害应对反应的复杂组合。解开这些变化对疾病的影响对于确定潜在的治疗靶点至关重要。通过关注关注的结果，我们可以确定预测特定命运的因素组合，并将这些因素归类为致病性、偶然性或潜在益处。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：M.A.和S.F.设计的研究；M.A.和S.F.进行了研究；M.A.和S.F.分析数据；S.F.写了这篇论文。

缩写：EtHD，乙炔同二聚体；YFP，黄色荧光蛋白；CFP，青色荧光蛋白；CA-Akt，组成活性Akt；N.A.，数字孔径。

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