血管内输送的心脏干细胞穿越血管屏障，再生梗死心肌，改善心脏功能

摘要

随着最近对急性心肌梗死（MI）患者心脏再生治疗的兴趣激增(1)，确定临床适用的策略至关重要。几种细胞类型被用于重建死亡心肌。其中，内皮祖细胞和骨髓源细胞是最成功的(2–6). 然而，对骨髓源性细胞的初步长期研究表明，新的心肌细胞并不具有成人表型，而是类似于新生细胞，随着时间的推移，这些细胞会因凋亡而死亡（P.A.，未发表的数据）。我们继续致力于确定有效的细胞群和有效的交付方式。

这项发现表明，成人心脏含有大量心脏干细胞（CSC），可以补充心肌细胞数量并生成冠状动脉(7–12)极大地改变了心脏作为有丝分裂后器官的传统观点。由于其在心肌细胞再生中的天然作用，内源性CSC似乎是心肌修复的理想细胞。最近的研究表明，当c-kit^{销售时点情报系统}将CSC直接注射到永久性冠状动脉闭塞引起的梗死附近的心肌中，它们迁移到梗死区并重建部分死亡组织，缩小梗死面积并改善大鼠的心脏功能(9)和老鼠(12). 相比之下，在短暂冠状动脉闭塞小鼠体内静脉注射CSCs，再生量很小（≈心脏总细胞的3%）(10)（在该研究中，未评估心脏功能）。这些调查(9,10,12)表明CSC具有重建死亡心肌的潜力，但在将这种方法用于翻译研究之前，需要解决一些基本问题。首先，尽管大多数急性心肌梗死患者都经历了自发或医源性再灌注，但CSCs在再灌注梗死情况下改善心功能的能力从未得到测试。文献中充满了在短暂而非永久性冠状动脉闭塞情况下有效的治疗实例(13). 因此，当冠状动脉闭塞后再灌注时，确定CSC是否有效至关重要，再灌注是一种显著改变心脏环境的事件(14). 第二，心肌梗死周围区域注射CSC后，左室功能得到改善(9)这种方法对患者来说很困难。临床上，CSC最实用的给药途径是血管内给药，但尚不清楚注射到冠状循环中的CSC是否能穿过血管壁，转移到梗死区域，并启动有效的心肌再生。最后，CSC改善心脏功能的机制（分化为心肌细胞、融合、旁分泌对原有细胞的影响）尚不清楚。

本研究的目的是通过彻底的综合调查来解决这些问题，包括大样本、盲法数据分析以及同步评估心脏结构和功能。具体而言，我们研究了CSC给药的临床相关方式（即血管内给药）在临床相关大鼠模型（短暂冠状动脉闭塞后再灌注）中重建梗死心肌是否有效，该模型旨在模拟急性心肌梗死最常见的临床条件。我们还对可能的细胞融合进行了彻底分析。

材料和方法

所有材料和方法的详细说明见支持文本，发布为支持信息在PNAS网站上。

CSC的分离和培养。从成年Fischer 344大鼠心室中分离出CSC。通过细胞分选和单细胞克隆获得的克隆形成细胞被携带EGFP的逆转录病毒感染(9).

缺血/再灌注损伤。麻醉的雌性Fischer 344大鼠（年龄3-4个月）接受开胸90分钟的左冠状动脉前降支闭塞，然后再灌注。再灌注后4小时，1×10⁶在主动脉和肺动脉两次20秒闭塞期间，将CSC或载体注入主动脉根部。在假手术的大鼠中，胸部被打开，但没有注射。5周后处死大鼠。

超声心动图和血流动力学。在基线检查时（冠状动脉闭塞前2天）以及再灌注后2天和35天获得了连续的超声心动图。使用标准方法计算解剖和功能参数(15). 术后35天，即死亡前，进行血液动力学研究。

形态计量学和组织学。心脏用福尔马林灌注固定，并用石蜡包埋。使用图像分析仪，从系列LV切片中获得形态参数(16). 使用表1中规定的抗体在福尔马林固定的4μm厚切片中进行免疫组织化学，该表发布为支持信息在PNAS网站上(7–9).

EGFP细胞体积^{销售时点情报系统}和EGFP^NEG公司肌细胞。从CSC处理和未处理的心脏中酶解分离LV心肌细胞，用4%多聚甲醛固定，并在悬浮液中染色。通过共焦显微镜三维光学切片测量心肌细胞的平均体积(16).

新肌细胞中的细胞核DNA含量现场杂交。用Ki67对肌细胞和淋巴细胞进行染色，通过共焦显微镜测量非循环和循环EGFP中碘化丙啶（PI）的荧光强度^{销售时点情报系统}心肌细胞核。为了检测12号染色体，将切片暴露于含有70%甲酰胺的变性溶液中。用乙醇脱水后，将切片与大鼠染色体12/Y油漆探针（Cambio，Cambridge，U.K.）杂交3 h(7,17). 细胞核用PI染色。

统计分析。数据以平均值±SEM报告。对未配对或配对学生的吨测试，视情况而定。根据情况，使用单因素或双因素（时间和组）方差分析进行多组比较，然后使用Student’s吨使用Bonferroni校正进行测试。

结果

排除项和梗死面积。共研究了68只梗死大鼠（32只未治疗，36只治疗）和12只假手术对照。11只未经治疗和10只接受治疗的大鼠死于心室颤动、主动脉破裂或出血。由于冠状动脉封堵器失效，四只未经治疗的大鼠和两只经治疗的小鼠被排除在外，剩下17只未经处理的大鼠，24只接受治疗的大白鼠。梗死面积，以瘢痕LV心肌的比例测量(18)两组相似（未治疗组为12.4±1.7%，治疗组为13.4±1.9%）。然而，这种方法无法评估CSC对梗死面积的影响，因为组织重建区域分布在整个瘢痕中。因此，梗死的大小和心肌再生的程度是通过一种更复杂的定量方法来测量的，该方法分别基于左心室中丢失和形成的心肌细胞数量（见下文；图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。

CSC的血管内输注可阻止左心室重塑并改善左心室功能。在基线检查时（冠状动脉闭塞或假手术前），未经治疗和CSC治疗的大鼠的心室性能超声心动图参数相似。再灌注后2天，左心室收缩功能受损、左心室扩张和左心室壁变薄也具有可比性(图1; 另请参见图7A–D，发布为支持信息这表明两组患者的缺血性损伤程度相似。

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图1。

服用CSCs可改善左室收缩功能。图示为未经治疗和治疗的动物的超声心动图测量。*，P（P）未治疗和治疗大鼠之间<0.05。数据为平均值±SEM。

在未经治疗的大鼠中，梗死后2至35天，左室收缩功能进一步恶化，左室进一步扩张，左室壁厚度进一步减少，这与进行性左室重塑一致（图。​（图11和7A–D; 另请参见图8，其发布为支持信息在PNAS网站上）。相反，在注射CSC的大鼠中，心脏性能和解剖结构在2至35天期间基本保持不变。因此，在梗死后35天，CSC治疗的大鼠表现出显著的(P（P）<0.01）梗死区和非梗死区的缩短分数、射血分数、射血容量、心输出量、周向纤维缩短速度和左心室收缩壁厚度均较高（图。​（图1，1, 7A–D和8）。同时，CSC治疗的大鼠有显著的(P（P）与未经治疗的大鼠相比，左室收缩末期直径、面积和体积较低（图。​（图1，1, 7A–D和8）。梗死后35天，CSC治疗组和未治疗组动物的左室舒张末压（LVEDP）相似（分别为5.6±0.4和5.6±0.9 mmHg；1 mmHg=133 Pa）。梗死动物LVEDP的低值反映了此处使用的缺血/再灌注方案获得的相对较小的梗死(19).

超声心动图结果得到了舒张停止灌注固定心脏心室大小和形状的解剖分析的证实。与未经治疗的动物相比，经治疗的大鼠左室纵轴、横室直径和室容积较小(P（P）< 0.01) (图2A–C). 此外，壁厚-腔室半径比和LV质量-腔室体积比显著(P（P）<0.01）分别高于未治疗的大鼠(图2E类和F类). 治疗组大鼠也表现出32%(P（P）<0.003）与未经治疗的动物相比，梗死壁厚度增加(图2D类).

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图2。

CSCs治疗可改善梗死后心室重构。图示为心脏舒张停止时获得的多个解剖参数。*，P（P）未治疗和治疗大鼠之间<0.05。数据为平均值±SEM。

血管内输注CSCs可促进肌细胞再生。将EGFP标记的CSC注射到主动脉根部导致这些细胞在左右冠状循环中分布。一些分散的EGFP^{销售时点情报系统}在右心室心肌中发现了心肌细胞。偶尔，在小阻力小动脉和毛细血管壁中检测到表达EGFP的内皮细胞和平滑肌细胞。EGFP总数^{销售时点情报系统}跨越整个右心室的6至8个横切面上的细胞，间距为1–1.5 mm，从4个到8个不等（图9，发表于支持信息在PNAS网站上）。这些观察结果表明，在没有组织损伤的情况下，CSC对心肌的归巢非常有限。梗死左心室并非如此。

在所有梗死大鼠中，EGFP^{销售时点情报系统}梗死区均发现细胞(图3一个和B类; 另请参见图10，其发布为支持信息PNAS网站）和非梗死心肌（左室后壁和室间隔）。通过细胞核中GATA-4和MEF2C的表达以及细胞质中特异性收缩蛋白识别肌细胞(图3C类; 另请参见图11，其发布为支持信息在PNAS网站上）。连接蛋白43和N-钙粘蛋白被鉴定(图3D类; 另请参见图12，其发布为支持信息在PNAS网站上）。EGFP的双重分布^{销售时点情报系统}梗死区和存活心肌内的细胞并不奇怪，因为冠状动脉闭塞通常会导致缺血区心肌节段性丢失，而非缺血区出现散在的凋亡和坏死细胞死亡(20,21).

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图3。

CSC的使用促进心肌再生。(一个)左心室底部和心尖中间的大横切面，显示CSC治疗的大鼠梗死。(插入)再生梗死心肌（EGFP和α-肌动蛋白，黄绿色）。（棒材，1mm和100μm）(B类)再生梗死心肌的另一个例子（箭头）首先通过α-肌动蛋白染色（红色）显示，然后通过EGFP标记（绿色），然后通过结合EGFP和α-肌动蛋白（黄绿色）显示。(C类)EGFP公司^{销售时点情报系统}（绿色），α-肌节肌动蛋白^{销售时点情报系统}梗死区内新形成的小心肌细胞在细胞核GATA-4（白色）和MEF2C（洋红色）中表达。(D类)EGFP公司^{销售时点情报系统}（绿色），心肌肌球蛋白重链^{销售时点情报系统}梗死区内新形成的小心肌细胞在其质膜连接蛋白43（洋红色，箭头）中表达。(E类)存活的未受损LV心肌中新形成的心肌细胞（箭头所示）首先通过EGFP标记（绿色）显示，然后通过结合EGFP和α-肌动蛋白（黄绿色）[Bar(B–E类)，10微米。]

在CSC治疗大鼠的未受损LV心肌中，再生EGFP^{销售时点情报系统}肌细胞占肌细胞的0.83±0.26%。新形成的心肌细胞与先前存在的相邻细胞无法区分(图3E类)，表明CSC向肌细胞的承诺、分化和成熟在35天内完成。然而，在梗死区，EGFP的表型和组织^{销售时点情报系统}心肌细胞与EGFP的差异显著^{销售时点情报系统}位于远处未受损心肌中的心肌细胞。与EGFP的随机分布相反^{销售时点情报系统}远离梗死区的心肌细胞，在梗死区，再生的心肌细胞聚集在500至10个病灶内⁶微米²，被由III型和I型胶原组成的瘢痕组织包围。肌细胞较小（970±72μm^三)和类似的新生细胞(20)而未受损远端心肌中的新心肌细胞完全分化，具有成人特征，体积为17100±1230μm^三（图13，发布为支持信息在PNAS网站上）。在接受治疗的心脏的非梗死区域，相邻的老年EGFP的体积^NEG公司心肌细胞（24500±1320μm^三)大43%(P（P）<0.001）比年轻的EGFP^{销售时点情报系统}同一心脏中的细胞（图13），但体积小20%(P（P）<0.02）比EGFP^NEG公司未治疗心脏的心肌细胞（29500±1610μm^三; 图13），表明心肌再生减弱了梗死后存活心肌细胞的肥大反应。与假手术对照大鼠（19000±1010μm）心肌细胞的比较^三)、EGFP^NEG公司CSC治疗和未治疗的梗死心脏中的心肌细胞(P（P）<0.002）和55%(P（P）<0.001）梗死后细胞肥大。

CSCs的血管内递送使冠状血管再生。EGFP的形成^{销售时点情报系统}心肌细胞伴随EGFP的分化^{销售时点情报系统}CSC到Ets-1^{销售时点情报系统}，vWF^{销售时点情报系统}内皮细胞与GATA-6^{销售时点情报系统}，α-平滑肌肌动蛋白^{销售时点情报系统}血管平滑肌细胞组织在新的冠状动脉和毛细血管结构中（图14和图15，发表于支持信息在PNAS网站上）。这些新形成的冠状动脉壁厚，管腔小，有时含有红细胞。红细胞的存在表明这些冠状结构已经达到功能能力，并参与了重建心肌的氧合。这些新血管不仅分布在修复性梗死中，也分布在远处的备用心肌中（图15B类和C类). 血管生长导致134±12和31±5 EGFP的形成^{销售时点情报系统}每毫米毛细血管数²梗死心肌和存活心肌。EGFP的相应编号^{销售时点情报系统}小动脉分别为15.2±1.8和0.5±0.1毫米².单个EGFP^{销售时点情报系统}在CSC治疗的梗死大鼠非缺血性LV心肌中，也发现血管结构中不规则分布的内皮细胞和平滑肌细胞。

CSC血管内输注可减少梗死面积。心肌梗死后心室中丢失和残留的心肌细胞总数可可靠评估心肌梗死的严重程度和35天时的心脏恢复程度(16). 治疗组和未治疗组的心肌细胞丢失百分比为27%（-6.0×10⁶心肌细胞）和33%（-7.2×10⁶（图6）。在治疗组中，该值反映了原始梗死的大小，因为EGFP的作用^{销售时点情报系统}肌细胞不包括在这些测量中（这样做是为了评估梗死面积，独立于与CSCs注射相关的肌细胞再生）。因为再生心肌替代了18.8±2.8%的瘢痕梗死，由16.6×10组成⁶表皮生长因子^{销售时点情报系统}心肌细胞，在35天的时间内，CSC形成的心肌细胞比最初丢失的心肌细胞多3倍（5.9×10⁶肌细胞）。然而，重建的心肌仅替换了18.1毫米^三78.9毫米^三组织因缺血性损伤而丢失（图6）。因此，修复过程再生了过多的心肌细胞，但组织重建不足。这是由于新的心肌细胞未能达到成人表型。心肌再生的另一个组成部分是形成散布在备用心肌上的新心肌细胞。此类维修包括0.2×10⁶表皮生长因子^{销售时点情报系统}肌细胞总体积为3.5mm的肌细胞^三心肌总体积为4.6mm^三。总共22.7毫米^三组织的重建，梗死面积从78.9毫米减少了29%^三未经治疗的心脏心肌减少56.2毫米^三CSC治疗的心脏组织。图6显示了梗死面积和心肌恢复的复杂分析中涉及的每个形态测量步骤。应该注意，用这些方法获得的数字是估计值(16).

CSC的血管内输送不会导致细胞融合。为了确定细胞融合是否有助于心肌再生，在分离的EGFP细胞核中测量DNA含量^{销售时点情报系统}在组织切片中评估12号染色体的数目。CSC衍生的心肌细胞的细胞核具有2C DNA含量（图16，发布为支持信息在PNAS网站上）。骑自行车Ki67^{销售时点情报系统}心肌细胞和淋巴细胞的DNA含量介于二倍体和四倍体之间（图16B类). 重要的是，在所有病例中，在新形成的EGFP中只检测到两条12号染色体^{销售时点情报系统}肌细胞(图4一个和B类). 因此，CSC的给药导致心肌再生，这在很大程度上独立于细胞融合。

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图4。

在缺乏细胞融合的情况下，CSC的给药可促进再生。(一个和B类)新形成的EGFP显示了12号染色体（白点）的核定位^{销售时点情报系统}-α-肌动蛋白^{销售时点情报系统}梗死患者的（黄绿色）心肌细胞(一个)并且幸免于难(B类)心肌。

在梗死边缘区域，Ki67的百分比^{销售时点情报系统}、EGFP^负未经治疗和CSC治疗的心脏中的心肌细胞相似（分别为0.45±0.13%和0.48±0.18%）（表2，发表于支持信息在PNAS网站上）。同样，未经治疗和CSC治疗的心脏边缘区毛细血管的长度密度相似（3152±489 mm/mm^三和3312±541毫米/毫米^三（表2）。这些数据表明，注射的CSC没有发挥旁分泌作用，促进存活心肌中备用心肌细胞的生长或血管的生长。有趣的是，在接受治疗的心脏中，EGFP的显著比例^{销售时点情报系统}心肌细胞核为Ki67^{销售时点情报系统}（图17，发布为支持信息表明梗死后5周，这些CSC衍生的心肌细胞尚未达到终末分化和生长停滞，而是具有剩余的分裂能力。

EGFP的跨冠状动脉迁移^{销售时点情报系统}CSC。为了获得CSCs穿过冠状血管壁并到达受损心肌的能力的直接证据，对接受90分钟冠状动脉闭塞后再灌注的大鼠注射EGFP^{销售时点情报系统}CSC。然后评估CSC的移动体外罗丹明标记葡聚糖灌注冠状血管后的双光子显微镜观察(图5; 另请参见图18，其发布为支持信息在PNAS网站上）。然后用福尔马林固定组织，并通过免疫染色和共焦显微镜进行详细分析。在再灌注后4小时和CSC分娩后20分钟，大量EGFP^{销售时点情报系统}在冠状血管内发现了细胞（图18一个). 表皮生长因子^{销售时点情报系统}细胞在血管壁上迁移，并在3h内迁移到缺血区(图5). 在再灌注后12小时和注射CSCs后8小时，EGFP^{销售时点情报系统}在血管断裂和荧光葡聚糖弥散分布的心肌区域内的组中检测到细胞（图18B类). 因此，CSC的动脉内输送导致其外渗，并在数小时内回到心脏的间质室。CSCs的免疫印迹分析显示CXCR4在这些细胞中表达（图19，发表于支持信息在PNAS网站上）。这一发现，再加上之前的发现，即SDF-1在缺血再灌注心肌中上调(22)，表明SDF-1/CXCR4轴在CSC归巢到损伤组织中发挥作用。

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图5。

CSC穿过冠状动脉壁，向心肌迁移。(一个)多种EGFP的双光子显微镜检测^{销售时点情报系统}细胞注射20分钟后，位于冠状血管管腔内的克隆原性CSC（绿色）（罗丹明标记的右旋糖酐；红色）。(A–E)EGFP的跨冠状动脉迁移^{销售时点情报系统}CSC对心肌的作用；同一领域的图像(A–E)每隔30分钟取一次，从这些细胞血管内输送后30分钟开始。箭头指向穿过血管壁转移的细胞(C–E). 箭头指向相同的EGFP^{销售时点情报系统}双光子显微镜检测活组织中的CSCs(E类（绿色），并通过共焦显微镜对心室壁的相同区域进行固定、埋入和染色后(F类，绿色）。心肌细胞被心肌肌球蛋白（洋红）染色，细胞核被DAPI（蓝色）标记。共焦显微图像中的红色荧光显示冠状动脉循环（罗丹明标记的右旋糖酐，红色）。(插入)叠加E类和F类.双光子显微镜：焦深，20μm。共焦显微镜：断面厚度，10μm。（棒材，20μm）

讨论

产后心脏通常被认为是一个终末分化的有丝分裂后器官。然而，这一观点最近被一项发现所驳斥，即成年心脏中含有表现出多能干/祖细胞标志物和表型的原始细胞(8–12). 我们假设成年CSC是最适合心脏再生的基质。尽管造血干细胞、骨骼肌成肌细胞、新生儿心肌细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞都已被使用，但每种方法都有其局限性(1,23,24).

本研究的显著结果可概括如下：(我)注射到冠状动脉循环中的CSC能够在数小时内穿过血管壁进入心脏间质；(ii（ii）)血管内注射CSC可产生定量的重要组织再生，包括心肌细胞和血管结构（内皮细胞和平滑肌细胞），从而恢复梗死区域的心肌细胞数量；(三)这种解剖重建与左室重构和功能障碍的有利影响有关，包括左室扩张和室壁变薄的减弱以及收缩性能的改善；(iv（四）)CSC在梗死区和非梗死区产生新的心肌细胞，尽管这两种情况下细胞的表型不同；(v（v）)EGFP的形成^{销售时点情报系统}肌细胞不是由于细胞融合，因此反映了CSC分化为新的肌细胞；和(不及物动词)CSC似乎不通过旁分泌作用促进存活细胞的生长。重要的是，CSC的有益作用是在短暂缺血后再灌注的情况下观察到的，这与大多数MI患者相关，并且使用患者容易获得的CSC给药途径。

以前的研究已经证明，永久性冠状动脉闭塞后，当心肌内注射梗死周围区域时，CSC有能力再生梗死心肌(9,12). 据报道，静脉注射CSC后，再生程度也很低(10). 本研究揭示了前文未述及的CSC介导的心脏修复的几个基本方面，即：(我)CSCs能在冠状动脉再灌注时有效修复梗死心肌(ii（ii）)CSC在血管内注射时有效(三)血管内CSC影响的心脏再生导致重要的心脏功能改变，以及(iv（四）)CSC的有益效果不是由于细胞融合。

本研究最有趣的发现之一是认识到CSC可以分化为两种细胞群（分化不良的小肌细胞和具有成人特征的大肌细胞）。小心肌细胞位于梗死区（图。三一个和B类而大的位于梗死周围区域和远处心肌（图。​（图3E类三E类和9）。尽管支配CSC分化为大小实质细胞的因素尚不清楚，但似乎有理由假定，与成熟心肌细胞和旁分泌因子的接触可能在CSC谱系承诺后决定细胞的最终大小方面发挥作用。

本研究也为CSC重建死亡心肌组织的机制提供了见解。尽管骨髓细胞与靶器官的常驻实质细胞融合在其他系统中已有记录(25–29)，这一现象不能解释本研究中观察到的CSC的有益影响，因为所有EGFP^{销售时点情报系统}用两种独立的方法发现细胞为二倍体。此外，EGFP数量的相似性^NEG公司Ki67号机组^{销售时点情报系统}对照组和CSC处理的心脏之间的心肌细胞和毛细血管密度表明，CSC对存活的心脏细胞没有旁分泌促生长作用。总的来说，我们的结果表明血管内CSC位于梗死心脏，在那里他们致力于心肌细胞谱系，取代死亡心肌。在本研究中，通过将CSC与车辆进行比较来评估CSC。我们没有检查对照细胞群体（即非生殖细胞群体）的生理效应或再生能力。

我们的发现对急性心肌梗死和缺血性心肌病患者的治疗具有明显的转化意义。虽然这里使用的CSC是从同基因供体获得的，但在临床上，自体CSC可以从小的心肌活检中分离出来，扩大范围在体外然后给同一患者服用。初步结果支持该方法的可行性（R.B.和P.A.，未公布的数据）。预防性采集CSC，然后进行冷冻保存，可以确保在患者患有急性心肌梗死时，有足够数量的细胞随时可用。

结论

本研究表明，CSC以临床相关方式交付时是有效的，这是临床翻译的明确前提，其有益作用的机制独立于细胞融合。本文报告的结果确立了CSC作为心脏再生的候选细胞，并支持一种新的方法，即收集、扩增和存储心脏自身的干细胞，以用于随后的治疗性修复。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：B.D.、R.R.、X.-L.T、J.K.、A.L.、S.D.P.、P.A.和R.B.设计的研究；B.D.、A.B.S.、K.U.、M.R.、B.W.、R.R.、D.T.、X.-L.T.、A.R.、J.K.、A.L.、G.H.和J.V.进行研究；B.D.、K.U.、J.K.、A.L.、G.H.、S.D.P.、P.A.和R.B.贡献了新的试剂/分析工具；B.D.、A.B.S.、K.U.、M.R.、B.W.、R.R.、D.T.、X.-L.T.、A.R.、J.K.、A.L.、G.H.、J.V.、S.D.P.、P.A.和R.B.分析数据；B.D.、J.K.、A.L.、P.A.和R.B.撰写了论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：CSC，心脏干细胞；左心室；心肌梗死。

参考文献