屏障-自整合因子需要在核膜内分离和包裹染色体，并组装核膜

摘要

自身整合障碍因子（BAF）是一种小的（10kDa）dsDNA结合蛋白，在后生动物中高度保守(1). BAF还结合LEM域核蛋白、层粘连蛋白和同源域转录激活物(2). 人类LEM域基因家族包括LAP2、emerin、MAN1和四个拟议成员：Lem2（NET-25）、Lem3、Lem4和Lem5(三). LEM域蛋白共享一个定义的基序，即LEM域，它介导与BAF的直接结合(4,5). LEM域蛋白影响许多活动，包括核组装、基因表达、DNA复制、肌动蛋白动力学和TGF-β家族下游的信号传递(6). BAF直接结合并抑制Crx和相关同源域转录因子的活性体内(7). BAF还与无生殖细胞的阻遏物竞争与emerin的结合在体外(8). 因此，BAF可能在多个水平上影响基因表达。BAF在核结构中的其他作用是通过其与核层粘连的直接结合而提出的(8)在后生动物细胞核中形成稳定的细丝。层粘连蛋白决定细胞核形状和机械稳定性，并支持基本功能，包括DNA复制和聚合酶II依赖性转录(9,10).

BAF、层粘连蛋白和LEM域蛋白似乎有特殊的关系。彼此可以直接绑定；例如，emerin可以与BAF和层粘连蛋白A形成稳定的三元复合物(8). 类似地，BAF直接与层粘连蛋白和所有测试的LEM域蛋白结合(2). 有趣的是，GFP-BAF在活细胞中具有高度的流动性，但仍能检测到并直接与emerin相互作用体内(11)表明BAF与层粘连蛋白和LEM域蛋白动态相互作用。

秀丽隐杆线虫是一种相对简单的后生动物，编码BAF（Ce-BAF）、一个B型层粘连蛋白（Ce-lamin）和三个LEM域蛋白。两种（Ce-emerin和Ce-MAN1）是核内膜的完整蛋白质，而第三种（Ce-Lem3）没有跨膜结构域(12). Ce-MAN1与人类MAN1同源，但与人类Lem2同源(三).秀丽线虫提供强大的体内用于研究BAF、层粘连蛋白和LEM域蛋白之间相互作用的系统(12–16)尤其是在胚胎发生过程中的核组装和拆卸。如RNA干扰（RNAi）介导的下调所示，Ce-lamin对生存能力至关重要(14). 建议Ce-BAF至关重要(16). 在每种情况下，表型包括有丝分裂过程中的染色体分离缺陷、明显的后期桥接染色质、非整倍体和100细胞期的死亡。在缺乏Ce-lamin的细胞中，其他伙伴（Ce-emerin、Ce-MAN1和Ce-BAF）都无法围绕染色质聚集(14,15). 同样，在由两种LEM域蛋白（Ce-emerin和Ce-MAN1）编码的细胞中，Ce-lamin和Ce-BAF的有丝分裂后重组是有缺陷的(15). 这些发现为有丝分裂期间BAF功能提供了两种相互排斥的模型。在第一种模型中，Ce-BAF组装成重整核依赖于Ce-lamin和LEM域蛋白。该依赖模型预测，Ce-lamin和LEM-结构域蛋白将在缺乏Ce-BAF的细胞中正常组装。另一个相互依赖模型预测Ce-lamine和Ce-emerin将无法在缺乏Ce-BAF的电池中正确组装。为了测试这些模型，我们描述了Ce-BAF的RNAi介导的下调表型。我们的结果证实Ce-BAF-秀丽线虫胚胎发生。此外，我们的研究结果强烈支持有丝分裂期间BAF功能的相互依赖结构模型，并揭示Ce-BAF的丢失会破坏子染色体的分离状态。

材料和方法

秀丽线虫应变。 秀丽线虫N2菌株来自秀丽线虫基因组中心并按说明培养(17).秀丽线虫表达GFP的株AZ212融合到组蛋白H2B（H2B-GFP）是J.Austin（芝加哥大学）赠送的礼物。菌株JK2049，表达由远端细胞（DTC）特异性驱动的GFP拉格-2启动子，由J.Kimble（麦迪逊威斯康星大学）构建，从秀丽线虫基因组中心。

抗体、间接免疫荧光染色和免疫印迹。成人秀丽线虫按照说明固定并准备好进行间接免疫荧光染色(12). 大鼠抗Ce-BAF血清3778和3779以1:100的稀释度用于间接免疫荧光。兔抗Ce-BAF血清3280以1:1000的稀释度用于免疫印迹。血清3778(15)针对肽抗原（包含Ce-BAF残基28–41）和3280进行培养。针对合成锁孔帽贝血蓝蛋白结合肽（包含Ce-BAF残基65–80）培养血清3779。BAF血清3778通过结合BAF肽（还原-Imm还原试剂盒和磺灵试剂盒，Pierce）进行亲和纯化，并使用未稀释液进行间接免疫荧光；其他血清以1:50稀释[大鼠抗Ce-emerin血清3598(13)]，1:400[亲和纯化兔抗Ce-lamin Abs(14)]，1:100[大鼠抗Ce-MAN1血清3597(13)]或1:100[大鼠抗matefin血清3663(18)]. 磷甾酮H3 Abs（Upstate Group，Waltham，MA）和抗核孔蛋白单克隆抗体414（Babco，Richmond，CA）以1:100的稀释度使用。以1:200稀释度使用次级Cy3-共轭山羊抗鼠或抗兔抗体和FITC-共轭山羊抗大鼠或抗家兔抗体（Jackson ImmunoResearch）。

对于免疫印迹，蛋白质通过SDS/PAGE（15%丙烯酰胺）溶解，然后转移并用指示的抗Ce-BAF血清（1:1000稀释）或抗Ce-lamin血清3932（1:10000稀释）进行探测。对于图1B类在细菌中表达His-tagged Ce-BAF（pET28a载体中）和Ce-lamin（pET20载体中）蛋白，用8M尿素处理后溶解，用Ni纯化²⁺-NTA-agrose（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市），然后装入凝胶。对于图2B类,baf-1型(RNA干扰)取食后约56 h，从三个50 mm培养皿中采集对照蠕虫，用M9缓冲液洗涤，用次氯酸盐溶液（1.1%次氯酸和0.62 M NaOH）处理5 min，然后用M9洗涤，采集胚胎。对于蛋白裂解物，将胚胎与30μl 2×样品装载缓冲液（100 mM Tris·HCl，pH 6.8/20%甘油/200 mM DTT/4%SDS/0.2%溴酚蓝）混合，在液氮中冷冻，然后煮沸10 min。

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图1。

Abs对抗Ce-BAF(A类)人BAF（hBAF）和秀丽线虫BAF（ce-BAF）。相同和相似的氨基酸分别用黑色和灰色表示。黑线表示Ce-BAF的残基28–41（血清3778和3280的肽抗原）和残基65–80（血清3779的抗原）。(B类)类似数量的细菌表达Ce-lamin的免疫印迹(上部)或Ce-BAF(底部)在加载到凝胶上之前，这两种物质都用8 M尿素溶解（参见材料和方法)用抗Ce-BAF（αBAF）的免疫血清3778、3779或3280或抗Ce-lamin（αLam）的血清3932进行检测。(C类)混合阶段粗蛋白提取物的Western blot秀丽线虫用免疫前（P）或免疫（I）血清3280检测动物。(D类)野生型间接免疫荧光染色秀丽线虫含有针对内源性Ce-lamin（绿色）、内源性Ce-BAF（血清3778，红色）和合并信号的抗体的胚胎（合并）。（比例尺，10μm）

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图2。

桥接染色质和分离染色质中核膜标记的定位baf-1型(RNA干扰)胚胎。(A类)Ce-BAF蛋白在baf-1型(RNA干扰)胚胎。用血清3779进行间接免疫荧光染色，将内源性Ce-BAF定位在喂食空L4440载体的蠕虫胚胎细胞核中(赖特). (左侧)A类baf-1型(RNA干扰)DNA DAPI染色胚胎(左侧)和Ce-BAF(居中); Ce-BAF蛋白信号显著降低。箭头表示细胞核异常浓缩染色质。箭头表示后期带脊的染色质。（巴，10μm）(B类)蛋白质裂解物的免疫印迹baf-1型(RNA干扰)胚胎，lmn-1型(RNA干扰)用抗Ce-lamin抗体检测喂食L4440空载体（对照）的胚胎或野生型蠕虫的胚胎(上部)或Ce-BAF（血清3280；下部). Ce-lamin蛋白水平未受影响，而Ce-BAF在baf-1型(RNA干扰)胚胎。(C类)有丝分裂磷酸化持续存在于后期酶脊染色质上。A典型baf-1型(RNA干扰)用DAPI（以可视化DNA）和Abs对组蛋白H3（PH3）上的有丝分裂磷酸表位进行胚胎双重染色。箭头表示有丝分裂细胞中的正常中期染色体。箭头表示三对不同的分离染色质，每一对由桥接染色质连接。PH3可染色桥接染色质，但不能染色分离的染色质。（巴，10μm）(D类)胚胎DAPI染色显示DNA，并使用针对以下内源性蛋白之一的抗体进行间接免疫荧光染色：核穿孔蛋白（mAb 414）、Ce-lamin、Ce-emerin、Ce-MAN1或matefin。箭头指向连接两个分离的染色质团的后桥染色质。414和翡翠染色图像中的箭头分别表示相应的分离染色质团中的一个或两个。（棒材，10μm）

显微镜和活细胞成像。透射电子显微镜秀丽线虫胚胎基本上是按照描述进行的(19); 固定剂由2.5%新鲜制备的多聚甲醛和2.5%EM-颗粒戊二醛（Agar Scientific，Essex，U.K.）在0.1 M Na-Hepes中组成，pH值7.0。使用配备荧光功能的蔡司Axioplan II显微镜对免疫染色的胚胎和细胞进行成像。对于活细胞成像，使用Axiocam电荷耦合设备摄像头和AxioVision图像分析包每隔2分钟或1.5分钟记录一次延时数据。

RNAi介导实验。 baf-1型将完整的cDNA亚克隆到喂食载体L4440中，并用于所述的16°C下的RNAi喂食(18). 用携带空L4440构建物的细菌喂养对照动物。对蠕虫进行活的活力和GFP荧光检测，或固定和染色进行间接免疫荧光检测。

结果

秀丽线虫和人类BAF有52%相同(图1A类). 我们培养了两份针对Ce-BAF残基28-41的独立多克隆血清（3778和3280）和一份针对Ce-BAF残基65-80的血清（3779）(图1A类; 看见材料和方法). 所有三种血清在免疫印迹上识别重组Ce-BAF(图1B类 下部)虽然血清3779信号微弱。无与重组Ce-lamin交叉反应(图1B类 上部). 全虫裂解物的免疫印迹分析显示主要17-kDa带(图1C类显示血清3280的结果）。免疫前血清无法识别该条带(图1C类)与抗原肽治疗竞争（数据未显示），因此具有特异性。血清3280是免疫印迹最好的，通过间接免疫荧光显示微弱信号（数据未显示）。血清3778在间期修饰核膜和核内部(图1D类)，与Ce-lamin共定位(图1D类; 另见参考。15)，并在有丝分裂过程中动态改变其定位，使其变得更具点状，定位在浓缩染色质附近，并通过终末期保留染色质（图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。血清3779识别Ce-BAF上的不同表位，也对细胞核染色，但包膜信号弱得多(图2A类).

Ce-BAF是必需的，在染色体分离中起作用。之前的一项RNAi研究表明Ce-BAF至关重要(16)但缺乏对下调效率的控制。为了严格确定Ce-BAF的功能缺失表型，我们使用RNAi介导的干扰来下调baf-1型在里面秀丽线虫胚胎。内源性Ce-BAF蛋白显著耗竭，如baf-1型(RNA干扰)胚胎血清3779染色[图2A类,baf-1型(RNA干扰)]与喂食空载体的对照胚胎的核信号相比(图2A类，L4440）。Ce-BAF蛋白的耗竭通过用血清3778对胚胎进行染色独立证实（数据未显示）。通过用血清3280（免疫印迹上最敏感的抗体）对等量的裂解蛋白进行免疫印迹，进一步证实了下调，显示Ce-BAF的水平降低了约90%，而Ce-lamin的水平则没有降低baf-1型(RNA干扰)胚胎(图2B类，中间车道）与未经处理的蠕虫相比(图2B类，控制）。缺乏Ce-lamin的细胞中Ce-BAF蛋白水平没有降低[图2B类,lmn-1型(RNA干扰)]. 因此，两种蛋白质都不需要另一种才能表达或稳定。Ce-BAF的损失是致命的，因为baf-1型(RNA干扰)胚胎发育不超过100细胞期。检测到两种主要表型：间期细胞核中异常浓缩的染色质(图2A类，箭头）和后继桥接染色质(图2A类，箭头）。这些结果证实了Zheng报告的染色体分离缺陷等。(16)，进一步表明Ce-BAF影响间期细胞核中的染色质结构（异常染色质凝聚）。为了进一步表征Ce-BAF缺失的有丝分裂细胞的表型，我们在以下研究中使用了后桥染色质作为标记。

在之前的一项关于Ce-emerin和Ce-MAN1下调细胞的研究中，在相邻的分离染色质丢失该标记物后很长一段时间内，后段带脊的染色质保留了组蛋白H3的有丝分裂特异性磷酸化形式(15). 我们想知道是否同样的异常是由Ce-BAF缺失引起的。对照组证实，针对磷酸组蛋白H3表位的抗体在有丝分裂染色体上发出强烈信号baf-1型(RNA干扰)胚胎[图2C类 赖特（PH3），箭头]如预期。有趣的是，这些抗体也优先识别后桥染色质，而不是分离染色质[图2C类 赖特（PH3），箭头]。我们不明白为什么有丝分裂修饰会持续存在于后期桥染色质上。然而，由于这种表型可能由Ce-BAF（本研究）的缺失或LEM-伙伴的缺失引起(15)这些蛋白质可能会聚集结构或喜剧片通路，以确保有丝分裂过程中的有效进展。与这一解释一致，Ce-BAF的下调也增加了有丝分裂所花费的时间；例如，对照细胞从前期快速进展到末期（2分钟），而在baf-1型(RNA干扰)单元格（数据未显示；请参见下文）。

为了进一步表征后索桥染色质，我们使用特异性抗体定位了五个内源性核膜标记：核穿孔蛋白（mAb 414识别的子集）、Ce-lamin、Ce-emerin、Ce-MAN1和matefin[一种内核膜的层粘连SUN-domain蛋白(18)]. 除了核孔蛋白的潜在暗点染色(图2D类，414，箭头），桥接染色质上未检测到这些标记(图2D类，图像中的箭头染色为层粘连、emerin、MAN1或matefin）。我们将这一结果归因于桥接染色质的持续有丝分裂磷酸化(图2C类)，预计会局部阻塞核外壳组件。

为了测试相互依赖的结构模型，我们检查了由每个桥连接的两块分离的染色质，以确定是否有标记蛋白在染色质表面组装成核边缘。作为核膜边缘定位的内部控制，我们发现一部分胚胎的相邻间期细胞仍显示核膜边缘染色。这些相邻的细胞可能还没有完全耗尽BAF，因为在大多数胚胎中，BAF染色的最有力窗口是baf-1型(RNA干扰)，Ce-lamin边缘组织在间期细胞中丢失（数据未显示）。在baf-1型(RNA干扰)用间期边缘染色法对胚胎进行的细胞桥接染色质检查显示，Ce-lamin、Ce-emerin、Ce-MAN1和matefin均与染色质表面相关，但仍呈斑块状，未能组装成连贯的核边缘图案(图2D类，见翡翠染色胚胎中的箭头）。相反，mAb 414识别的核通道蛋白亚群在分离的染色质上重新组装成褶皱但明显边缘状的图案(图2D类，414，箭头）。这一结果表明存在核膜，并且形成了核孔复合物（NPC）（如下所述）。事实上，需要Ce-lamin来隔离NPC，而不是组装NPC(14). 因此，Ce-BAF的缺失深刻地破坏了Ce-lamin和三种层粘连膜蛋白的有丝分裂后组装，有力地支持了核组装期间Ce-BAF、Ce-lamine和LEM域蛋白的相互依赖的结构作用。

BAF-缺失细胞的染色体分离不稳定。我们感到困惑，为什么所有细胞都没有被后期带脊的染色质所阻止。因此，我们使用延时显微镜来成像生活baf-1型(RNA干扰)有丝分裂过程中的胚胎。在这些实验中，RNAi结构被输入秀丽线虫稳定表达H2B-GFP的动物，可以直接观察活细胞中的染色体(图3) (20). 早在双细胞时就检测到了间期分裂染色质(图2D类，emerin染色）和四细胞(图3A类)阶段。差异干涉对比显微镜（DIC）成像表明，许多具有桥接染色质的子细胞可以完成胞质分裂(图3A类 中部和底部). 实时成像进一步表明，细胞之间的分离缺陷在性质上存在差异，可能是因为Ce-BAF水平在不同的时间下降到临界阈值以下。例如，图3B类显示染色质桥接后每隔2分钟记录的子细胞。在后期，桥接染色质似乎通过并入子核而溶解(图3B类，8-12分钟）。我们不能严格排除这种分辨率是光漂白伪影的可能性。然而，反对这种人工制品，我们也看到了相反的表型（见下文）；此外，在胚胎早期分裂期间，桥接染色质分解的细胞比例较高（数据未显示），这可能是因为母体Ce-BAF的残留水平足以缓慢修复桥接染色素。第二个染色质表型如图3C类在前中期，从染色质凝聚开始每隔1.5分钟记录一次。凝集出现异常（不均匀；注意两个明显的染色质团块图3C类，时间0），但导致明显正常的中期(图3C类1.5–3分钟）。在早期后期，只有少量桥接染色质可见(图3C类4.5和6分钟）。值得注意的是，在接下来的4分钟内，大部分看似分离的染色质未能留在新生细胞核中，并返回到中间区域(图3C类（9–13.5分钟），并在中区停留至少5分钟以上（数据未显示）。在最有效的窗口期内检测的27个细胞中baf-1型(RNA干扰)在随后的25分钟内，11个细胞（40%）溶解了染色质桥，15个细胞（55%）塌陷回到中间区域，没有正常分离。只有一个细胞（5%）出现正常染色体分离。这些表型表明，Ce-BAF或与Ce-BAF相互结合的纹层网络，或两者，是稳定或捕获新生细胞核内分离的染色体所必需的。

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图3。

桥联染色质的动力学行为baf-1型(RNA干扰)胚胎。(A–C)成人秀丽线虫稳定表达H2B-GFP的细菌喂食表达Ce-BAF dsRNA的细菌。（Bar，10μm）(A类)对应H2B-GFP(顶部)，驾驶员信息中心(中间），并合并H2B-GFP/DIC图像(底部)四细胞胚胎；尽管存在桥接染色质，但子细胞仍经历了胞质分裂。(B类)桥形成后每隔2分钟记录一次活胚胎中H2B-GFP的时间推移图像；明显桥接的染色质最终分解为子核。(C类)H2B-GFP在活胚胎中的时间推移图像，从前中期（0分钟）开始每隔1.5分钟记录一次，此时染色体凝聚不均匀。在一个明显正常的中期（1.5–3分钟）后，大多数染色质分离（4.5–7.5分钟），但随后又回到中间区域（10.5–13.5分钟；见正文）。

BAF耗尽的子核膜不能完全封闭染色质，可能使分离的染色质逃逸。核通道蛋白在新生细胞核中的明显组装baf-1型(RNA干扰)单元格(图2D类)建议但没有证明存在核膜和NPC。因此，我们修复并精简了baf-1型(RNA干扰)胚胎，并使用EM可视化任何核膜或NPC(图4). 高倍镜显示了分离染色质块上许多典型的鼻咽癌轮廓(图4C类，箭头）。染色质分离的大区域与两个核膜相邻(图4A类和B类，另请参见支持文本和图7，发布为支持信息在PNAS网站上），证明Ce-BAF缺失并没有严重破坏对分离染色质的膜靶向或膜融合。然而，观察到两种显著的表型：染色质不均匀浓缩，以及核膜与分离染色质没有关联的大间隙。在至少62%的成像细胞核中检测到这种间隙(n个=125），并且这个百分比是最小的，因为在这些切片中出现未加标的细胞核可能在不同的切片中显示了间隙。在空白L4440矢量馈入的控件中(n个=130），所有细胞核均完全封闭（数据未显示）。图中箭头所示的大多数间隙。​图4A类4A类和7，与桥接染色质相关，表明Ce-BAF在某种程度上需要(我)完全分离(ii（ii）)保持隔离，或(三)捕获新生包膜内分离的染色质。90%的人检测到异常浓缩的染色质baf-1型(RNA干扰)核成像(n个= 113). 然而，冷凝缺陷没有明显的模式。块状浓缩染色质要么与核膜相关(图4B类，箭头），或核内（图7A类)或两者兼而有之（图7B类). 剩余染色质的凝聚状态类似于桥接染色质(图4B类 赖特，星号）。我们的结论是，Ce-BAF介导了核组装所需的染色质结构变化，以及新生核膜对染色质的捕获。

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图4。

核形态baf-1型(RNA干扰)胚胎。可视化baf-1型(RNA干扰)用薄片透射电镜观察胚胎。(A类和B类)左侧和右侧的图像分别表示黑线所示区域的低倍和高倍视图。大多数核在其核膜中有一个很大的缺口（缺口边缘用箭头表示A类和B类)推测桥接染色质的位置。箭头在A类表明线粒体靠近桥接染色质。箭头在B类显示中央染色质和更浓缩的外周染色质之间的边界。(B右侧)星号表示染色质外观与桥接染色质相似。(C类)染色质分离的高放大率视图baf-1型(RNA干扰)胚胎显示出密集的NPC（箭头）。每个图像中都标记了比例尺。Nu，核质；细胞色素，细胞质。

baf-1（RNAi）治疗后存活的胚胎有DTC迁移缺陷，并且是不孕的。在不完全RNA干扰的条件下，52%的胚胎逃过了胚胎停滞期，并在幼虫期继续发育。成年后，许多逃亡者的性腺较小或位置错误。第99页baf-1型(RNA干扰)逃逸者分析显示，12%的人因肠或性腺（或两者）外化而过早死亡，52%的人因性腺小或错位而不育(图5B类和C类，每个性腺臂上都标有星号），10%的人有bagof-worms表型，其中胚胎在内部孵化并杀死母亲，26%的人产下胚胎。在用空L4440载体处理的对照胚胎中，性腺形态正常(图5A类)97%的成年人产生了活的胚胎(n个=104）；其他表型罕见（≈1%爆裂，1%囊虫，1%不育）。我们的结论是，Ce-BAF的少量减少在胚胎发生期间并不是致命的，但随后会影响性腺发育。性腺表型表明许多细胞类型可能被破坏，可能包括指导性腺发育的DTC或相互作用的组织。为了具体测试DTC功能，我们下调了baf-1型在控制下表达GFP的蠕虫中拉格-2启动子（菌株jk2049），标记DTC(21). DTC通常分三个阶段引导迁移：首先，远离中体，然后，向上（腹侧到背侧），最后，回到中体(22). 孵化1周后对逃逸者进行检查。在喂食空L4440载体的母亲孵出的成年人中，两个DTC都位于蠕虫的中体(n个= 22;图5D类，箭头）。相反，75%的DTC定位不正确baf-1型(RNA干扰)幸存者(n个=20），如DIC图像中的箭头和右侧相应的GFP信号所示(图5E类和F类). 我们的结论是，Ce-BAF的轻微减少不是致命的，而是直接或间接干扰DTC迁移。其他类型电池的潜在缺陷仍有待调查。

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图5。

存活蠕虫的性腺形态和DTC迁移表型baf-1型(RNA干扰)治疗。(A类)DAPI染色的成虫是从喂食空L4440载体的母亲的胚胎中孵化出来的。性腺用星号标记。(B类和C类)两条DAPI染色的成虫从baf-1型(RNA干扰)-接受治疗的母亲。用星号标记的性腺很小，放错了位置。(D类)由喂食空L4440载体的JK2049菌株母亲的对照胚胎孵化的成虫，通过DIC成像(左侧)和GFP荧光(赖特); GFP标记DTC。(E类和F类)两条成虫从baf-1型(RNAi）-治疗JK2049的母亲，DIC成像(左侧)和GFP荧光(赖特). (D-F公司)驾驶员信息中心（DIC）图像中的箭头表示DTC位置异常E类和F类，或正常位于D类.

讨论

Ce-lamin和三种核膜蛋白（Ce-emerin、Ce-MAN1和matefin）未能在Ce-BAF-depleted细胞中正确组装，这有力地支持了BAF、层粘连蛋白和LEM-结构域蛋白在有丝分裂后核组装中相互依赖的结构作用。早期胚胎依靠母体提供的蛋白质和mRNA来完成胚胎发育。由于染色质和有丝分裂表型早在双细胞阶段就可见，因此我们得出结论，Ce-BAF具有有效染色体分离、有丝分裂进展和核组装所需的直接结构作用。Ce-BAF的下调最终导致胚胎在≈100细胞期（原肠胚形成）死亡，这与RNA聚合酶II的无效突变导致的停滞期相同(ana-1型)或将胚胎浸泡在强效聚合酶II抑制剂α-阿曼汀中(23). The timing ofbaf-1型(RNA干扰)因此，致死性与Ce-BAF在胚胎基因表达中的重要作用一致，但并没有证明。性腺表型baf-1型(RNA干扰)逃逸者也支持Ce-BAF在基因表达中的作用。我们假设这些胚胎通过在RNAi下调生效或达到最大效率之前或之后发育而逃过胚胎致死。性腺表型可由许多不同的机制引起，包括引导发育中U型性腺每个臂的DTC迁移缺陷。DTC迁移涉及整合素(24)并受肌肉细胞和DTC分泌的内特异性和独立导向系统调节(25). 我们假设无菌baf-1型(RNA干扰)逃逸者有足够的Ce-BAF通过有丝分裂并存活下来，但Ce-BAFs轻度减少，随后干扰了组织特异性基因的表达。众所周知，BAF可以调节哺乳动物视网膜细胞中的基因表达：BAF直接与Crx和相关同源域转录激活物结合，并阻断Crx依赖的基因表达体内(7). 有趣的是，BAF也直接结合在体外至Otx2(7)，一种转录因子，直接调节编码粘附分子的基因和参与形态发生细胞运动的分泌信号蛋白(26,27). 因此，我们推测baf-1型(RNA干扰)逃逸者可能具有本研究中未检测到的额外（潜在的细微）组织特异性表型。

我们的有丝分裂研究结果与以前使用显性负性策略研究BAF的研究一致。染色体凝聚缺陷和核组装阻滞与爪蟾核组装提取物，外源BAF促进染色质去凝聚和核生长（当低过量添加时），或相反，促进染色质高凝聚和核组装停滞（当高过量添加时）(28). 我们的结果也与人类细胞研究相一致，在人类细胞研究中，显性阴性BAF突变体破坏了emerin和A型层粘连蛋白在有丝分裂后募集到组装核膜中(29).

BAF的遗传空表型以前在黑腹果蝇，基于删除整个D-BAF编码序列的删除(30). 基因无效表型，即使是基本基因，在果蝇属直到幼蛹过渡期，母体贡献的mRNA和蛋白质最终耗尽。D-BAF缺失导致染色质组织缺陷和异染色质样染色质团块的出现，与我们早期的发现类似秀丽线虫Ce-BAF的胚胎下调。BAF-null的其他结构表型果蝇属包括层粘连蛋白B的异常分布和间期细胞的异常核形状(30). 相比之下，没有报道过后期带脊的染色质或有缺口的核膜，可能是因为BAF缺乏果蝇属细胞未能进入有丝分裂。值得注意的是，D-BAF的丢失与细胞周期蛋白A、B和E的表达减少以及进入S期的次数减少相关，这强烈表明D-BAF丢失会干扰细胞周期进展所需基因的表达(30).

昆虫和苍蝇表型之间的相似性支持了BAF在间期和核组装期间染色质组织中具有保守作用的假设。重要的是，这些差异揭示了需要BAF的功能范围，并突出了RNAi和基因缺失策略的互补性。RNAi方法导致早期胚胎中Ce-BAF的相对快速消耗，暴露出有丝分裂表型。早期胚胎只有细胞周期的S期和M期，并且分裂非常迅速。早期胚胎对通常会触发检查点的条件也相对不敏感，因为相对于细胞核而言，它们的细胞质体积较大(31,32). 我们认为这就是为什么Ce-BAF缺失细胞能够继续分裂的原因。在发育后期，当胚胎基因真正开始表达，细胞获得两种G₁和G₂细胞周期的各个阶段，包括基因表达在内的其他BAF依赖功能的表型都会暴露出来。在体细胞周期条件下，BAF-null可能非常重要果蝇属G期胚胎阻滞₁G水平显著降低₁（和其他）细胞周期素(30). 总之，我们认为BAF的表型无效果蝇属胚胎主要反映了进入S期所需BAF染色质或基因调节功能的丧失，而BAF的下调表型秀丽线虫早期胚胎揭示了BAF在有丝分裂和核组装中的结构作用。

我们的结果强烈表明Ce-BAF(我)在有丝分裂和核组装期间调节染色质结构的变化，以及(ii（ii）)LEM域蛋白和层粘连蛋白需要在染色质表面聚集。我们的结果还表明，Ce-BAF可能在结构上将染色体分离与核膜组装联系起来。我们认为Ce-BAF及其伙伴（Ce-lamin和LEM-domain蛋白质）的联合通过促进新生核膜对染色体的捕获（附着），在某种程度上稳定了分离染色体。与此模型一致，具有突变层粘连蛋白B1的小鼠细胞具有染色体分离缺陷，并且是多倍体(33). 进一步支持这一模型，人类BAF在后期与端粒上的LAP2α共定位(34)然后在分离染色质的前表面和后表面形成暂时稳定的核心结构(29,34). 核心结构只持续4-6分钟，似乎招募和浓缩某些核膜蛋白（例如，emerin），而在核膜组装早期排除其他蛋白（例如LBR）。LAP2α随后扩散到核内部，而膜蛋白和层粘连蛋白则沿核膜扩散。在这种情况下，我们秀丽线虫表型与Ce-BAF可能正常稳定端粒相关核心结构的观点一致，该结构负责捕获新生核膜内新分离的染色质。

补充材料

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：BAF，barrer-to-autointegration factor；RNA干扰；Ce中，秀丽隐杆线虫; 微分干涉对比显微镜；DTC，远端尖细胞；NPC，核孔复合体。

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