细胞核转移的ACSS2促进溶酶体生物发生和自噬的基因转录

ACSS2 S659磷酸化使ACSS2的NLS与importinα5结合

为了确定ACSS2是否包含一个仅在AMPKα依赖的ACSS2磷酸化后才暴露用于重要蛋白结合的NLS，我们将靠近ACSS2羧基末端的假定NLS序列（氨基酸656–668）中的Arg 664/665突变为丙氨酸(图2A). 免疫荧光(图2B)和细胞分离(图2C)分析表明，与野生型（WT）ACSS2不同，Flag-ACSS2 R664/665A在葡萄糖缺乏时不能易位到细胞核。这一结果表明，ACSS2中含有R664/665的NLS对葡萄糖缺乏诱导的ACSS2核移位至关重要。

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图2

S659处的ACSS2磷酸化使ACSS2的NLS与importinα5结合

（C–H）使用所示抗体进行免疫印迹分析。

（A）ACSS2示意图，显示NLStradamus工具预测的潜在NLS。

（B和C）表达所示Flag-ACSS2蛋白的U87细胞被剥夺葡萄糖1小时。使用抗Flag抗体进行免疫荧光分析，并使用ImageJ软件程序对每组20个细胞中的核ACSS百分比进行量化（右面板）(B类). 制备了总细胞裂解物、细胞溶质和核组分(C类). 采用双尾学生t检验。*表示P<0.001。（D）表达所示SFB标记的导入蛋白α蛋白的U87细胞被剥夺葡萄糖10分钟。用链霉亲和素琼脂糖珠进行下拉试验。

（E）U87细胞被剥夺葡萄糖10分钟。用抗importinα5抗体进行免疫沉淀。

（F）去除或不去除重要蛋白α5的U87细胞的葡萄糖1小时。制备总细胞裂解物以及细胞溶质和核部分。

（G）在存在或不存在活性AMPK的情况下，将纯化的GST-importinα5与所示纯化的His-ACSS2蛋白混合。进行GST下拉分析。

（H）表达所示Flag-ACSS2蛋白的U87细胞被剥夺葡萄糖10分钟。用抗Flag抗体进行免疫沉淀。

（I）将ACSS2 S659A或R664/665A敲除的亲代和所示U87细胞的葡萄糖剥夺1小时。用抗ACSS2抗体进行免疫荧光分析。使用ImageJ软件程序对每组20个细胞中的核ACSS百分比进行量化（右侧面板）。采用双尾学生t检验。*表示P<0.001。

另请参见图S2.

Importinα作为一个适配器，将含有NLS的蛋白质与Importinβ连接起来，然后将三元复合物停靠在核孔复合物上，以促进这些蛋白质跨核膜的移位。已在人类中鉴定出六个重要的α家族成员（α1、α3、α4、α5、α6和α7）(Yang等人，2012年). 葡萄糖剥夺诱导ACSS2与SFB标记的导入蛋白α5结合，但与导入蛋白α1、α3、α4、α6或α7不结合(图2D). 联合免疫沉淀试验证实，葡萄糖剥夺后内源性ACSS2与内源性进口蛋白α5结合(图2E). 此外，使用KPNA1（编码importinα5）短发夹RNA消耗importinα5，在很大程度上阻断了葡萄糖剥夺诱导的ACSS2核转位(图2F)表明importinα在ACSS2核转位中起重要作用。

为了确定AMPK介导的ACSS2 S659磷酸化是否在ACSS2与导入蛋白α5的结合中发挥作用，我们在存在或不存在纯化的His-AMPK和/或AMP的情况下，将纯化的WT His-ACSS2、His-ACS2 S659A或His-ACSS2 R664/665A与GST-importinα5混合。如所示图2G，WT-His-ACSS2单独不与importinα5结合。然而，在AMP存在但不存在的情况下加入AMPK可使ACSS2与importinα5相互作用。相反，包括His-ACSS2 S659A或His-ACS2 R664/665A(图2G)或存在化合物C(图S2A)抑制ACSS2与importinα5的结合。这些在体外联合免疫沉淀试验证实，葡萄糖剥夺诱导内源性导入蛋白α5与WT标记-ACSS2结合，但与标记-ACSS S659A或标记-ACS2 R664/665A结合不明显(图2H). 这些结果强烈表明，AMPK对ACSS2 S659的磷酸化导致ACSS2 NLS中暴露分子内掩蔽的R664/665，以与导入蛋白α5结合，这是ACSS2核转位所必需的。

接下来，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除技术，在U87和U251胶质母细胞瘤细胞中用ACSS2 S659A、ACSS2 R664/665A或催化不活跃的ACSS2 T363K替换内源性ACSS2(图S2B和S2C) (Ingram-Smith等人，2006年). ACSS2 S659A和ACSS2 R664/665A的表达，其催化活性与WT ACSS2相当(图S2D)，阻断葡萄糖剥夺诱导的ACSS2核移位，如免疫荧光所示(图2I)和免疫印迹(图S2D)分析。值得注意的是，在S659中ACSS2 R664/665A的表达仍被磷酸化(图S2E). 相反，具有催化活性的ACSS2 T363K突变体(Ingram-Smith等人，2006年) (图S2C)仍然能够转移到U87和U251细胞的细胞核中(图S2F和S2G)表明观察到的ACSS2亚细胞重新分布与其催化活性无关。综上所述，这些结果表明AMPK磷酸化S659处的ACSS2，从而促进ACSS2与导入蛋白α5的结合以及随后的ACSS1核移位。

TFEB相关的ACSS2结合溶酶体和自噬基因的启动子区域并促进这些基因的表达

为了确定ACSS2的核功能，我们对其进行了免疫沉淀，分析了其相互作用的蛋白质(表S1)，并观察到只有在葡萄糖剥夺条件下，U87细胞中约70-kDa蛋白与ACSS2相互作用(图3A). 我们通过质谱法将该蛋白鉴定为TFEB(图S3A). TFEB通过协调溶酶体水解酶和膜蛋白的表达以及参与自噬的基因的表达，在溶酶体生物发生中发挥主基因的作用(Sardiello等人，2009年). 溶酶体生物生成和自噬都是维持细胞内氨基酸库的特殊需要(Perera等人，2015年). 结果表明，AMPK调节溶酶体的TFEB依赖性调节(Young等人，2016年). 据报道，哺乳动物雷帕霉素（mTOR）依赖的TFEB在S211的磷酸化靶点触发了14-3-3蛋白与TFEB的结合，导致TFEB滞留在胞浆中(Roczniak-Ferguson等人，2012年;Settembre等人，2012年). 免疫共沉淀分析表明，TFEB在U87细胞的细胞核中与ACSS2结合，但在胞浆中不结合(图3B). 正如预期的那样，葡萄糖剥夺抑制了mTOR活性(Mo等人，2015年;Shackelford和Shaw，2009年)导致TFEB与ACSS2的核移位和共定位(图S3C). 值得注意的是，TFEB的缺失和RNA抗干扰（r）TFEB R245/248A核易位缺陷突变体的重组表达(Roczniak-Ferguson等人，2012年)阻断葡萄糖剥夺诱导的TFEB核转位，但不阻断ACSS2的核转位(图S3B)表明TFEB和ACSS2分别转位到细胞核，在那里形成复合物。氨基酸提取或用mTOR抑制剂Torin 1处理诱导的mTOR抑制进一步支持了这一发现，该抑制剂不影响AMPK活性，导致TFEB而不是ACSS2的核移位(图S3C).

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图3

TFEB相关的ACSS2结合溶酶体和自噬基因的启动子区域并促进这些基因的表达

（B、G和I）对所示抗体进行免疫印迹分析。

（A）用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离带有或不表达Flag-ACSS2的U87细胞的Flag-ACSS2免疫沉淀物，并用考马斯亮蓝染色。所示蛋白带被切除以进行质谱分析，并鉴定为TFEB（肽命中，92）。

（B）U87细胞被剥夺葡萄糖1小时。制备细胞溶胶和核组分。用抗TFEB抗体进行免疫沉淀。

（C）亲代U87细胞和ACSS2 S659A、R664/665A或T363K敲除细胞的指定克隆被携带四个完整CLEAR元件串联拷贝的荧光素酶报告慢病毒感染。这些细胞在葡萄糖饥饿或不饥饿的情况下处理10小时。根据萤火虫荧光素酶活性测定转录。将萤光素酶活性标准化为从重复样品中获得的细胞数量。数据表示为三份样品的平均值±标准偏差（SD）。

（D）使用抗TFEB抗体对ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变敲除的父母和所示U87细胞进行1小时的葡萄糖剥夺。直方图显示了以总输入DNA的百分比表示的免疫沉淀DNA的数量。数据表示为三份样品的平均值±SD。

（E）对具有WT rTFEB或rTFEB-R245/248A重组表达的内源性TFEB-depleted U87细胞进行葡萄糖饥饿或不饥饿处理1 h。使用抗ACSS2抗体进行ChIP分析。直方图显示了以总输入DNA的百分比表示的免疫沉淀DNA的数量。数据以一式三份样品的平均值±标准差表示。

（F）和G）对ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变敲除的父母和指示的U87和U251细胞进行10小时的葡萄糖剥夺。定量聚合酶链反应（PCR）分析(F类)U87细胞中指示基因的mRNA(F类)U87和U251细胞的免疫印迹分析(G公司)用指示的抗体进行检测。对β-肌动蛋白mRNA水平的数据进行标准化，并以葡萄糖剥夺引起的折叠变化表示(F类).

（H）对ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变敲除的亲代和所示U87细胞剥夺葡萄糖10小时。对所示基因的mRNA进行定量PCR分析。对β-肌动蛋白mRNA水平的数据进行标准化，并以葡萄糖剥夺引起的折叠变化表示。数据表示为三份样品的平均值±SD。

（一）将具有ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变体敲除的亲本和指示的U87或U251细胞剥夺葡萄糖10小时。用指示的抗体进行免疫印迹分析。

另请参见图S3、S4、S5和表S1、S2、S3.

为了确定ACSS2 S659磷酸化在ACSS2和TFEB相互作用中的作用，我们耗尽U87细胞中的内源性ACSS2并表达NLS-ACSS2 S659A融合蛋白(图S3D)，含有SV40大T抗原和ACSS2 S659A的NLS，定位于细胞核中，无糖剥夺(图S3E). 葡萄糖剥夺诱导NLS-ACSS2 S659A与TFEB结合(图S3F). 这些结果表明，ACSS2 S659磷酸化是其核转位所必需的，并不直接参与与TFEB的相互作用。

接下来，我们在ACSS2 R664/665A敲除U87细胞中表达TFEB R245/248A(图S3G)并揭示了它们在葡萄糖缺乏时的相互作用(图S3H). 这些结果表明，通过AMPK依赖性mTOR抑制从14-3-3释放的细胞溶质和进口蛋白结合缺陷的TFEB R245/248A能够与细胞溶质或进口蛋白结合缺乏的ACSS2 R664/665A结合。然而，WT TFEB没有绑定到ACSS2 R664/665A，这表明importin绑定到TFEB的能力比ACSS2 R 664/665A更强。免疫印迹分析证实了这一发现，进口蛋白8（IPO 8）的缺失是TFEB核易位的特异性(Perera等人，2015年)，使WT TFEB与ACSS2 R664/665A结合以应对葡萄糖缺乏(图S3I). 这些结果强烈表明，葡萄糖剥夺导致AMPK-磷酸化WT ACSS2和去磷酸化WT-TFEB可用于单独的核转位。

为了确定TFEB和ACSS2的相互作用区域，我们通过混合纯化的WT ACSS2、WT TFEB和ACSS2和TFEB的不同截短突变体进行了体外结合测定。图S3J显示非磷酸化WT ACSS2与非磷酸化的WT TFEB结合，并且它们的相互作用需要这两种蛋白质的N末端。此外，联合免疫沉淀分析没有检测到ACSS2与其他TFE家族成员的复合物形成(Perera等人，2015年)、TFE3、TFEC或MITF(图S3K)，表明ACSS2与TFEB特异性结合。

为了确定ACSS2与TFEB的结合是否调节TFEB转录活性，我们用含有协调溶酶体表达和调节（CLEAR）元件的荧光素酶报告慢病毒感染U87细胞，该元件是TFEB识别的基序。荧光素酶分析表明，葡萄糖剥夺通过敲除WT ACSS2在U87细胞中诱导TFEB激活。这种诱导在敲除ACSS2 S659A、ACSS2 R664/665A或ACSS2 T363K不活跃的U87细胞中受到很大抑制(图3C). 这些结果表明，TFEB的活化依赖于ACSS2的核转位及其催化活性。

TFEB激活上调溶酶体基因的表达，包括溶酶体酶组织蛋白酶A（由CTSA公司)，β-葡萄糖醛酸酶（由编码GBA公司)和β-葡萄糖苷酶（由编码GUSB公司)，以及溶酶体膜蛋白LAMP1（由灯1) (Sardiello等人，2009年). 用抗TFEB或ACSS2抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，葡萄糖剥夺导致TFEB结合(图3D)和ACSS2(图3E)到的启动子区域CTSA公司,GBA、GUSB、和灯1; 此外，结合TFEB和ACSS2分别被ACSS2突变体（S659A、R664/665A和T363K）的敲除和核转位缺陷rTFEB R245/248A突变体的重组表达所阻断。这些结果表明，TFEB和ACSS2与溶酶体基因启动子区的结合是相互需要的。与这些发现一致，葡萄糖剥夺诱导mRNA表达(图3F)和蛋白质(图3G)这些溶酶体基因的表达在很大程度上被ACSS2突变体（S659A、R664/665A和T363K）敲除。WT Flag-ACSS2的过度表达挽救了这些突变体的表达效果(图S4A). 相反，ACSS2 R664/665A的表达并没有改变葡萄糖缺乏预调节和非TFEB靶基因的mRNA水平第21页,cpt1c（cpt1c）、和细胞周期蛋白G(图S4B) (Bungard等人，2010年). 这些发现表明，ACSS2与溶酶体基因启动子区域的结合以及ACSS2的催化活性是这些基因表达所必需的。

众所周知，TFEB激活还上调了参与自噬形成的基因的表达(Perera等人，2015年)，而葡萄糖缺乏会增加自噬(Russell等人，2014年). 正如预期的那样，我们发现葡萄糖剥夺诱导了TFEB的结合(图S4C)和ACSS2(图S4D)到的启动子区域地图1LC3B,自动液位计3、和WIPI-1型以及mRNA(图3H)和蛋白质(图3I)这些基因的表达；这种诱导被ACSS2 S659A、R664/665A和T363K突变体的敲除所阻断(图3H和​和3I）第三章)而溶酶体抑制剂氯喹对ACSS2 R664/665A介导的LC3B表达的抑制没有影响(图S4E). 这些结果表明，葡萄糖剥夺增强自噬体基因表达（受核ACSS2/TFEB依赖性基因转录调控）不是由潜在溶酶体缺陷诱导的。此外，化合物C治疗阻断了葡萄糖剥夺诱导的GBM细胞自噬体和溶酶体基因的表达(图S4F)而ACSS2 R664/665A在H1299非小细胞肺癌细胞和PANC-1胰腺癌细胞中的重组表达(图S4G)也阻断了这些基因的表达(图S4H和S4I)溶酶体和自噬扩张(图S4J和S4K)这表明所观察到的效应与细胞系或肿瘤类型无关。值得注意的是，磷酸化模拟物ACSS2 S659D突变体的重组表达(图S4L)，在没有葡萄糖缺乏的情况下移位到细胞核(图S4M)，未能诱导TFEB依赖性基因表达(图S4N)表明ACSS2和TFEB的核易位是TFEB依赖性基因表达所必需的。

为了确定ACSS2和TFEB的全球基因组调控，我们使用抗ACSS2或抗TFEB抗体进行染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP–seq）实验。值得注意的是，我们发现81%的ACSS2靶基因也是TFEB靶基因，包括与自噬和溶酶体通路相关的基因(图S5A和S5B，表S2和S3). ACSS2与TFEB-ChIP结合位点结合对应的峰值得分具有显著相关性（皮尔逊相关系数=0.53，P<0.001）(图S5C). 此外，当葡萄糖缺乏时，ACSS2和TFEB-ChIP的信号在转录起始位点（TSS）区域（−1k到+1k bp）富集，ACSS2-ChIP的整体结合谱与TFEB-Ch IP非常相似(图S5D). 转录因子基序分析表明从头开始ACSS2和TFEB ChIP的基序具有高度一致性(图S5E). 两个基序的重叠区域对应于TFEB识别的E-box序列（5′-CANNTG-3′）。此外，ACSS2基序的左侧GT、TFEB基序的重叠区和右侧AC的组合与TFEB特异性识别的CLEAR-box序列（5′-GTCACGTGAC-3′）完全对应，该序列存在于许多溶酶体和自噬体基因的调控区。事实上，我们发现与溶酶体和自噬体途径相关的基因在ACSS2 ChIP峰值中显著富集（两种途径均P<0.001）(图S5F). 总之，这些结果支持TFEB与核ACSS2复合物的理论，TFEB结合到溶酶体和自噬体基因的启动子区域以促进这些基因的表达。

核ACSS2介导溶酶体和自噬体基因启动子区乙酰辅酶A的局部生成和随后的组蛋白H3乙酰化

ACSS2从醋酸盐中产生乙酰辅酶A(Watkins等人，2007年). 然而，常规DMEM中的葡萄糖缺乏和有限的醋酸盐含量限制了ACL从柠檬酸盐、PDC从丙酮酸盐和细胞溶质ACSS2从中摄取醋酸盐生成乙酰辅酶A。正如预期的那样，葡萄糖缺乏和定期DMEM培养导致U87细胞的核乙酰辅酶a水平大幅降低(图4A). 有趣的是，ACSS2 S659A、R664/665A和T363K的敲除导致核乙酰辅酶a水平进一步降低(图4A)，表明核ACSS2参与了核乙酰辅酶A的产生。与这一发现和揭示ACSS2与溶酶体启动子区结合的结果一致(图3E)和自噬体基因(图S4D)用抗总乙酰化组蛋白H3抗体进行的ChIP分析表明，葡萄糖剥夺诱导溶酶体启动子区组蛋白H4乙酰化(图4B)和自噬体(图4C)U87细胞中的基因。使用抗H3K9乙酰化和抗总乙酰化组蛋白H2B抗体也观察到类似的结果(图S5G和S5H). 重要的是，ACSS2 S659A、R664/665A和T363K突变体的敲除(图4B和​和4C）4摄氏度)或化合物C处理(图S5I)阻止组蛋白H3在这些启动子区域的乙酰化，而ACL或PDHA1的缺失对这种乙酰化几乎没有影响(图S5J). 值得注意的是，ACSS2 R664/665A的表达也阻断了自噬基因启动子中葡萄糖剥夺诱导的组蛋白H3 Arg17二甲基化(图S5K)已知H3 Arg17二甲基化受与TFEB复合物中协同激活物相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）的调节(Shin等人，2016年). 这些结果表明，核ACSS2在葡萄糖剥夺后溶酶体和自噬体基因启动子区的核乙酰辅酶A生成以及随后的组蛋白H3乙酰化和甲基化中起着重要作用。

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图4

核ACSS2介导溶酶体和自噬体基因启动子区乙酰辅酶A的局部生成和随后的组蛋白H3乙酰化

(A类–C类)将ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变敲除的亲代和所示U87细胞剥夺葡萄糖1h。测量核乙酰辅酶A水平(A类). 使用抗乙酰化H3抗体进行ChIP分析。用针对所示溶酶体启动子区域的引物进行PCR(B类)和自噬体(C类)进行基因检测。直方图显示了以总输入DNA的百分比表示的免疫沉淀DNA的数量。数据表示为三份样品的平均值±SD。

(D类和E类)在没有或存在TSA（500 nM）的情况下，U87和U251细胞被剥夺葡萄糖1小时。用考马斯蓝染色显示的酸提取组蛋白，用所示抗体进行乙酰化组蛋白水平的免疫印迹分析(D类). 制备细胞的细胞核部分，并测量细胞核乙酰辅酶A的水平(E类).

(F类)将ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变敲除的亲代和所示U87细胞剥夺葡萄糖1小时。用洋地黄素（30μg/ml）渗透细胞5分钟，并用所示浓度的乙酰辅酶A处理30分钟。使用抗乙酰化H3抗体进行ChIP分析。直方图显示了以总输入DNA的百分比表示的免疫沉淀DNA的量。数据表示为三份样品的平均值±SD。

另请参见图S5.

考虑到DMEM中外源性醋酸盐的数量有限，我们假设ACSS2利用脱乙酰化蛋白释放的醋酸盐生成乙酰辅酶A以进行表观遗传调控(Lyssiotis和Cantley，2014年). 由于组蛋白乙酰化的半衰期约为分钟，因此可以产生相当大比例的醋酸盐体内组蛋白乙酰化的周转(Comerford等人，2014年). 为了证实这一点，我们检测了U87和U251细胞中组蛋白H3、H4和H2B的总乙酰化水平，这些组蛋白在葡萄糖剥夺后显著降低(图4D)尽管我们在溶酶体和自噬体基因的启动子区域检测到组蛋白H3乙酰化增加。值得注意的是，用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对细胞进行预处理，该抑制剂阻止了葡萄糖剥夺诱导的三种组蛋白总乙酰化水平的降低(图4D)，降低核乙酰辅酶A水平(图4E)并且大大减少了溶酶体基因启动子区葡萄糖剥夺诱导的组蛋白H3乙酰化(图S5L)和这些基因表达(图S5M). 与这些结果一致，将乙酰辅酶A添加到常规DMEM培养的和挽救的洋地黄素通透性细胞中，可以抑制溶酶体启动子区组蛋白H3的乙酰化(图4F)和自噬体（数据未显示）基因在U87细胞中以剂量依赖性方式敲除ACSS2 S659A、R664/665A和T363K突变体(图4F). 综上所述，这些结果强烈表明溶酶体和自噬体基因启动子相关的ACSS2利用组蛋白乙酰化周转产生的醋酸盐生成乙酰辅酶A，这是溶酶体基因和自噬菌体基因启动区局部组蛋白H3乙酰化所必需的。

核ACSS2促进溶酶体生物发生和自噬

为了确定ACSS2核转位的功能后果，我们对U87细胞进行了免疫荧光分析，结果表明，在葡萄糖缺乏的情况下，溶酶体膜蛋白LAMP1的染色强度增加(图5A); 这种增加的染色被ACSS2 S659A、R664/665A和T363K突变体的敲除所阻断。同样，葡萄糖缺乏诱导的自噬，如内源性LC3B数量增加所证明的(图5B)和GFP-LC3 punta(图S6A)并增加LC3B-I到LC3B-II（LC3-I的磷脂酰乙醇胺衍生物）的转化(图3I)被ACSS2 S659A、R664/665A和T363K突变体的敲除抑制。一致地，U87细胞的电子显微镜分析表明，葡萄糖缺乏诱导每个细胞的溶酶体和自噬体数量显著增加，并且这种增加被ACSS2 R664/665A和T363K突变体的敲除所阻断(图5C). 正如预期的那样，24小时的葡萄糖剥夺降低了U87细胞的存活率，而ACSS2 S659A、R664/665A或T363K突变体的敲除大大提高了观察到的细胞死亡率(图5D)这表明，葡萄糖缺乏诱导的自噬和溶酶体生物生成是细胞生存应对这种代谢应激所必需的。

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图5

核ACSS2促进溶酶体生物发生和自噬

（A和B）将ACSS2 S659A、R664/665A或T363K敲除的亲代和所示U87细胞剥夺葡萄糖10小时。用抗LAMP1抗体进行免疫荧光分析(A类)和抗LC3B(B类)抗体。100个细胞的免疫荧光强度(A类)或20个细胞中LC3B点的数量(B类)使用ImageJ软件程序进行量化。

（C）将ACSS2 R664/665A或T363K突变敲除的亲代和所示U87细胞剥夺葡萄糖10小时。进行电子显微镜分析。蓝色和红色箭头分别指向溶酶体和自噬体（左侧面板）。对每组10个细胞中的溶酶体和自噬体进行定量（右图）。

（D）对ACSS2 S659A、ACSS2 R664/665A或T363K突变敲除的亲代和所示U87细胞进行24小时的葡萄糖剥夺，并用台盼蓝（0.5%）染色。对活细胞进行计数。

另请参见图S6.

实验模型和主题细节

组织学评价和免疫组织化学染色

将小鼠肿瘤样品固定并制备用于染色。样品用迈尔苏木精和伊红（BioGenex）染色。然后使用通用支架（研究遗传学）安装幻灯片。

根据制造商的说明，使用VECTASTAIN ABC试剂盒（加利福尼亚州VECTOR LABORATORIES）进行免疫组织化学染色。石蜡包埋异种移植物组织切片用抗ACSS2、ACSS2 pS659、LAMP1、LC3B或非特异性IgG抗体染色作为阴性对照。将石蜡包埋人GBM标本的组织切片用抗磷酸-ACC S79、磷酸-ACSS2 S659或非特异性IgG抗体染色作为阴性对照。我们根据前面定义的阳性细胞百分比和染色强度对组织切片进行定量评分(Li等人，2016年). 我们分配了以下比例分数：0表示0%的肿瘤细胞呈阳性染色，1表示0%至1%，2表示2%至10%，3表示11%至30%，4表示31%至70%，5表示71%至100%。我们还将染色强度评定为0至3:0，阴性；1、弱；2、中度；和3，强大。然后，我们将比例和强度得分结合起来，得出总分（范围：0，2-8）。所有患者术后均接受了标准的辅助放射治疗，随后使用烷基化剂（大多数情况下为替莫唑胺）进行治疗。首都医科大学机构审查委员会和德克萨斯大学安德森癌症中心批准使用人脑肿瘤标本和数据库。

细胞系和细胞培养条件

通过德克萨斯大学MD Anderson癌症中心和AMPKα1/2双敲除小鼠胚胎成纤维细胞（法国巴黎科钦研究所B.Viollet捐赠）、H1299人肺癌细胞、，和PANC-1人胰腺导管腺癌细胞保存在补充10%透析小牛血清（HyClone）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。

方法详细信息

体外激酶测定

激酶反应如前所述进行(Ji等人，2009年). 简而言之，纯化的重组AMPK或CAMKKβ（10 ng）与ACSS2或AMPKα（100 ng）在25μl激酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM KCl，5 mM MgCl）中培养₂，1 mM钠_三VO（旁白）₄50μM DTT，5%甘油，50μM ATP，10μCi的[γ³²P] -ATP）在25°C下放置1 h。添加SDS-PAGE负载缓冲液后终止反应，并加热至100°C。然后对反应混合物进行SDS-PAGE。

重组蛋白的纯化

His-ACSS2、His-ACS2截断、His-TFEB、Flag-ACSS2、His-TPEB截断、Flag-TFEB和谷胱甘肽的表达S公司-在细菌中诱导转移酶（GST）-导入蛋白α5，并按照前面所述纯化这些蛋白(Xia等人，2007年). 简言之，BL21（DE3）细胞表达（His）₆-在250 ml LB培养基中培养GST标记或标记的ACSS2、TFEB和importinα5，并在30°C下用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）处理16 h，然后通过超声裂解。在293T细胞中表达标记的WT AMPKα2和AMPKβ2 T172A重组蛋白。简单地说，将一个表达标记WT AMPKα2或AMPKβ2 T172A重组蛋白的pcDNA3.1质粒（10μg）转染到293T细胞中，接种在直径为15cm的培养皿中，汇合率为70%。转染48小时后，用新鲜DMEM培养细胞，补充10%牛小牛血清1小时，然后用非变性裂解缓冲液（20 mM Tris HCl pH 8.0，137 mM NaCl，1%NP-40）收获细胞。代表（他的）₆-标记的蛋白质、细胞裂解物被加载到Ni-NTA柱上（GE Healthcare Life Sciences），然后用五个20 mM咪唑柱体积进行洗涤，然后用250 mM咪唑啉洗脱。对于GST标记的蛋白质，将细胞裂解物加载到GSTrap HP柱（GE Healthcare Life Sciences）上，然后用五柱体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后用10 mM还原谷胱甘肽洗脱。对于标记蛋白，将细胞裂解物加载到含有ANTI-Flag M2琼脂糖亲和凝胶的柱上，然后用五个柱体积的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后用100μg/ml 3×Flag肽洗脱。10-kDa自旋柱中的蛋白质通过使用冰镇PBS洗涤两次来脱盐。然后将蛋白质装载到HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱（GE Healthcare Life Sciences）上，以去除受污染的蛋白质。使用SDS-PAGE和胶体考马斯亮蓝（G-250）染色检测纯化效率，具有优异的灵敏度（每条带低至1ng蛋白质）(Dyballa和Metzger，2009年).

免疫沉淀和免疫印迹分析

用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.5]、0.1%SDS、1%Triton X-100、150 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇、0.5 mM EDTA、100 M PMSF、100 M亮氨酸蛋白酶、1 M抑肽酶、100 M原钒酸钠、100 M焦磷酸钠和1 mM氟化钠）从培养细胞中提取蛋白质。细胞提取物通过13400 g离心澄清，上清液（2 mg蛋白质/ml）与所示抗体进行免疫沉淀。4点隔夜孵育后^°C、 添加蛋白A或G琼脂糖珠并再静置3小时。免疫复合物用裂解缓冲液洗涤3次，然后用前面描述的相应抗体进行免疫印迹分析(Lu等人，1998年). 使用Image Lab软件程序（Bio-Read）量化带强度。

转染

细胞密度为4×10⁵每60-mm直径培养皿转染前18小时。根据制造商的说明，使用HyFect转染试剂（新泽西州丹维尔科学公司）进行转染(Xia等人，2007年).

逆转录聚合酶链反应

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从培养的肿瘤细胞中提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）在20μl反应中对每个样品使用总RNA（1μg）。一微升cDNA文库用于25μl PCR。Fast SYBR Green Master Mix（Bio-Rad）用于使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad）确定每个样品的阈值循环（Ct）值。β-actin是这些研究中的正常化基因。目标基因的相对表达水平由2给出^ΔCt（β-actin的Ct减去目标基因的Ct）。PCR所用引物序列列于表S4.

质谱分析

从SDS-PAGE中切下通过考马斯亮蓝染色显示的蛋白带，并在含有RapiGest（Waters Corporation）的50 mM碳铵缓冲液中用200 ng改良序列级胰蛋白酶（Promega）在37°C下过夜。使用Orbitrap Elite质谱仪（Thermo Fisher Scientific）使用高灵敏度液相色谱-串联质谱法对消化后的样品进行分析。通过使用Mascot搜索引擎（2.3版；Matrix Science）和Proteome Discoverer软件程序（1.4版；Thermo Fisher Scientific），根据Swiss-Prot蛋白质数据库（EBI）搜索片段光谱来鉴定蛋白质。

实验

将等量的His标记纯化蛋白（200 ng/样品）与100 ng GST融合蛋白和谷胱甘肽琼脂糖珠在改良的结合缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH7.5]）中孵育、1%Triton X-100、150 mM NaCl、1 mM二硫苏糖醇、0.5 mM EDTA、100 M PMSF、100 M亮氨酸蛋白酶、1 M抑肽酶、100 M原钒酸钠、100 M焦磷酸钠和1 mM氟化钠）^°C.谷胱甘肽微球然后用结合缓冲液洗涤四次，结合蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前用4×Laemmli缓冲液煮沸。

细胞活力分析

2 × 10⁵将细胞接种在含有10%小牛血清的DMEM中，并进行或不进行葡萄糖剥夺。接种24小时后，用台盼蓝（0.5%）染色法对活细胞进行计数。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。

DNA构建与突变

将PCR扩增的人ACSS1、ACSS2、ACSS3、importinα5、importinα1、importinα4、importinα3、importinα6、importinα7、TFEB、TFEC、TFE3和MITF亚克隆到pCold I、pGEX-4T-1或pcDNA 3.1载体中。含有高保真度的PX458-HF质粒化脓性链球菌N497/R661/Q695/Q926A的Cas9突变(Kleinstiver等人，2016年)使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）构建pcDNA3.1 Flag-ACSS2 S659A、pcDNA3.1-Flag-ACSS2 R664/665A、pcDNA2.1 Flag-TFEB R245/248A、pCold I ACSS2 S659A，pColdⅠACSS2 R 664/665A和pColdⅡACSS2 T363K。PcDNA3.1 Flag-TFEB包含G959A、C960A和A962G的无义突变。

pGIPZ shRNA是通过将靶向人ACSS2、KPNA1或TFEB的寡核苷酸连接到Xho I/Mlu I消化的pGIPZ载体中而构建的，TRIPZ人ACSS2诱导型shRNA购自GE Dharmacon（Lafayette，CO）。

ChIP分析

使用SimpleChIP+酶染色质IP试剂盒进行ChIP。用10厘米培养皿中细胞制备的染色质测定总DNA输入量，并与特定抗体或正常小鼠IgG孵育过夜。PCR所用引物序列列于表S5.

ChIP–seq分析

根据Illumina的说明，使用NEB下一个DNA文库准备主混合集准备测序文库。这些文库在Illumina HiSeq 2000（德克萨斯大学MD Anderson癌症中心）上进行了单端测序。使用BWA v0.7.12将测序读数与hs37d5参考基因组对齐，然后使用sambamba v0.6.5去除重复读数(Tarasov等人，2015年). MACS2的callpeak函数与默认参数一起使用，从对齐结果调用峰值(Zhang等人，2008年). 为了注释MACS2调用的峰值，HOMER v4.8.3的annotatePeaks.pl函数与GENCODE19参考基因注释一起使用(Harrow等人，2012年). 然后，我们使用以下标准过滤带注释的峰：每个峰必须具有“启动子-TSS”注释，位于典型染色体内，并且峰值得分≥2。根据与TSS的期望距离，进一步过滤其余峰。

为了搜索峰周围区域中的基序，我们使用HOMER的findMotifsGenome.pl程序使用-S 5选项搜索五个基序，并使用-size 50选项将搜索区域限制为峰位置的+/-50bp。

总注释、溶酶体和自噬体基因集，摘自ENSEMBL GRCh37（n=63737），hLGDB数据库(http://lysomes.unipg.it（溶酶体）[n=443]）和HADb数据库(http://autophagy.lu【n=223】），用于通过超几何检验确定基因的ACSS2-或TFEB-结合区中的溶酶体和自噬途径是否显著富集(Brozzi等人，2013年;坎宁安等人，2015年;Moussay等人，2011年). 超几何检验采用R统计程序进行。Pearson相关系数使用R计算峰值得分，对应于ACSS2和TFEB ChIP-seqs中发现的过滤结合位点的结合。进行了1200万次排列测试，以确定相关性的显著性。使用deepTools软件套件中的bamCoverage、computeMatrix和plotHeatmap工具绘制热图(Ramirez等人，2016年).

免疫荧光分析

根据标准方案，将细胞固定并与稀释度为1:100的第一抗体、荧光染料偶联的第二抗体和DAPI一起孵育。使用反褶积显微镜（Zeiss，Thornwood，NY）和40倍油浸物镜检查细胞。使用蔡司的Axio Vision 4软件对Z系列图像进行去卷积。AxioVision 4模块联合定位（Zeiss，Thornwood，NY）用于反褶积图像的联合定位分析(Fang等人，2007年).

自噬分析

使用ImageJ和Analyse Particles Plugin从共聚焦图像中量化每个细胞的LC3B或GFP-LC3B点的总数（每个实验中应用的所有图像的恒定阈值）。每个条件下使用20个细胞进行定量。

细胞渗透

GBM电池（3×10⁶)被播种在10厘米的盘子里。然后按照前面所述进行细胞渗透(Salabei等人，2014年). 简单地说，用3×PBS清洗细胞，然后在30μg/ml洋地黄素/PBS中培养5分钟，然后用含有指示浓度乙酰辅酶A的DMEM处理。

亚细胞分离

在60-mm孔培养皿中，将60%汇合处的细胞进行指定时间的葡萄糖饥饿或2-DG处理。使用细胞核/胞浆分馏试剂盒（BioVision）从细胞中分离出细胞核和胞浆部分。核蛋白和胞浆蛋白用于免疫印迹分析。

核乙酰辅酶A浓度的测量

使用nuclei PURE Prep试剂盒进行细胞核的分离。简单来说，贴壁细胞（3×10⁶)用PBS洗涤后，在有裂解缓冲液的情况下从盘子中刮去。将悬浮在裂解缓冲液中的细胞置于1.8 M蔗糖梯度的顶部，然后在预冷摆桶式超速离心机中以30000×g离心45分钟。收集离心机底部的细胞核，并使用Nuclei PURE Prep试剂盒中提供的细胞核存储缓冲液进行清洗。通过免疫印迹评估细胞核纯度，并立即使用乙酰辅酶A荧光分析试剂盒测量分离细胞核中的乙酰辅酶a浓度。

组蛋白酸提取

电池（3×10⁶)悬浮在10ml培养基中的种子接种在10-cm的培养皿中，进行或不进行葡萄糖剥夺处理。收集细胞并在Triton提取缓冲液（含0.5%Triton X-100[v/v]、2 mM PMSF、0.02%NaN的PBS）中溶解_三[w/v]）。使用离心机收集颗粒，并使用Triton Extraction Buffer清洗两次，使用200μl 0.2 N HCl在4°C下提取组蛋白过夜。酸提取组蛋白用于考马斯亮蓝染色或免疫印迹分析。

慢病毒感染和荧光素酶分析

为了构建一个包含CLEAR序列的慢病毒报告载体，通过用EcoRI和SpeI限制酶消化pGreenFire1，将一个包含四个CLEAR串联拷贝的寡核苷酸插入到包含EF1-Puro选择盒的pGreenFire1慢病毒载体（System Biosciences，CA）中。将293FT细胞与pGreenFire1-CLEAR和三种包装质粒（pLP1、pLP2和pLP/VSVG）共转染产生慢病毒。转染72小时后收集慢病毒，离心去除细胞碎片，并通过0.45μm膜过滤（Millipore，Bedford，MA）。为了避免目标基因的多重基因组整合，总计6×10⁵接种在6孔板中的细胞被6×10感染⁵慢病毒的感染单位（感染多重性[MOI]=1）。用嘌呤霉素（5μg/ml）处理慢病毒感染的细胞7天，产生在4×CLEAR-SV40启动子下稳定表达萤光素酶的细胞池。为了确定核ACSS2促进转录的能力，对细胞进行葡萄糖饥饿或不饥饿处理，并使用荧光素酶检测系统（Promega）进行荧光素素酶检测。荧光素酶活性标准化为从重复样品中获得的细胞数。

电子显微镜

用含有3%戊二醛和2%多聚甲醛的溶液将样品固定在0.1 M的缓冲液中，pH值为7.3，然后在0.1 M缓冲液中洗涤，用0.1%微孔过滤的缓冲单宁酸处理，用1%缓冲四氧化锇固定30分钟，并染色整体含1%密理博过滤过的乙酸铀酰。样品在浓度增加的乙醇中脱水，渗透并包埋在LX-112培养基中。然后将样品在60°C烘箱中聚合约3天。使用Ultracut切片机（徕卡）切割样品的超薄切片，在EM染色机（徕卡）中用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在80 kV加速电压下在JEM-1010透射电子显微镜（JEOL）下进行检查。使用AMT成像系统（高级显微镜技术）获得数字图像。

基因组编辑

如前所述，使用CRISPR/Cas9系统在U87和U251细胞中产生基因组突变(Sander和Joung，2014年). 设计单导向RNA（sgRNAs）靶向人类ACSS2突变位点附近的基因组区域。将含有悬垂物的退火引导寡聚物插入经消解的高保真PX458-HF载体中英国广播公司限制性内切酶。在24孔板中，用一个单链供体寡核苷酸（20 pmoles）和一个载体（0.5 g）共同转染U87和U251细胞（60%融合），作为引入突变的模板，并能共同表达针对ACSS2基因的sgRNA和绿色荧光蛋白标记的WT-hSpCas9。转染后24小时，将细胞胰蛋白酶化并在培养基中稀释，以便将单个细胞接种到96 well板中，标记绿色荧光蛋白阳性细胞并进行基因组DNA提取。通过对从跨越突变区域的引物扩增的PCR产物进行测序来进行基因分型。PCR所用引物序列列于表S6.

ACSS2活动测量

ACSS2将ATP、醋酸盐和CoA转化为AMP、焦磷酸和乙酰-CoA。使用耦合酶分析法测量焦磷酸盐的生成。反应混合物包含焦磷酸酶（将焦磷酸转化为磷酸盐）和嘌呤核苷磷酸化酶（将核苷类似物（MESG）转化为一种化合物，在存在磷酸盐的情况下在360 nm处吸收光。96 well平板中典型的100μl反应混合物包括50 M CoA、100μM ATP、5 mM醋酸钠、0.2 mM MESG、0.2%牛血清白蛋白、20 nM ACSS2、0.4 M嘌呤核苷磷酸化酶、1 U/ml酵母焦磷酸酶、1 mM MgCl₂150 mM NaCl和50 mM HEPES（pH 7.5）。使用微孔板阅读器（BMG LABTECH）在360 nm的动力学模式下读取增加的吸光度1小时。

量化和统计分析

所有数据表示至少三个独立实验的平均值±SD。样本数（n）表示每个实验中独立生物样本的数量。样本数量和实验重复次数如图例所示。除非特别指明，否则使用双尾学生T检验进行成对比较。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。使用Microsoft Excel进行分析。

我们感谢Kenneth Dunner和Alicia Ledoux的技术支持，感谢Don Norwood对这份手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家癌症研究所拨款2R01 CA109035、1R0 CA169603和1R01 CA204996（Z.L.）、国家神经疾病和中风研究所拨款1R01 NS089754（Z.L）、国家卫生研究院/国家癌症研究院MD Anderson支持拨款（P30CA016672）、，国家自然科学基金项目（81672872号、财企81472386号）。Z.L.是Ruby E.Rutherford杰出教授。