褪黑素通过抑制线粒体分裂保护心脏微血管免受缺血/再灌注损伤VDAC公司1‐香港2‐百万分之五十-有丝分裂轴

摘要

1.简介

尽管成功地将闭塞的心外膜血管重新血管化，但缺血后再灌注至微血管床的失败称为微循环缺血/再灌注损伤（IRI）1大约30%的急性心肌梗死（AMI）患者发生。2心脏微血管IRI主要是由心脏微循环内皮细胞（CMEC）凋亡引起的，它会导致内皮细胞肿胀、微血管痉挛和毛细血管阻塞，减缓或停止微循环血流三心外膜血流恢复后，导致额外的心肌损伤和30天死亡率增加。4这些证据表明，血管IRI降低了再灌注治疗的有效性，损害了AMI患者的临床益处，5因此，保护心脏微血管免受IRI影响并维持其正常功能的策略可能是AMI患者的关键辅助方式。

已有证据表明生理浓度的褪黑素通过维持内皮屏障功能对微循环具有保护作用，6保持内皮通透性，7减少细胞过度氧化应激，8以及缓解内皮依赖性NO过度生成。9然而，褪黑素在心脏微血管损伤中的作用尚不清楚。近年来，线粒体内稳态已成为心脏IRI，特别是线粒体分裂和有丝分裂相关细胞死亡的关键调节因子。10,11过度线粒体分裂通过交替平衡促生和抗生因子加剧心脏IRI。除了线粒体分裂外，细胞还能通过自噬相关过程（称为有丝分裂）选择性地从整合网络中移除几个功能失调的线粒体，以维持细胞器质量和体内平衡。12过度向有丝分裂转变会消耗大部分线粒体，导致心肌细胞能量短缺和随后的细胞死亡。目前尚不清楚线粒体分裂和线粒体自噬是否是心脏微血管IRI和CMEC死亡的触发因素，如果是，褪黑素是否能够通过调节线粒体分裂和线粒体自噬来减轻心脏微循环损伤。

AMP-活化蛋白激酶信号传导（AMPK）作为细胞内能量传感器。先前的研究发现褪黑素是AMPK通路的触发因素。13此外，褪黑素激活的AMPK保护线粒体呼吸。14最近的研究表明，激活AMPK可以通过失活动力蛋白相关蛋白1（Drp1）来抑制线粒体分裂15和其他研究表明，AMPK也可以处理有丝分裂。16然而，褪黑素是否通过激活AMPK调节过度线粒体分裂和有丝分裂来保护心脏微血管免受IRI的影响尚不清楚。为了解决这个问题，我们生成了AMPKα^−/−小鼠（AMPKα是内皮细胞的主要亚型17)观察褪黑素对线粒体的保护作用。结果表明，褪黑素以AMPKα依赖性的方式保护心脏血管系统对抗IRI。褪黑素激活AMPKα可抑制线粒体分裂，从而阻止电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和己糖激酶2（HK2）的分离、线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放和过度的有丝分裂，有助于CMEC在IRI反应中存活。此外，通过激活AMPKα，通过褪黑素治疗提高CMEC存活率，改善内皮屏障功能，减少炎症细胞浸润，保留e‐NOS含量，恢复血流，限制梗死面积，最终降低心脏微血管IRI。

2.材料和方法

3.结果

如图所示1A、 接受褪黑素治疗的小鼠出现较小的梗死灶，以占总左心室（LV）的百分比表示。然而，AMPKα的丢失，褪黑素对梗死面积的有益作用消失。此外，乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T和肌酸激酶-MB（CK-MB）的表达在IRI的作用下明显增加，褪黑素减少了WT小鼠的LDH释放、肌钙素T含量和CK-MB，但AMPKα中没有增加^−/−鼠标（图1B） ●●●●。此外，褪黑素还改善了IRI患者的心脏功能，如左室射血分数（LVEF）、左室舒张内径（LVDd）和左室缩短分数（LVFS）的改善。然而，AMPKα缺失降低了褪黑素对心脏功能的保护作用。（图1C‐D）。

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图1

体内缺血/再灌注损伤后，褪黑素可缩小梗死面积并保护心脏功能，缺血30分钟后再灌注2小时（n=6/组）。（A） ●●●●。心脏切片的代表性图片TTC公司埃文斯蓝染色。（B） ●●●●。条形图表示梗死面积占左心室总面积的百分比。乳酸脱氢酶释放、肌钙蛋白T含量和CK公司‐MB（MB）通过以下方式评估值酶联免疫吸附试验.（C）。每组在再灌注2小时后进行代表性的M型超声心动图，观察胸骨旁长轴。（D） ●●●●。超声心动图对心功能的定量分析*P（P）<0.05 vs假手术组#P（P）<0.05 vs Ctrl‐爱尔兰共和国组&P（P）<.05 vs梅尔‐爱尔兰共和国组

心肌声学造影用于评估IRI后微血管灌注的变化。褪黑素治疗在再灌注2 h时WT小鼠造成较小的灌注缺损区，但在AMPKα^−/−鼠标（图2A、 B、C和D）是代表性的区域特定补充曲线，显示了再灌注后2小时的心肌血流参数A（平台强度）和β（流速）以及心肌血流（MBF）剖面（A×β）。这些数据表明，褪黑素以AMPKα依赖的方式给药后，心肌血流量增加。此外，使用明胶墨水进行微血管成像（图2E） 也表明IRI阻断了血流，而褪黑素的应用恢复了WT小鼠微血管血流的通畅性，但AMPKα没有恢复^−/−老鼠。此外，IRI显著降低了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，而褪黑素治疗通过AMPKα增加了eNOS水平（图2F） ●●●●。此外，在IRI条件下，由于湍流，IRI还诱导了不规则形成的红细胞（RBC）的积聚（图2G） ●●●●。然而，褪黑素治疗逆转了红细胞的形态，在WT小鼠中呈现出类似于“降落伞”或“箭头”的规则形状，而不是AMPKα^−/−老鼠。此外，透射电镜（TEM）结果也显示IRI诱发了管腔狭窄。褪黑素处理的WT小鼠心脏微血管表面光滑且完整，但AMPKα不完整^−/−鼠标（图2H） ●●●●。

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图2

褪黑素通过以下途径保护缺血/再灌注损伤（IRI）期间的急性微循环障碍AMPK公司α. （A‐B）。心肌对比超声心动图的代表性病例心肌对比超声心动图胸骨旁长轴图像，分为三个区域：心尖隔膜（蓝色）、中隔膜（黄色）和基底隔膜（红色）。左心室：左心室。A： 平台强度，β：流速。（C） ●●●●。再灌注后15、45、75和120min，不同组的心尖部心肌血流（A×β）剖面图。（D） ●●●●。再灌注120分钟后心尖部血流。n=每组6个。（E） ●●●●。墨水染色微血管图像检测。（F） ●●●●。内皮一氧化氮合酶表达的免疫组织化学。（G） ●●●●。高等教育不同组红细胞形态染色。（H） ●●●●。透射电子显微镜(透射电镜)用于观察微血管的结构变化爱尔兰共和国包括CMEC的微血管壁破坏和管腔狭窄（白色箭头）*P（P）<0.05 vs假手术组#P（P）<0.05 vs Ctrl-IRI组&P（P）<.05 vs梅尔IRI组

缺血/再灌注损伤诱导VE‐钙粘蛋白下调，这是一种维持微血管屏障的连接蛋白。虽然褪黑素在WT小鼠中有力地维持了VE‐钙粘蛋白的连续荧光，但在AMPKα中没有^−/−老鼠。（图三A） ●●●●。此外，褪黑素还可以减弱IRI增强的ICAM‐1在WT小鼠微血管表面的表达，但在AMPKα中没有^−/−鼠标（图三B） ●●●●。内皮屏障崩溃后出现更多的Gr‐1⁺心肌组织中的细胞（图三C） ●●●●。然而，褪黑素大大降低了Gr‐1⁺中性粒细胞浸润内膜。此外，IRI还导致更多血浆白蛋白从血管中泄漏。而褪黑素减弱了血浆向血管壁外表面的扩散（图三D） 在WT小鼠中，但不在AMPKα中^−/−老鼠。此外，微血管完整性和屏障功能的破坏也可能是CMEC死亡和TUNEL分析的结果（图三E） 证实褪黑素可以通过激活AMPKα保护CMEC免受IRI介导的死亡^−/−。

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图3

褪黑素维持微血管内皮屏障的完整性，降低血管通透性，缓解细胞死亡。（A） ●●●●。内皮屏障完整性通过价值工程钙粘蛋白染色。间断点状或线性表达价值工程缺血/再灌注损伤（IRI）组可观察到钙粘蛋白，表明内皮屏障断裂。然而，褪黑素可以逆转价值工程钙粘蛋白荧光通过AMPK公司α. （B） ●●●●。的表达式ICAM公司1在心脏微循环内皮细胞（CMEC）中。（C） ●●●●。第1组⁺中性粒细胞浸润心肌组织。（D） ●●●●。血浆白蛋白从血管壁表面渗出进入间质间隙，提示微血管通透性增加是由于爱尔兰共和国（E）。隧道检测以评估CMEC公司死亡

为了探讨褪黑素保护心脏微血管对抗IRI的机制，我们在体内通过透射电镜观察了线粒体吞噬。对IRI的反应是，微血管中的线粒体变小，呈点状。此外，溶酶体中含有一些线粒体或支离破碎的线粒体，提示IRI中存在有丝分裂（图中的白色箭头4A） ●●●●。相反，褪黑素治疗保护WT小鼠的线粒体免受溶酶体消化，但对AMPKα没有保护作用^−/−鼠标（图中的黄色箭头4A） ●●●●。此外，在体外，我们发现IRI后绝大多数破碎的线粒体被溶酶体吞噬（图4B） ，线粒体和溶酶体的共定位增加证明了这一点。然而，褪黑激素逆转了这些变化。类似地，用丝裂原活化剂雷帕霉素（Rap）处理也会增加溶酶体消耗的线粒体数量。然而，AMPKα的缺失抑制了褪黑素对有丝分裂的抑制作用。

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图4

缺血/再灌注损伤（IRI）诱导的体外心肌微循环内皮细胞（CMEC）通过过度的有丝分裂死亡。野生型小鼠和AMPK公司α^−/−小鼠衍生的CMEC公司用褪黑激素治疗的人叫梅尔+重量和梅尔+AMPK公司α^−/−组。此外，AMPK公司α功能增益实验在CMEC公司s来自AMPK公司α^−/−在褪黑激素治疗后使用腺病毒载体，命名为Ad+Mel+AMPK公司α^−/−组。同时，在Mel中使用了有丝分裂激活剂雷帕霉素（Rap）+重量作为阳性对照组。这个爱尔兰共和国体外模拟缺氧30min、血清饥饿和2h复氧。（A） ●●●●。透射电镜观察活体内有丝分裂。爱尔兰共和国诱导溶酶体含有更多的线粒体，褪黑素可逆转这些变化。黄色箭头表示正常线粒体。白色箭头表示溶酶体中消化的线粒体或破碎的线粒体。（B） ●●●●。溶酶体和线粒体的共存爱尔兰共和国被褪黑激素逆转。Rap减少了溶酶体中线粒体的数量。（C） ●●●●。与有丝分裂有关的蛋白质的变化。爱尔兰共和国增加了信用证三二/信用证3 I通过粉红色1/Parkin途径激活。（D‐E）。隧道染色显示有丝分裂诱发CMEC公司死亡。（F） ●●●●。乳酸脱氢酶释放试验检测细胞损伤。3‐妈妈是一种有丝分裂抑制剂*P（P）<0.05 vs Ctrl组#P（P）<0.05与爱尔兰共和国‐重量组&P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+重量组@P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+AMPK公司α^−/−组

为了解释IRI诱导有丝分裂的机制，我们重点研究了PINK1/Parkin通路。图4C显示IRI增加了线粒体PINK1的含量，随后Parkin从细胞质转移到线粒体，这与LC3I向LC3II的转移平行。然而，褪黑素抑制线粒体上PINK1和Parkin的积累，并以AMPKα参与的方式进一步终止LC3I到LC3II的转移。最后，通过TUNEL分析，我们发现IRI介导的细胞凋亡可以通过抑制有丝分裂或以AMPKα依赖的方式进行褪黑素治疗来逆转（图4D‐E）。此外，LDH分析也支持这种结果（图4F） ●●●●。mPTP开放和ΔΨm耗散在激活PINK1/Parkin/有丝分裂途径中起决定性作用。在本研究中，IRI导致ΔΨm和mPTP开口完全耗散（图5A‐C）被褪黑素通过AMPKα逆转。此外，使用mPTP开放抑制剂环孢菌素a（CsA）作为阴性对照组（图5A‐C）。

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图5

线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放激活了线粒体吞噬功能，该孔是由己糖激酶2（HK2）从线粒体中分离出来以响应缺血/再灌注损伤（IRI）引起的。（A‐B）。膜电位（∆Ψm）的变化JC公司‐1染色。（C.）变更百万分之五十打开。（D‐H）。亚细胞定位香港2通过免疫荧光和蛋白质印迹。爱尔兰共和国为香港2线粒体到细胞质的分离，褪黑素通过AMPK公司α^−/−然而，爱尔兰共和国或褪黑素对总含量无影响香港但影响其在线粒体和细胞质之间的亚细胞分布。（I‐J）。任意的百万分之五十V抑制剂3–Brpa的四甲基罗丹明乙酯（TMRE）荧光开放时间香港2相互作用。任意百万分之五十打开时间被确定为TMRE公司荧光强度在初始和剩余荧光强度之间下降了一半。CsA，一种百万分之五十阻滞剂作为阴性对照。（K） ●●●●。Parkin和线粒体的共同表达。抑制香港2的释放降低了Parkin与线粒体的相互作用*P（P）<0.05 vs Ctrl组#P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐重量组&P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+重量组@P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+AMPK公司α^‐/‐组

此外，mPTP的打开可以被HK2抑制25通过结构上干扰促凋亡蛋白（如Bax和Bad）从细胞质转移到线粒体的能力，与线粒体结合。26因此，我们观察了褪黑素治疗下HK2的变化。图中的结果5D提示IRI导致线粒体结合的HK2水平较低，但细胞质HK2水平较高。在放大的图像中（图5D） 在IRI反应中，破碎或肿胀的线粒体捕获的HK2较少，而褪黑素通过AMPKα促进HK2重新迁移到线粒体。有趣的是，尽管线粒体相关HK2减少，但IRI后CMEC中HK2的总含量没有变化（图5E‐H），表明IRI仅影响HK2的亚细胞分布。为了确定HK2释放在mPTP依赖性有丝分裂中的作用，使用了HK2释放抑制剂3-溴丙酮酸（3-Brpa）。我们发现褪黑素通过AMPKα修饰HK2与线粒体的结合不仅改善了ΔΨm（图5I‐J），但也减少了线粒体上的Parkin易位（图5K） ●●●●。

线粒体VDAC1通过抑制Bax/Bad与线粒体的相互作用，将细胞质HK2与线粒体紧密耦合，防止mPTP开放。27然而，IRI显著降低了VDAC1的表达，但增加了分子量为69和95 kDa的VDAC1齐聚产物的百分比（图6A‐D）被褪黑素通过AMPKα逆转。为了探讨VDAC1的齐聚状态是否影响HK2释放到细胞质中，我们重点研究了HK2和VDAC1或VDAC1二聚体和多聚体之间的蛋白质相互作用。我们的结果显示VDAC1和HK2之间存在相互作用，但低聚物VDAC1与HK2之间没有相互作用（图6E） ●●●●。为了进一步证明VDAC1齐聚和随后的HK2释放的作用，我们使用二苯胺-2-羧酸（DpC）来抑制VDAC1的齐聚。抑制VDAC1寡聚化可能被证明是增强锚定在线粒体上的HK2的有效干预措施（图6F‐H），这与褪黑素组的结果相似。为了探讨褪黑素减少VDAC1齐聚的机制，我们将重点放在线粒体分裂上。首先，褪黑素组线粒体的自由端少于IRI组（图6I‐J）。其次，Mdivi1对裂变的抑制可以恢复IRI下调的VDAC1的含量，这与褪黑素处理的结果相当。（图6K） ●●●●。

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图6

己糖激酶2（Hk2）的释放归因于线粒体裂变介导的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）齐聚，而褪黑素通过AMPK公司α. （A‐D）。评估VDAC公司1齐聚通过EGS公司使用抗VDAC公司1抗体。缺血/再灌注损伤增加VDAC公司1齐聚反应，分子量为69和95千分之十a、 而褪黑激素可以逆转这种变化。（E） ●●●●。香港2和VDAC公司1免疫沉淀法评估相互作用(IP（IP）)实验。（F‐H）。抑制VDAC公司低聚化可以增加线粒体的含量香港2.二苯胺-2-羧酸（DpC），一种VDAC公司1齐聚物，作为阴性对照组。（I‐J）。用抗Tom20抗体标记心脏微循环内皮细胞的线粒体，以确定线粒体断裂的细胞数量。为了定量评估线粒体形态的变化(应收账线粒体长度）和形状因子(FF公司计算每个细胞的线粒体分支度（两个参数的最小值均为1）。高FF公司和应收账数值显示线粒体健康，而低FF公司和应收账表明线粒体破碎。（K）。抑制线粒体分裂可以逆转VDAC公司1表达式。线粒体分裂抑制剂Mdivi1被用作阴性对照组*P（P）<0.05 vs Ctrl组#P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐重量组&P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+重量组@P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+AMPK公司α^−/−组。VDAC公司1，电压依赖性阴离子通道1；香港2，己糖激酶2

在细胞质和线粒体表面之间穿梭的Drp1对线粒体分裂是必不可少的。图7A显示IRI显著增加了Drp1与线粒体的重叠，结果还表明，以Drp1标记的线粒体有更多的游离碎片。然而，褪黑素减少了Drp 1在线粒体上的聚集，其形态几乎正常，碎片较少（图中的白色箭头7A） ●●●●。AMPKα的缺失降低了褪黑素对线粒体分裂的保护作用。此外，IRI增加了Drp1 Ser616磷酸化，但也降低了Ser637磷酸化（图7B‐D），伴随着线粒体上Drp1的大量积累。相反，褪黑素增强了Drp1的Ser637，但减弱了Drp1的Ser616磷酸化，随后线粒体Drp1含量降低。此外，AMPKα的缺失消除了褪黑素对Drp1磷酸化修饰的影响。

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图7

Ampkα被褪黑素激活，有助于Drp1修饰和随后的线粒体分裂。（A） ●●●●。Drp1和线粒体的共同定位。每个显微照片下的方框区域代表白色方块的放大。更多的Drp1位于碎片线粒体上，而褪黑素可以通过以下途径减少Drp1在线粒体上的迁移AMPK公司α. 白色箭头表示线粒体上是否聚集了Drp1。（B‐D）。激活AMPK公司α参与调节Drp1磷酸化*P（P）<0.05 vs Ctrl组#P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐重量组&P（P）<0.05 vs爱尔兰共和国‐梅尔+重量组@P（P）<0.05与爱尔兰共和国‐梅尔+AMPK公司α^−/−组

4.讨论

在本研究中，我们发现（i）褪黑素有助于瘢痕限制、血流恢复、微循环灌注通畅、内皮屏障完整性、eNOS生成和CMEC存活；（ii）褪黑素通过AMPKα参与的Drp1转录后修饰使Drp1失活，这与线粒体分裂减少有关；（iii）抑制裂变通过抑制VDAC1齐聚、阻断mPTP开放和保持ΔΨm，减轻HK2从线粒体的解离；和（iv）较高的ΔΨm和较少开放的mPTP阻断PINK1/Parkin/有丝分裂途径，最终促进CMEC存活。据我们所知，这是首次描述褪黑素在心脏微血管IRI中的作用的研究，该IRI调节线粒体结构和功能，涉及线粒体分裂、线粒体吞噬、mPTP开放和HK2‐VDAC1相互作用。（图8A‐B）。

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图8

（A） 缺血/再灌注损伤诱导（IRI）激活依赖Drp1的线粒体分裂，随后诱导电压依赖性阴离子通道（VDAC1）齐聚、己糖激酶2释放、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，粉红色1/Parkin上调，最终有丝分裂介导的心脏微循环内皮细胞（CMEC）死亡。然而，褪黑素增强了CMEC公司通过激活生存AMPK公司α、 然后是p‐Drp1^第637系列上调和p‐Drp1^第16节下调，减弱依赖Drp1的线粒体分裂。褪黑素对线粒体分裂的抑制作用VDAC公司1个香港2阻止的交互百万分之五十打开和粉红色1/Parkin激活，最终阻止有丝分裂介导的细胞死亡。（B） 最后CMEC公司保持屏障完整性，降低血管通透性，减轻中性粒细胞浸润和血浆白蛋白泄漏，增加内皮一氧化氮合酶含量，改善微血管通畅性，促进微血管灌注，保护心脏微循环免受IRI

在IRI期间，与心肌细胞发生的病理变化相比，在疾病早期可检测到内皮损伤。28此外，内皮细胞损伤在IRI引起的微血管和心肌细胞并发症的发病机制中起着决定性作用。eNOS生成不足是微血管舒张功能受限的一个显著特征。此外，过度CMEC死亡导致的内皮细胞过度通透性和连接丢失会导致屏障功能障碍，导致白细胞粘附不良和微血栓形成，从而参与血管凝血和管腔丢失。最后，由于微血管结构和功能受损导致毛细血管阻塞，血流减少。29在本研究中，我们首先提供证据支持褪黑素通过逆转血管功能障碍和缓解CMEC死亡在心脏微血管IRI中发挥直接防御作用。具体来说，褪黑素改善了eNOS的生成和屏障功能，从而减轻了管腔狭窄和炎症细胞或红细胞在微血管上的附着。这些有益的作用可能是由于褪黑素对CMEC的促生存作用。通过这些机制，褪黑素增加了血液循环和心脏灌注，有助于心肌功能的恢复。

我们确定，抗线粒体吞噬是防御的主要机制，褪黑素抑制了抗线粒体吞噬，以保持CMEC在IRI状态下的存活。许多研究发现，在IRI期间，线粒体的破坏导致心肌细胞有氧呼吸受损，导致能量耗竭和细胞死亡。在本研究中，我们发现绝大多数线粒体被溶酶体吞噬，进行线粒体自噬，并伴有大量死亡细胞。事实上，过度的线粒体自噬消耗了大部分线粒体，导致细胞器丰度迅速下降。有丝分裂的平衡失调与细胞能量短缺相结合，降低了细胞对IRI的抵抗力。这些可能是有丝分裂相关细胞死亡的自然分子过程。根据我们目前的研究，驱动有丝分裂的主要刺激是IRI反应中上调的PINK/Parkin。此外，PINK/Parkin活性增加归因于膜电位降低和mPTP开放更多。30抑制mPTP开放不仅稳定了ΔΨm，而且还破坏了PINK1/Parkin在线粒体上的沉积。这些数据表明，细胞死亡是由PINK/Parkin/有丝分裂引起的，这是由mPTP对IRI的反应而开放引起的，与mPTP介导的经典线粒体死亡途径完全不同。正如我们之前的研究所报告的那样，经典的线粒体死亡途径的特征是细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，与caspase9作用到非活性caspase3。23,31然而，有必要指出，这两条死亡途径存在上游收敛，即mPTP开放。一方面，mPTP的开放为细胞色素c的泄漏提供了通道。另一方面，mPTP开放导致ΔΨm崩塌，从而吸引PINK/Parkin引起有丝分裂。我们的研究进一步支持了mPTP在细胞死亡中的作用，这为临床应用中调节IRI提供了重要的靶点。

从另一个角度来看，我们发现褪黑素通过增强HK2-线粒体的结合来抑制mPTP的开放。众所周知，HK2与线粒体的相互作用可以防止许多细胞类型的细胞死亡32,33mPTP的开放被与HK2的相互作用所抑制。25在本研究中，IRI促进了HK2与线粒体的分离，导致mPTP过度开放。然而，褪黑素增强了HK2与线粒体之间的紧密联系。有趣的是，褪黑激素处理后，CMEC中HK2的总表达没有改变。因此，有理由假设线粒体‐HK2含量的增加是由其与线粒体褪黑素的更高亲和力介导的。已经证明HK2与线粒体外膜结合34,35通过动态齐聚的VDAC1。27我们提供的证据表明，IRI诱导的VDAC1寡聚体与HK2的亲和力较低，而褪黑素阻碍VDAC1的寡聚，以确保HK2在线粒体上紧密偶联。

先前的研究表明，线粒体分裂可能会影响线粒体相关蛋白的寡聚，包括OPA。36,37在本研究中，我们的发现证实了上述结论。IRI通过线粒体分裂引起VDAC1低聚。褪黑素可以通过调节AMPKα对Drp1磷酸化的平衡来缓解线粒体分裂。值得注意的是，Drp1有两个关键的磷酸化位点，包括Ser616和Ser637。Drp1可通过Ser616的磷酸化激活，但通过Ser637的磷酸化失活。这两个磷酸化位点的平衡决定了Drp1的活性。在本研究中，褪黑素通过AMPKα降低了Ser616磷酸化，但增加了Ser637磷酸化。这些发现与之前的研究一致，15表明AMPKα对Drp1和线粒体裂变的直接转录后修饰作用的重要性。事实上，一些研究已经证明了AMPKα在线粒体分裂和有丝分裂中的重要作用。据报道，AMPKα的缺失会引发线粒体过度分裂。38在主动脉内皮细胞中，AMPK通过Ser637的磷酸化使Drp1和线粒体分裂失活。15此外，AMPK的缺失也调节了有丝分裂活性。39在心脏老化中，AMPK通过抑制心肌自噬而加重心肌重塑和收缩功能障碍。40值得注意的是，一些研究还发现线粒体功能障碍可以激活AMPK信号以促进细胞存活。41这些数据表明，激活AMPKα的方法可以作为未来减轻IRI和增加AMI后患者再灌注治疗益处的焦点。总之，我们报告的结果说明了线粒体分裂在通过VDAC1‐HK2‐mPTP轴传输的IRI信号中的重要作用，该轴致命地触发了直接细胞死亡的线粒体级联反应，导致IRI期间体内心脏微血管结构和功能的破坏。这些数据也为干预心脏血管IRI提供了一种简单有效的方法。这种方法是使用褪黑素。然而，应该对这种组合有更多的了解，为临床应用提供充分的证据。

本研究存在一些局限性。首先，我们的实验特别关注微血管损伤。需要进一步的研究来支持目前应用于心肌细胞的研究结果。目前的研究结果是否适用于心肌细胞IRI需要进一步研究。本研究的第二个局限性是所有实验均在AMPKα基因敲除小鼠中进行。在分离的CMEC中报告的影响是否是AMPKα立即被敲除的结果，和/或其他器官/组织中AMPKβ缺失的间接影响，也可能影响CMEC，这是本研究中涉及AMPKγ激活作用的一个重要限制。内皮细胞特异性AMPKα缺失的影响对于确定内皮细胞AMPKβ对心脏微血管IRI的相对贡献非常有用。

披露

提交人声明他们没有利益冲突。

作者贡献

HZ、YZ和SYH参与了概念和设计、实验执行、数据分析和解释以及手稿撰写；参与数据分析和解释的CS、PJZ和QM；QHJ、FC、FT和YDC参与了构思和设计、数据分析和解释、财务支持以及手稿的最终批准。

支持信息

致谢

笔记

周浩，张勇，胡斯，等。褪黑素通过抑制线粒体分裂‐VDAC1‐HK2‐mPTP‐线粒体吞噬轴保护心脏微血管免受缺血/再灌注损伤。松果腺研究期刊. 2017;63：e12413https://doi.org/10.1111/jpi.12413 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

笔记

郝周、陈石和胡顺英的作者对本研究贡献均等。

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