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循环。作者手稿；2018年7月11日PMC发布。
以最终编辑形式发布为：
循环。2017年7月11日；136(2): 200–214.
2017年4月14日在线发布。 数字对象标识：10.1161/循环AHA.116.024590
预防性维修识别码：项目编号：C5505791
NIHMSID公司：尼姆斯875741
PMID：28411247

外源性microRNA转移到巨噬细胞介导细胞后处理：外源性RNA转移调节巨噬细胞

杰弗里·德·库托，博士，1,* 罗曼·加莱，医学博士，1,* 琳达·坎比尔，博士，1 埃尔文·贾加茨班扬，文学学士，1 努普尔麦加，理学学士，1 詹姆斯·弗雷德里克·道金斯，DVM中，1 本杰明·伯曼，博士，1,2和爱德华多·马尔班医学博士1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

心球衍生细胞（CDCs）通过独特的巨噬细胞极化作用在急性心肌梗死（MI）中提供心脏保护。这里我们证明CDC分泌的外泌体（CDC外显（exo）)概述CDC治疗的心脏保护作用，即细胞后处理。

方法

大鼠和猪在冠脉内输注CDC前接受缺血再灌注诱导的心肌梗死外显（exo）惰性成纤维细胞外泌体（Fb外显（exo）; 控制）或车辆。两天后，对梗死面积进行量化。从心脏组织或骨髓中分离巨噬细胞用于下游分析。RNA-测序用于确定M中的外显子含量和基因表达谱的变化。

结果

疾病预防控制中心管理外显（exo），但不是Fb外部在大鼠和猪心肌梗死模型中，再灌注后梗死面积减小。此外，CDC外显（exo）减少梗死组织内CD68+M的数量，并修改M⁄的极化状态，以模拟CDCs诱导的极化状态。疾病预防控制中心外显（exo）相对于Fb，富含多种miRNAs（包括miR-146a、miR-181b和miR-126）外显（exo）来自美国疾病控制与预防中心的全转录组数据的反向通路分析外显（exo）-引物Mö暗示miR-181b为显著（p=1.3×10−21)CDC诱导的M极化和蛋白激酶Cδ（PKCδ）的候选介体作为下游靶点。其他插入Fb外显（exo）在MI大鼠模型中选择性地加载miR-181b，改变Mü表型并赋予心脏保护功效。PKCδ抑制的Mü的过继转移可重新获得心脏保护。

结论

我们的数据支持这样的假设，即miR-181b从CDC外体转移到Mü降低PKCδ转录水平，并为再灌注后给予CDC的心脏保护作用奠定了基础。

关键词：心肌梗死，心脏保护，巨噬细胞，胞外体，miRNA

简介

急性心肌梗死（MI）引起强大的先天免疫反应，动员大量中性粒细胞和巨噬细胞进入心肌。这种反应在受伤后的最初几天内发生，以一种阶段性的方式发生，通过单核细胞/巨噬细胞的异质性流入，中性粒细胞的快速浸润成功1单核细胞/巨噬细胞浸润的第二阶段与坏死细胞碎片的清除、基质的沉积和瘢痕组织的成熟有关，它严重决定了最终的梗死面积。循环单核细胞/巨噬细胞耗竭2或选择性消耗M2样愈合巨噬细胞三心肌梗死后不仅会加重组织损伤，而且会损害心脏功能。尽管在稳定状态下心肌内存在巨噬细胞异质性4和MI后5，尚不清楚哪些环境线索赋予了观察到的不同极化剖面体内6。

心脏衍生细胞（CDC）治疗已被用作治疗大、小动物以及人类缺血性心脏病的策略。尽管冠状动脉内或直接心肌注射后在宿主心肌组织内滞留有限7，细胞治疗的有益效果是持久的8我们的实验室最近证明，外泌体（纳米脂质双层囊泡；约30–150nm）是心肌梗死后CDC治疗的有效分泌成分9Barile等人证实。10这些小泡由多种细胞类型在全身分泌，用于局部或远程细胞间通信；它们包含小RNA的特定有效载荷（例如，miRNA、snoRNA、Y-RNA等）11和蛋白质（例如转录因子、跨膜受体、整合素等）12，并容易被包括巨噬细胞在内的多种细胞类型所吸收13，成纤维细胞14和内皮细胞15在这里，我们扩展了最近关于CDC细胞后处理的研究16–18通过鉴定CDC外泌体（CDC外部)19作为细胞分泌体的关键成分，在心肌梗死中起到心脏保护作用。我们进一步证明，在CDC中miR-181b外显（exo）是巨噬细胞极化的关键介质在体外和心脏保护体内。

方法

实验方案、动物和手术程序

所有研究都是根据动物保护和使用委员会（IACUC）的指导原则在锡达拉斯-西奈医疗中心进行的。

老鼠

体内实验方案在7-10周龄雌性Wistar Kyoto（WKY）大鼠（Charles River Labs，Wilmington，MA）上进行。为了诱导缺血再灌注（IR）损伤，对大鼠进行全身麻醉，然后在4第个肋间间隙暴露心脏和左前降支（LAD）冠状动脉。然后用7–0丝线结扎LAD，45分钟后取出LAD以进行再灌注。20分钟后，细胞（5×105; 在20秒的时间内，用主动脉交叉夹将100µl PBS）或外泌体（35µg、105µg或350µg；100µl PBS）注入左心室腔。

清管器

体内实验方案是在成年雌性尤卡坦小型猪上进行的。为了诱导IR损伤，对猪进行全身麻醉，然后在第一个对角支后将血管成形术球囊穿入LAD中部，并充气90分钟。再灌注30分钟后，动物被分配接受CDC外显（exo）（7.5毫克）或安慰剂（Iscove's Modified Dulbecco’s Medium，IMDM）。排除保留CDC的任何并发症外显（exo），我们进行了直接心肌内注射分娩。该手术是在开胸模型（胸骨正中切开术）中使用25G针头进行的。确定梗死区域（灰色和僵硬区域），并在梗死周围（边缘区域）连续注射10次（0.75mg）。

心功能测量

老鼠

在基线检查时（缺血前）和安乐死前（48小时或2周）对大鼠进行经胸超声心动图检查（Vevo770，VisualSonics）。二维短轴和长轴被可视化。为每个动物/时间点捕获三个具有代表性的周期，并获得左室收缩末期尺寸、左室舒张末期尺寸和变化分数面积的测量值并求平均值。

清管器

为了测量左室功能，在静脉滴注前（心肌梗死后）和安乐死前（48小时）使用插入左室的猪尾导管进行左室造影。研究了两种发生率：左前斜投影45°和右前斜投影30°20°颅骨投影。通过平均这两个测量值来确定LVEF。

梗死面积评估

老鼠

IR损伤后两天，心室内注射10%KCl后心脏舒张停止。然后切除心脏，在PBS中清洗，并切割成厚度约为1mm的连续切片（从梗死尖端到基底边缘）。切片在黑暗中用TTC（2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物，1%PBS溶液）培养20分钟，用PBS洗涤，然后成像并称重。如前所述，从活组织（分别为白色和红色）描绘梗死情况，并使用ImageJ软件进行分析16通过推断梗死和非梗死体积（基于组织切片两侧计算的面积）和组织重量，计算梗死质量、存活质量和左心室质量。使用（梗死质量/存活质量）×100%计算梗死质量百分比。

清管器

输注后两天，动物接受侧开胸手术。将导管插入左侧附件，将硫黄素T（50mL，2%）注入左心房，以评估微血管阻塞（MVO）。然后在用于梗死的相同位置对血管成形术球囊进行充气，并注射龙胆紫（50mL，1.8%）以评估风险区域（AAR）。然后对动物实施安乐死，将心脏移植并切成1厘米厚的切片。TTC染色测定梗死面积（IS）。然后按照前面的描述确定IS、MVO和AAR17AAR报告为LV总质量的百分比，IS和MVO报告为AAR的百分比17。

体外细胞培养

骨髓衍生M

如前所述分离骨髓16简单地说，用乙醇（70%在H中）对大鼠（股骨）或猪（肋骨）的骨骼进行消毒2O） 用PBS（含1%FBS，2mM EDTA）冲洗，并通过70µm过滤器过滤。用ACK缓冲液（Invitrogen）溶解红细胞，然后在IMDM（含10%FBS，10ng/mL m-CSF）中重新悬浮。将所得细胞悬浮液进行电镀并生长7天，以获得M。向M1（分别为100ng/mL LPS和50ng/mL IFNγ；Sigma-Aldrich和研发系统）、M2（10ng/mL IL-4和IL-13；研发系统）或MCDCexo公司（105 ug）在第7天到第8天（~18小时）的夜间进行。

心脏M

如前所述，收集并处理心脏，以分离缺血损伤后的心脏M16简单地说，Fb治疗动物心肌梗死后2天外部或CDC外显（exo）用PBS灌注并收集。将心脏组织切碎并消化，将所得悬浮液过滤（70µm）以生成单细胞悬浮液。使用密度梯度（Histopaque-1083；Sigma）通过离心分离单核细胞，然后在RPMI中重新悬浮（补充1%FBS）并电镀（37°C，5%CO2). 两小时后，用PBS清洗心脏M并用于下游分析。

新生大鼠心室肌细胞

如前所述分离和培养细胞16。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）根据经销商的建议购买细胞（ATCC）并进行培养。

非基因组数据统计

结果表示为平均值±SEM。进行线性回归分析以测试组间的线性关系。每个复制值被视为一个单独的点来确定R2为了确定各组在单个时间点的差异，使用双尾、非配对、Student’s吨-检验或单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较检验（如果Z得分>3或<-3，则排除异常值）。为了确定各组在不同时间点/条件下的差异，使用重复测量ANOVA、Sidak的多假设校正、双向ANOVA和Holm-Sidak多假设校正对数据进行测试，或者进行多次t检验，然后进行Holm-Sidak的多重假设修正（如图图例所示）。为了测试线性趋势，我们进行了单因素方差分析，然后进行了线性趋势后验。所有分析均使用Prism 5软件（GraphPad）进行，只有p<0.05的差异才被视为具有统计学意义。

请参阅仅在线数据补充，了解更多材料和方法。

结果

CDC外显子的特性

CDC外泌体（CDC外显（exo）)从无血清培养基中分离出5或15天的人CDC(补充图IA). 然后收集条件培养基（CM），或通过离心超滤（UFC，Millipore）进行浓缩，以评估颗粒数量和大小（纳米颗粒追踪分析，Malvern Nanosight），以及蛋白质浓度和蛋白质标记物表达(图1和补充图IB). CDC中颗粒数与蛋白质含量呈线性关系外显（exo）来自两个不同的人类血统(图1C). UFC对外泌体的浓缩减少了悬浮液体积（>10倍，图1A)没有可测量的颗粒损失(补充图ID). 人皮肤成纤维细胞外泌体（Fb外显（exo）; 显示为功能惰性体内9)作为阴性对照，在同等条件下进行平行分离和表征(补充图IC). CDC的模式粒径外显（exo）直径约为150nm，表达典型的外体标记（包括CD63、Alix和HSP70）以及CDC表面标记CD105。尽管这种尺寸分布偏差高于基于干燥分离电子显微镜（30–100 nm）的外泌体的一般引用值20，观察范围是通过动态光散射或纳米颗粒追踪分析测量的水合外泌体的典型范围20为了均匀性，考虑到增加的粒子数，我们使用CDC进行了所有后续实验外显（exo）从15天条件培养基中分离。

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外显子的分离和鉴定

（A），纳米粒子追踪分析揭示了人类CDC细胞系中调节培养基（CM）内的粒径分布和浓度，以及通过离心超滤（UFC）进行超滤（155：155疾病预防控制中心外显（exo）; 220:220疾病预防控制中心外显（exo）).（B）、人类CDC外泌体的代表性蛋白免疫印迹（CD63、CD81、Alix、HSP70和MHCII）和CDC（CD105）标记。（C）、外泌体连续稀释样品中颗粒数与蛋白质量的相关性。图表描述了平均+/-SEM。

疾病预防控制中心外显（exo）模拟CDCs的心脏保护作用的AMI大鼠模型再灌注后给药

检查疾病控制与预防中心外显（exo）我们提供了CDC，可以概括CDC的心脏保护作用外显（exo） 体内首先，我们证明了CDC外显（exo）通过预先标记CDC保留在心脏内外部使用DiI（Invitrogen），执行我们的体内协议(图2A)通过在再灌注2小时后处死大鼠，并通过荧光成像（Xenogen，补充图IIA). 第二，在剂量研究中，大鼠先经历45分钟的缺血，然后再进行20分钟的再灌注，然后接受溶媒（PBS）、大鼠异基因CDCs（rCDCs）、带有外分泌体抑制剂的rCDCs+GW4869，或几种剂量的CDC中的一种外显（exo）（35微克、105微克或350微克）。为了提高主动脉交叉夹下冠状动脉内分娩后的疗效，在分娩前用聚乙二醇沉淀外泌体(补充图IIB). 48小时后，对动物实施安乐死，并切除心脏，通过TTC染色测定梗死面积（IS）。确认我们之前的报告16、rCDC（5×105用GW4869对rCDC进行预处理，消除了rCDC的心脏保护作用，这与rCDC生物活性需要外泌体分泌的观点一致。我们通过应用人类CDC进一步测试了这个想法外显（exo）直接代替单元格。疾病预防控制中心外显（exo）在剂量为350µg和105µg时，IS降低到与rCDC类似的水平，但在剂量为35µg的情况下没有降低到(图2B和补充图IIC). 根据这些数据，我们继续测试CDC的效力外显（exo）与惰性Fb外显（exo）9,11第三，利用350µg蛋白质作为我们的标准剂量，我们表明CDC外显（exo）与Fb相比，来自两个人类CDC株系（220和155）的IS降低到与rCDC相似的水平外显（exo）和PBS控制(图2，C&D). 这些数据通过3个额外的人类CDC进一步验证外部行(补充图IID). 这里提供的数据代表了一个初级人类CDC株（220，此处表示为CDC）产生的外显子的发现外显（exo）); 使用来自另一人类品系的外显子的证实性发现发现于补充材料最后，我们测试了CDC心脏保护作用的耐久性外部当随访延长至2周时(补充图IIIA)、疾病预防控制中心外显（exo）仍然减少IS(补充图IIIB)并保持心脏功能(补充图三C–D)相对于Fb外显（exo）控制。因此，CDC的功能和结构优势外显（exo）超过48小时，CDC的好处也一样16,18。

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冠状动脉内输注CDC外体（CDC外显（exo）)再灌注20分钟后给大鼠注射可减轻缺血损伤

（A），外泌体灌注和组织收获的方案示意图。（B），48小时梗死块的量化：CDC的剂量反应效应，通过蛋白质浓度测量外显（exo）（与车辆[PBS]、rCDC和rCDC+GW4869相比）。rCDC：异基因大鼠CDC；GW4869：外显子抑制剂。n=4-6/组。（C），在输注两种人类CDC株中任一株的外泌体48小时后处死代表性TTC染色的动物心脏(220疾病预防控制中心外显（exo）,155疾病预防控制中心外显（exo）)或成纤维细胞（Fb外显（exo）; 350µg）。（D），C中定义的各组心脏梗死块的量化（n=5/组，平均+/-SEM）。采用单因素方差分析和Tukey多重校正检验确定统计显著性*与PBS和Fb相比P<0.05外显（exo）分别是。

CDC心肌内注射外显（exo）急性心肌梗死猪模型再灌注后给药模拟心肌干细胞的心脏保护作用

为了证实这些发现，我们在猪模型中验证了我们的工作(图3A). 简言之，尤卡坦小型猪在直接开胸心肌内注射CDC之前先经历90分钟的缺血，然后再进行30分钟的再灌注外显（exo）（7.5毫克）或安慰剂。48小时后评估心脏功能，随后进行安乐死，并通过TTC测定IS。CDC治疗后外显（exo），LVEF保存较好(图3B;补充图四，A和B)与安慰剂相比，微血管闭塞（MVO/AAR）减少，梗死面积（IS/AAR）减轻(图3，C和D）。此外，我们注意到CDC梗死灶中CD68+巨噬细胞浸润减少外显（exo）-治疗动物与安慰剂动物(图3，E&F). 总之，这些体内猪的数据支持CDC的假设外显（exo）是CDC诱导的心脏保护的关键介质，不仅在啮齿动物中，而且在临床相关的大动物模型中。

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直接心肌内注射CDC外显（exo）猪在再灌注30分钟后分娩可减轻缺血损伤

（A），协议示意图。（B）左室射血分数（LVEF），在再灌注后即刻（基线检查；再灌注后，但在治疗前）和48小时后通过超声心动图测量。（C）、代表性TTC染色安慰剂和CDC外显（exo）-治疗48小时后的猪心脏。危险区域（AAR；红色虚线）、微血管闭塞（MVO；黑色虚线）和梗死面积（IS；白色虚线）（D）用安慰剂或CDC治疗的猪的AAR、MVO和IS定量外显（exo）。（E）CD68的代表性免疫组织化学染色+安慰剂和CDC梗死区内的M⁄外显（exo）-治疗猪。比例尺：50µm。（F）CD68定量+M如（E）所述。图表描绘了平均值+/-SEM（安慰剂：n=5；CDC外显（exo）：n=4）。使用Student t检验或重复测量ANOVA以及Sidak多重校正检验确定统计显著性*P<0.05。

单极化巨噬细胞作为心脏保护效应器的意义

炎症可能参与细胞后处理的第一个证据来自我们对大鼠的初步研究16，其中我们发现CDCs调节Mü向心脏保护表型。模拟CDC的影响16、疾病预防控制中心外显（exo）相对于Fb，梗死边界区内CD68+M的积聚显著减少外显（exo）免疫组织化学检测的对照(图4，A和B;补充图二，E&F)和流式细胞术(图4，C–E). 接下来，我们从接受CDC治疗的动物身上采集心脏外显（exo）或Fb外显（exo）心肌梗死后48小时，然后分离心脏M(图4F)，如上所述16.促炎基因的表达2个和天花在CDC分离的心脏M中显著减弱外显（exo）-经过治疗的动物(图4G).

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疾病预防控制中心外显（exo）对M渗透和极化的影响

（A），CD68的代表性共焦图像+再灌注48小时后梗死边缘区内M。（B），CD68的量化+M⁄in（A）（n=4/组）。（C&D），代表性流式细胞仪图，显示用于确定CD45+CD11b+CD68+心脏M的门控策略。（C）在通过CD45+和CD11b+进行鉴定之前，对白细胞进行门控（FSC/SSC）和清除死细胞（DAPI−）。（D），来自Fb的CD68+细胞的代表性直方图外显（exo）和CDC外显（exo）-根据（C）通过门控治疗心脏。蓝线：阴性对照。（E），定量流式细胞术数据（D）（n=4/组）。（F），免疫组化显示的代表性孤立心脏M图像，表示CD68+。（G），Fb治疗的梗死心脏分离出的心脏M的基因表达谱外显（exo）或CDC外部（n=3/组）。比例尺：50µm。图表描述了平均值+/-SEM。使用Student的t检验或多重t检验以及Holm-Sidak的多重校正检验来确定统计显著性*P<0.05。

体外，暴露于CDC的大鼠骨髓（BM）衍生M外显（exo）(图5A)表现出明显的M极化偏移（Fb未观察到外显（exo）)包括抗炎症基因表达水平的升高精氨酸1,Il4ra公司,Tgfb1型、和素食主义者，无任何重大变化天花(图5B). 这些效应的发生与剂量有关(图5C和补充表1)，在供体系中一致(补充图VA)，并在冷冻干燥和复原后保持稳定(补充图VA)或连续冻融循环(补充图五、B和C). 暴露于CDC的猪BM衍生M外显（exo）表现出类似的极化偏移(补充图VIA). 吞噬试验显示CDC中荧光珠的摄取增强外显（exo）-相对于M1、M2或Fb的引物M外显（exo）-涂底漆M⁄(图5，D&E;补充图VIB)，再次概括了CDC的影响16这些数据共同支持CDC的观点外显（exo）在调节细胞后处理下的M反应中至关重要16。

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疾病预防控制中心外显（exo）独特地调节骨髓衍生的MΓ极化

（A），示意图在体外分析方案，包括骨髓（BM）采集、M分化和治疗。（B），Fb引起的基因表达变化外显（exo）和CDC外显（exo）。（C），暴露于CDC 18小时后BM衍生M的剂量反应基因表达变化外显（exo）。（D）、代表性流式细胞仪图和在M1（LPS&IFNγ）、M2（IL-4&IL-13）、Fb极化后BM衍生M荧光微球摄取的定量外显（exo）和CDC外显（exo）蓝线：阴性对照。（E），流式细胞术数据的量化（D）。图表描述了n=3–5/组的平均+/-SEM。使用双向方差分析（ANOVA）、Holm-Sidak多重校正检验（multiple correction test）、单向方差分析（ANOVA）和Tukey多重校正检验，或多重t检验（Multi-t test）和Holm-Sidak多重校正检验来确定统计显著性*P<0.05。

疾病预防控制中心外显（exo）具有独特的miRNA特征

外显子作为富含小RNA分子的信号中间产物而备受关注11,12外泌体的组成不是随机确定的，而是由细胞源和环境应激源独特调节的21.了解CDC如何外显（exo）我们对从CDC（CDC）分离的外显子进行了总RNA测序（RNA-seq）外显（exo）)和Fbs（Fb外显（exo）)，然后将它们与短RNA注释和长RNA注释的数据库进行比对。为了确定最具生物相关性的变化，我们使用Illumina RNA-seq平台进行了一组生物复制，使用Ion Torrent平台进行了第二组生物复制(图6)22,23在全球范围内，CDC之间映射到不同类别RNA的读取数（以及RNA含量）相似外显（exo）和Fb外显（exo）; 映射到蛋白质编码基因（RefSeq）和tRNAs的读取数最多，而映射到短RNA的读取数较少（例如miRNAs和piRNAs；映射到scaRNAs与snoRNA的读取更少）(补充图七). 然而，在miRNA类中观察到最大且最一致的比例变化，CDC外显（exo）产生的读数是Fb的5倍和8倍外部分别位于Illumina和Ion Torrent库中(图6，A和B). 接下来，我们将重点放在与miRNA注释对齐的读取上，并使用DESeq 2对两组库进行标准化，以识别CDC之间表达发生一致变化的miRNA外显（exo）和Fb外显（exo）(图6C). 虽然两个平台（Illumina和Ion Torrent）存在技术差异（皮尔逊相关系数~0.6），但几个miRNAs表现出显著差异表达。Fb中唯一富集的miRNAs外显（exo）包括miR-199、miR-3676和miR-3648，而那些在CDC中唯一富集的外显（exo）包括miR-126和miR-181b；此外，miR-181a在CDC中的富集程度略低于显著阈值外显（exo）有趣的是，miR-181a/b在CDC中具有大量差异表达的靶基因外显（exo）-处理后的M⁄（标记为红色图6C，下面详细介绍）。

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美国疾病控制与预防中心的RNA测序分析外显（exo）和CDC外显（exo）-引物Mö确定miR-181为顶部miRNA外体候选

（A），描绘Fb之间变化的总RNA测序分析外显（exo）和美国疾病控制与预防中心外显（exo）在不同RNA类别的总RNA-seq读取数中，以Fb的折叠变化率表示外显（exo）/疾病预防控制中心外显（exo）.与所有转录本对齐的总读取数少于1000的RNA类别被省略。使用Illumina（蓝色）和Ion Torrent（红色）测序平台测序的文库分别显示，RNA类按两个平台的平均折叠变化排序。（B），miRNA类四个样本中每个样本的原始读取计数（其他类如所示补充图七).（C），火山图显示Fb之间677 miRNAs的相对表达变化外部和CDC外显（exo）通过DEseq2进行归一化和显著性测试，使用Illumina库作为一个复制品，使用Ion Torrent库作为第二个复制品（统计显著性反映了两个平台之间的一致性）。虚线水平线：未修正的p值为0.05；填充点：miRecords数据库中存在预测靶基因的miRNA，并在D–H中进一步分析；填充红点和红色标签：CDC靶点下调的miRNAs外显（exo）-极化M（详见D）。（D）CDC中预测靶点下调最显著的7个miRNAs外显（exo）-极化M，按重要性排序。顶部面板：所有预测miRNA基因靶点的折叠变化；底部面板：统计显著性（超几何检验，见补充方法)预测的miRNA靶点和下调基因之间的关联（−log10p值）；底部注释：CDC中过度表达的miRNAs外显（exo）与Fb相比外显（exo），来自C。（E），未经处理的M（rn-control）和CDC的比较外显（exo）-涂底漆M⁄（rn-MCDCexo公司)已发布数据集的基因表达25, 26只显示了大鼠（rn）、人和小鼠（mm）之间具有同源性的基因，而筛选出了在我们所有的M⏴样本中具有不可检测的低表达的基因。基因按rn-M中的差异表达排序CDCexo公司，从最下调（左，蓝色）到上调（右，红色）。基因表达值显示为相对于同一研究中其他样本的相对（对数转换）倍变化。（F），维恩图强调了rn-M基因集之间的高度显著关联CDCexo公司发布的miR-181a/b KO（miR-181 KO）胸腺细胞27; 使用超几何检验计算显著性值（参见补充方法). 我们模型中下调的基因（+CDC外显（exo）)与miR-181 KO胸腺细胞中上调的基因相关（左上象限，p=2.6E-147），反之亦然（右下象限，p=5.2E-79）。这些发现对于同一方向（右上象限和左下象限）调控的基因来说并不正确。（G），miRecords中预测的miR-181靶基因显示顺序与（E）相同，并且集中在那些下调rn-M的基因中CDCexo公司和上调miR-181 KO胸腺细胞。（H）维恩图显示了预测的miR-181靶点与rn-M中下调的基因之间的紧密联系CDCexo公司（p=1.3E-21）。使用超几何检验计算显著性值（参见补充方法). 有关样本量和其他方法，请参阅补充方法。

miR-181作为CDC的候选效应物外显（exo）-介导M极化

调查CDC的影响外显（exo）miRNAs在M上，我们对两个未致敏（对照）或CDC的生物复制品进行了RNA-seq外显（exo）-涂底漆（CDC外显（exo）)大鼠BM衍生M。然后，我们使用了NextBio功能注释数据库（Illumina Inc.）中的基因注释24研究CDC暴露后表达改变的基因的功能外显（exo）具体来说，我们将差异调节基因与miRecords数据库中预测的miRNA靶点进行了比较（逆向通路分析25,26)，并发现CDC中富含几个miRNAs的靶基因外显（exo）CDC主要下调外部-处理过的M(图6D). 对于相同大小的随机排列基因集，未观察到miRNA靶基因的这种下调(补充图VIIIA). 在Fb中比例较高表达的miRNAs外显（exo）（例如，miR-30和let-7）也在CDC中下调外显（exo）-素数M⁄可能反映较高绝对的CDC中这些miRNAs的水平外部(图6A). 与这一解释一致，我们发现所有被检测的高表达miRNAs的预测靶点显著下调，无论它们在CDC中的表达比例是否较高外显（exo）或Fb外显（exo）(补充图VIIIB). 然而，CDC中三种最重要的miRNAs（miR-181、miR-27和miR-19）均比例较高外显（exo），因此代表了授予M中观察到的功能变化的有力候选人(图6D). miR-181在CDC中的比例丰度也高出10倍以上外显（exo）与Fb外显（exo）(图6C)与miR-19和miR-27相比（两者的丰度都高出2倍以下）。这些数据表明miR-181家族是CDC中关键监管货物的有力候选外显（exo）。

进一步探讨CDC的转录变化外显（exo）-处理M后，我们对我们的RNA-seq数据集与两个已发表的啮齿动物免疫细胞RNA-seq-数据集进行了无偏比较(图6E). 首先，我们比较了CDC的表达变化外部-将处理过的细胞转换为小鼠MRNA-seq数据集23这揭示了类似的基因表达变化模式，我们的未致敏大鼠M类似于小鼠M0状态，CDC外显（exo）-类似小鼠M2状态的预激大鼠M⁄(图6E). 由于两个数据集之间没有观察到完全一致，这些发现支持了这一概念16那个CDC外部-素数M⁄不是普通的M2 M⁄，而是位于M1-M2光谱内（或之外）的某个位置。接下来，我们比较了小鼠miR-181a/b敲除（KO）胸腺细胞数据集22与CDC合作外显（exo）-涂底漆M⁄(图6，E&F). 这种特殊的扰动是NextBio数据库中数千个基因扰动数据集中相关性最强的一个，我们的结果显示了非常强的一致性(图6E). 在两个重复中重叠具有统计显著表达变化的基因表明，那些在我们的模型中下调的基因（+CDC外显（exo）)与miR-181a/b KO胸腺细胞上调基因显著相关（p=2.6E-147）(图6F，左上象限），反之亦然(图6F，右下象限，p=5.2E-79）。此外，当根据基因本体（GO）注释进行分组时，这些基因聚集在与翻译、代谢和氧化磷酸化增加相关的生物过程中(补充表2). 我们模型中下调的基因与miR-181a/b KO胸腺细胞下调的基因没有统计学关联(图6F，左下象限），反之亦然(图6F，右上象限）。这种关联性甚至强于预测的miR-181靶点（p=1.3E-21，图6，G&H)进一步支持miR-181可能是调控CDC的关键因子的观点外显（exo）以及迄今为止CDC中观察到的转录组变化最有希望的单一候选介质外显（exo）-涂底漆M⁄。

外泌体中的miR-181b具有心脏保护作用

miR-181家族由四个已知成员组成（miR-181a、−181b、−81c和−181d），它们被认为是髓系白血病和干细胞分化的调节剂27为了更好地了解miR-181的功能作用，我们评估了CDC和CDC中miR-181-家族成员的基因表达模式外显（exo）(图7A; qPCR检测不到miR-181c和miR-181d，因此没有出现）。人类CDC中miR-181a（而非miR-181b）的水平高于Fbs(图7A). 疾病预防控制中心外显（exo）另一方面，miR-181b高度富集，但miR-181a不富集，这表明miRNA货物高度选择性地转移到CDC外显（exo）(图7A和补充图IXA)如其他细胞类型中的其他miRNA所示28miR-181a和miR-181b的表达水平在各种分离的心肌细胞类型（如心肌细胞、内皮细胞、M；补充图IXB)并且在缺血损伤之前或之后未经治疗的动物心脏内没有改变(图7C).

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miR-181b的外体转移减少IR损伤后的梗死面积

（A），人CDC miR-181a（但不是miR-181b）表达升高，而CDC外显（exo）相对于Fb和Fb富集了miR-181b（但不是miR-181a外显（exo）分别为（n=3/组）。（B），IR损伤48小时后典型TTC染色心脏。Fb公司exo（置乱）：磅外显（exo）与miR-181b争夺；Fb公司exo（模拟）：磅外显（exo）miR-181b模拟物；疾病预防控制中心exo（置乱）：CDC外显（exo）miR-181b加扰；疾病预防控制中心exo（安塔戈米尔）：CDC外显（exo）使用miR-181b antagomir。（C）miR-181a和miR-181b在正常化为肝脏的非梗死和梗死大鼠组织中的表达。LV：左心室；RV：右心室；BZ：边界区；IZ：梗死区；新西兰：正常区（n=4/组）。（D），量化（C）中梗死质量百分比（n=4-8/组）。（E），CD68+M的定量(补充图十一). 图表描述了平均值+/-SEM。使用双向方差分析，然后是Holm-Sidak的多重校正测试或单向方差分析，最后是Tukey的多重校正检测来确定统计显著性*P<0.05。

我们测试了miR-181b对各种心肌细胞类型的影响，包括内皮细胞和M，在体外.与已知目标一致29使用miR-181b而非miR-Scramble治疗，内皮细胞中E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的转录水平降低(补充图XA). 有趣的是，这些效应在CDC之后以类似的方式重现外显（exo）或Fb外显（exo）使用miR-181b，但不使用Fb外显（exo），治疗(补充图XB). 接下来，我们进行了划痕试验，以检测miR-181b是否调节内皮细胞迁移。而CDC外部增强型刮盖在体外，miR-181b单独没有作用(补充图X、C&D).

进一步验证外体miR-181b的功能功效体内，我们在Fb中过度表达miR-181b外显（exo）（miR-181b天然含量低）或在CDC中拮抗miR-181 b外显（exo）在我们的大鼠模型中测量梗死面积(图2A). 简单地说，Fb外显（exo）转染miR-181b模拟物（Fbexo（模拟）) (补充图IXC)和CDC外显（exo）用antagomir转染miR-181b（CDCexo（安塔戈米尔）); miR-scramb被用作两种外泌体（Fb）的转染对照exo（加扰）和CDCexo（置乱）). 再灌注48小时后，Fbexo（模拟）和CDCexo（置乱）减少梗死面积和M⏴浸润，尽管程度不如疾病控制与预防中心外显（exo），相对于Fb外显（exo），磅exo（置乱）和CDCexo（安塔戈米尔）(图7、B、D和E;补充图十一). 因此，miR-181b复制了CDC的心脏保护作用外部而阻断miR-181b可以减弱这些影响。

miR-181b抑制蛋白激酶Cδ（PKCδ）的表达

为了更好地理解miR-181b如何导致心脏保护，我们在CDC中研究了miR-181 b的靶基因外显（exo）-处理过的M。在已知的miR-181b靶点中，蛋白激酶Cδ（PKCδ；prkcd公司)是最显著的下调之一（4.82E-30）(图7F). 与以前的报告一致27，的表达式级别prkcd公司与miR-干扰控制相比，转染miR-181b的M减少(图8A). PKCδ增强炎症基因表达（例如TNFα）30以及细胞分化、生长和死亡31和PKCδ抑制剂可诱导或增强心脏保护32,33因此，我们假设PKCδ作为CDC的下游效应器外显（exo）-介导的心脏保护，通过miR-181b诱导的抑制prkcd公司单位为M。为了验证这个假设，我们转染了一种特殊的小干扰RNA（siRNA），这种小干扰RNA可以有效地抑制prkcd公司(图8B). 鉴于我们之前的证明，CDC-条件化M的过继转移模拟了CDC的心脏保护作用，我们修改了我们的IR大鼠模型(图2A)采用转染PKCδsiRNA（M⁄（PKCδsiRNA）)或干扰siRNA（M⁄（扰乱siRNA）). 采用转移M（PKCδsiRNA）梗死面积缩小(图8，C&D)模仿CDC的效果外显（exo）(图2&图7). 因此，我们的数据和已发表的工作与miR-181b在CDC中抑制PKCδ的假设一致外显（exo）CDC诱导的心脏保护的基础(图8E).

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具有降低的PKCδ水平的M的过继转移(prkcd公司)有心脏保护作用

（A），用miR-181b模拟物处理的M减少了prkcd公司表达（n=3–4/组）。（B），经PKCδsiRNA（10nM）处理的M减少prkcd公司表达（n=3/组）。（C），红外损伤后48小时TTC染色心脏的代表性图像和M的过继转移，如图所示：M⁄（PKCδsiRNA）：用PKCδsiRNA预处理的M；千分之一（加扰）：Mí用干扰siRNA预处理。（D），量化（C）中梗死质量百分比（n=5/组）。（E），我们工作假设的示意图：（i）CDC分泌外泌体（CDC外显（exo）)具有心脏保护作用（证据图1–三); （ii）CDC外部，富含miR-181b，改变M的极化状态(图4–6); （iii）miR-181b在外泌体中的富集可重演心脏保护(图7); （iv）miR-181b下调M⁄中的PKCδ，至少部分负责CDC的心脏保护反应外显（exo）(图8). 图表描述了平均值+/-SEM。使用Student t检验确定统计显著性*P<0.05。

尽管有令人信服的证据表明PKCδ可能是下游效应物，但很明显，外泌体及其miRNA具有蛋白质效应，这可能是协同作用；挑选一个候选人可能会过分简化实际的生物学。补充表3列出了与M极化有关的其他miR-181b靶点，这些靶点在CDC中下调外显（exo）-涂底漆M⁄。相反，我们观察到miR-181a/b KO胸腺细胞上调（和下调）；图6F（右下象限）与M极化、氧化磷酸化和吞噬作用相关的几个基因(补充表4). 总的来说，这些数据表明CDC的M极化发生了巨大变化外显（exo）减少促炎信号并增强吞噬作用以促进心脏保护反应体内。

讨论

心肌缺血再灌注损伤导致潜在心肌（心肌细胞、内皮细胞等）坏死和凋亡34IR损伤后的急性炎症反应是一个生理上典型的事件序列，始于中性粒细胞的动员和浸润，随后是M35。一些研究强调了M在心肌组织损伤模型中的重要性，包括心肌梗死中M耗竭的研究2,16,36MI的再生模型4或心尖部心肌切除术37也越来越清楚地看到M异质性（光谱中极化状态的差异，通常由极端的M1和M2状态定义38)是一个精细的过程，高度依赖于微环境线索（蛋白质依赖性38，细胞外小泡39或pH/离子失衡40).

在过去的十年中，尽管细胞保留有限，但细胞治疗在缺血性疾病的治疗中取得了一些成功41我们小组最近在猪身上进行了试验17和老鼠16一种称为细胞后处理的新的心脏保护过程的存在：在再灌注30分钟内输送的CDC可显著减小梗死面积。巨噬细胞是细胞后处理所必需的，并且似乎通过采用独特的高吞噬细胞极化状态（非M1、非M2）来应对CDC而发挥作用16我们还发现CDC外泌体（CDC外显（exo）)增加存活质量，促进血管生成，减少已建立心肌梗死的瘢痕大小9,14。

外显子是有趣的旁分泌信号，可以将有效载荷从一个细胞传递到另一个细胞12毫不奇怪，外泌体的内容物极其多样，并且在不同的细胞类型之间差异很大。其特征特征反映在其囊泡成分（脂质、蛋白质、小RNA等）、异质性（加载和卸载囊泡的总数）和浓度（分泌的颗粒数量）上体内和在体外21它们在时间和空间上受到环境线索的进一步调节42.我们的实验室9,14以及至少2个其他10,43已经证明了来自心脏干细胞群体的外泌体的生物活性。

这里，我们展示了CDC外显（exo）是一个独特的外显体群体，具有独特的蛋白表达模式（CD63、HSP70和CD105）和miR谱（包括miR-181b的高表达）。与心脏成纤维细胞分泌的外泌体相反，CDC外部不要加重组织损伤44; 相反，它们通过定位于缺血组织、减小梗死面积、减少CD68+M的总数以及将M⁄的极化状态转变为不同的表型，在再灌注后提供心脏保护。有趣的是，CDC外显（exo）似乎特别位于梗死心肌的损伤部位。定位到这个感兴趣的区域可能会导致微环境的局部重组，并使招募的单核细胞/M极化为修复表型。尽管CDC的机制外显（exo）定位仍有待确定，归巢信号，如血管紧张素II I型受体（靶向心肌细胞、骨骼肌和肠系膜阻力小动脉的外泌体）45可能负责损伤部位的胞外体滞留。此外，美国疾病控制与预防中心外显（exo）增强M的内源性吞噬能力，这是一种特征性特征，可增强坏死细胞碎片的清除，缓解梗死心脏内过度的促炎性应激35（一个有益的过程被称为胞吐46).

这项工作进一步扩展了我们对CDC如何提供心脏保护和M极化的理解16.通过对来自CDC和CDC的转录组数据进行逆向通路分析外显（exo）（货物）和CDC外显（exo）-引物Mö（受体），我们能够精确定位CDC通过的一个关键RNA成分外显（exo）赋予这些功能优势。根据公开的基因表达和miRNA靶点预测数据库探索我们自己的测序数据，我们确定miR-181b为我们的首选候选基因；这种miRNA在CDC中显示出最高的相对丰度外显（exo）CDC靶基因下调的相关性最强外显（exo）-涂底漆M⁄。miR-181b与内皮细胞NF-κB信号的减弱有关29,47急性髓性白血病骨髓分化的抑制27，与我们的研究结果一致外显（exo）-启动的Mö减少促炎基因表达，并使Mö极化远离M1表型。此外，观察到miR-181b靶蛋白PKCδ的抑制以及参与翻译和氧化磷酸化的基因的伴随增加提示CDC外显（exo）改变M的代谢曲线48朝向心脏保护表型。将miR-181b模拟物添加到其他惰性Fb中外显（exo）定性复制CDC外显（exo）心脏保护，同时在CDC中阻断miR-181b外显（exo）削弱心脏保护。尽管证据表明miR-181b在减少梗死面积和M极化方面具有功能性功效，但与我们的CDC缺乏完全一致性外显（exo）数据并不令人惊讶。疾病预防控制中心外显（exo）含有大量的小RNA和蛋白质，而不仅仅是miR-181b。许多其他成分无疑具有生物活性，作为一个整体发挥整体功能优势。

我们的数据为CDC的作用提供了有力的证据外显（exo）极化M至改善损伤后愈合反应的表型。具体来说，我们证明miR-181b是CDC的关键成分外显（exo）通过将PKCδ定位在M内以诱导独特的极化状态，从而实现心脏保护。这些数据增加了CDC之前的心脏保护/心脏再生特性列表外显（exo）（抗纤维化作用；减少心肌细胞死亡和肥大；心肌再生；改善心脏功能；血管生成）9,11,14虽然我们在这里将miR-181b定义为CDC中的一个重要成分外显（exo）CDC的剩余成分（其他非编码RNA以及蛋白质和脂质）外显（exo）需要进一步检查49揭示CDC的合成、释放、归巢、通路调节和细胞摄取的细节外显（exo） 在体外和体内同样，虽然我们已经暗示PKCδ是CDC的一个下游贡献者外显（exo）-介导的心脏保护，其他可能的效应物仍有待研究。这种冗余性与外显体包含大量生物活性分子的概念是一致的，这些生物活性分子可以协同作用于多种信号通路50。

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临床展望

新增内容？

  • 在这里，我们发现外泌体介导了急性心肌梗死大鼠再灌注后给予的心球衍生细胞（CDCs）的心脏保护作用。
  • 用CDC或其分泌的外泌体治疗可缩小梗死面积并改善功能恢复。
  • CDC衍生外泌体中的一种特异性microRNA物种作用于巨噬细胞，被认为是心脏保护益处的关键介体。

临床意义是什么？

补充材料

在线数据补充

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致谢

我们感谢Jackie Valle、Elijah Kravets、Carolina Castillo、Baiming Sun、Antonio Echavez和Xiaoyu Da提供的技术援助。

资金来源

这项工作得到了Cedars-Sinai医疗中心董事会的支持。国家卫生研究院（R01HL124074）和国防部（CSR205330）向EM提供了一般实验室支持。

脚注

披露

EM持有创办人在Capricor Inc.的股权，并担任其无酬顾问。GdC是Capricor的有偿顾问。Capricor既没有为这项工作提供资金，也没有对手稿的批准权。其他作者声明没有相互竞争的经济利益。

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