美国国家科学院院刊。2005年2月22日；102(8): 2760–2765.
来自封面
泛素化货物的氯氰菊酯非依赖性内吞作用
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萨拉·西吉斯蒙德
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
Tanja Woelk公司
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
克劳迪娅·普里
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
埃琳娜·马斯佩罗
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini'82012年，意大利米兰
卡洛·塔切蒂
*Istituto FIRC di Oncologia Molecolare，Via Adamello 162013，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
彼得罗·特雷迪科
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
Paolo Di Fiore码头
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
西蒙娜·波罗
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini'82012年，意大利米兰
*Molecolare肿瘤研究所，Via Adamello 16，20139，意大利米兰；†意大利热那亚大学分子肿瘤研究所细胞肿瘤学和超微结构中心，邮编：16132，Via deToni 14；†欧洲肿瘤研究所，Via Ripamonti 435，20141 Milan，Italy；和§米兰大学，Via di Rudini’8，20122 Milan，Italy
彼得罗·德卡米利（Pietro De Camilli），耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文，2004年12月29日
- 补充资料
支持信息
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摘要
质膜受体可以通过氯菊酯依赖和非氯菊酯途径被内吞。这里，我们表明，当用低剂量EGF刺激时，表皮生长因子受体（EGFR）几乎完全通过网格蛋白途径内化，而不是泛素化。然而，当配体浓度较高时，随着受体变得泛素化，大部分受体通过不依赖于网格蛋白、依赖于脂筏的途径被内吞。泛素化受损的EGFR突变体通过网格蛋白途径内化，而仅能通过其泛素（Ub）部分发出信号的EGFR/泛素嵌合体仅通过非网格蛋白途径内化。泛素化EGFR的非板条蛋白内化依赖于其与包含Ub-相互作用基序的蛋白质的相互作用，如三种Ub-交互作用基序蛋白eps15、eps15R和epsin的消融所示。因此，eps15s和epsin在将泛素化的货物与网格蛋白非依赖性内化偶联方面发挥着重要作用。
关键词：内化、筏、小窝、泛素化、泛素相互作用母题
泛素化是一种翻译后修饰，通过Ub连接酶（E3酶）的作用，底物蛋白与短的高度保守肽泛素（Ub）结合。多泛素化是指在其中附加一条Ub链，以蛋白质为靶点进行蛋白酶体降解(1). 然而，当一个单一的Ub部分被附加（单泛素化）时，修饰通过与含有Ub结合域的细胞内蛋白质（如Ub相互作用基序（UIM））的相互作用发挥信号装置的作用(2). 在酵母中，单泛素化被认为是一种内化信号已有相当一段时间了(三). 然而，在哺乳动物中，这种联系仍然更加难以捉摸。
我们对受体酪氨酸激酶内化的机制感兴趣，特别是表皮生长因子受体（EGFR）。EGFR在多个位点是单泛素化的(4)通过E3酶Cbl的作用。虽然对Cbl和受体泛素化在EGFR细胞内分选中的作用有共识，但它们在内吞内化步骤中的作用尚不清楚(5,6). 为了深入了解这个问题，我们制作了一个嵌合体，其中EGFR的细胞外和跨膜域融合到一个突变Ub（Ubmut），无法形成多Ub链（EGFR/Ubmut）。通过这种嵌合体，我们表明泛素化足以内化(4). 本研究旨在阐明受体泛素化指导内化的分子机制。
材料和方法
转染和生化研究。使用脂质体或寡效胺（Invitrogen）进行转染。对于生化实验，细胞需要血清，然后在37°C下用EGF（100 ng/ml，除非另有说明）刺激。如参考文献所述进行裂解、免疫沉淀和免疫印迹。7质粒、药理剂和抗体在支持材料和方法，发布为支持信息在PNAS网站上。
基因沉默。通过编码特定靶向序列的pSUPER载体获得eps15、eps15R或epsin的基因沉默。测试了两种不同的小干扰RNA/靶点，结果具有可比性。通过与携带嘌呤霉素抗性的质粒共转染获得稳定的克隆。对三个独立克隆进行了分析，结果相似。通过瞬时转染两种不同的短干扰RNA寡核苷酸（产生可比较的结果）来沉默网格蛋白重链(8,9). 更多详细信息请参阅支持材料和方法.
免疫荧光和内化研究。免疫荧光，罗丹明配体的内化，125I-EGF或13A9抗体的检测如参考文献所述。4在单细胞水平上，通过罗丹明-EGF和抗EGFR 13A9抗体（不干扰EGFR内化）监测内吞作用，具有可比较的结果（图片中仅显示了两种程序中的一种）。在0°C下添加罗丹明化EGF（1μg/ml）或13A9抗体（在有EGF的情况下为20μg/ml。固定后，用Cy3-结合二抗检测13A9。在使用抗血凝素（抗HA）的分析中（参见)，用20μg/ml抗HA替代13A9。至少在两个重复的实验中进行定量分析（每个条件>100个细胞）。质膜染色与胞内囊泡相关染色进行比较。内化细胞显示出优势的细胞内染色，但很少（如果有的话）质膜染色。非内化细胞表现出相反的表型。
多重KD对内化的影响。(A类)(顶部)如图所示，对来自HeLa KD稳定克隆（+）的eps15/eps15R、epsin或eps15/eps15R/epsin（三重KD）的裂解液或来自使用不匹配寡核苷酸（-）获得的对照克隆的裂解液进行免疫印迹。(中部)EGFR水平在所有克隆中都具有可比性。(底部)网格蛋白KDs中网格蛋白的水平。(B类)(上部)用HA-EGFR/Ubmut嵌合体转染所示的HeLa KD克隆（参见支持材料和方法)以避免内源性EGFR的存在。用抗HA抗体评估内化情况。数据表示为内化被抑制的细胞百分比。(下部)用指示的eps15mut构建体转染表达HA-EGFR/Ubmut的HeLa三重KD克隆（参见支持材料和方法). 内化分析和条形图如所示上部这些实验的实际图像如图11所示。(C类)携带指示KD的HeLa克隆用1.5 ng/ml培养125I-EGF。内化率表示为内化/表面结合放射性。*,P（P）= 0.0164;**,P（P）= 0.003; 线性回归分析。(天)用filipin（+）或模拟处理（-）处理指示的HeLa KD克隆，然后用1.5或20 ng/ml培养125I-EGF在37°C下持续6分钟。内化率表示为内化/表面结合放射性。
免疫电子显微镜。预埋免疫标记（图。和 左侧和居中和)饥饿的预冷细胞在冰上用20μg/ml抗EGFR 13A9孵育30分钟，然后用兔抗小鼠（代码ZO412，DAKO）孵育，最后用10-nm蛋白A-gold孵育。然后用EGF在37°C下培养细胞2分钟（按指定剂量），并在室温下固定15分钟（2.5%戊二醛放在0.1 M二羧酸缓冲液中，pH值7.2），然后按照参考文献所述进行处理。10.超薄冰冻切片上的免疫金标记（图。 赖特和)按照参考文献中的报告执行。10。更多详细信息请参阅支持材料和方法.
不同剂量EGF下EGFR的内化。(A类)用免疫电子显微镜观察包衣凹坑（CP）、包衣囊泡（CV）、小窝（CAV）或小窝样结构（CVS）中HeLa细胞的EGFRwt。（巴，111纳米）(B类)将HeLa细胞的裂解液（1 mg）进行免疫沉淀（IP）或直接加载（50μg），并用所示抗体进行免疫印迹（IB）。
EGFR/Ub的内部化。(A类)表达EGFRwt或EGFR/Ubmut的NR6细胞用罗丹明-EGF（红色）处理（15分钟），并用网格蛋白或小窝蛋白（绿色）染色。(左侧)方框包围放大的区域赖特（放大倍数，×4）。在存在或不存在EGF的情况下，使用13A9抗EGFR抗体进行内化分析时，也获得了类似的结果（数据未显示）。(B类)NR6表达EGFR/Ubmut或EGFR/FLAG的免疫电镜观察(4)]. EGFR/Ubmut仅在小窝中检测到（分析了20个细胞轮廓）。（巴，83纳米）
UIM蛋白和EGFR/Ubmut。(A类)如上述凝胶所示，转染φ-NX细胞。如图所示，对裂解液（5 mg）进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。(B类)表达EGFR/Ubmut的NR6的免疫电子显微镜。（Bar，83 nm）箭头指向小窝膜。注意，在表达EGFR/FLAG对照嵌合体的细胞中，小窝中从未检测到eps15和epsin（数据未显示）。(C类)用EGFR/Ubmut和GFP或GFP-UIM（eps15的氨基酸842-897）共同转染CHO细胞，并用罗丹明-EGF（红色，左侧)或罗丹明转铁蛋白（红色，居中). 将显示合并的图像。(赖特)EGF内化的定量评估（3 ng/ml125I-EGF在37°C下持续15分钟）。
表1。
10个细胞轮廓的形态测量
| 有机硅 | 1.5 ng/ml时的EGF，%(n个) | 20 ng/ml时的EGF，%(n个) |
|---|
| 带标签的小窝 | 4 (72) | 22 (106) |
| 带标签的涂层坑 | 40 (35) | 30 (46) |
| caveolae黄金 | 1 (296) | 12 (383) |
| 涂层坑中的金 | 16（296） | 15 (383) |
结果
在表达内源性EGFR的HeLa细胞中，我们发现EGFR遵循不同的内化途径，这取决于EGF的剂量。我们使用了两种浓度的EGF（低EGF，1.5 ng/ml；高EGF，20 ng/ml），均在生理EGF水平范围内（血清中为1-2 ng/ml，其他几种生物液中为10-100 ng/ml支持材料和方法). 在低EGF时，EGFR主要定位于氯氰菊酯包被的凹坑，而在高EGF时受体在包被凹坑和小窝之间的分布大致相同(和). 在低EGF时，受体被显著酪氨酸磷酸化，并完全能够进行下游信号传导（如ERK激活所示），而只有在高EGF时才能检测到显著的泛素化(). 因此，EGFR泛素化状态与其被划分为小窝之间存在相关性。
我们已经证明，包含EGFR与Ub融合的胞外和跨膜结构域（EGFR/Ubmut）的嵌合体是构成性内化的(4). 通过利用这种嵌合体，其内化完全依赖于Ub部分的信号传递能力，我们努力确定泛素化如何指导内化。在EGFR-阴性NR6中()或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（数据未显示），内化的EGFR/Ub与小窝蛋白-1（非网格蛋白脂筏/小窝途径的标记物）广泛共定位，但与网格蛋白共定位较差，而转染的EGFR（EGFRwt）表现出相反的行为(). 通过免疫电子显微镜，我们仅在小窝中检测到EGFR/Ub()，而EGFRwt在包被的凹坑和小窝之间分配，优选包被的凹坑（数据未显示）。一致地，通过脂筏分形实验，EGFR/Ub在筏馏分中的分配比EGFRwt多10倍（图7，发表于支持信息在PNAS网站上）。
接下来，我们使用了内吞作用的药理学和主要阴性抑制剂，并比较测试了它们对EGFRwt、EGFR/Ubmut和一种不能有效招募Cbl的突变EGFR（Y1045F）的影响(11)，从而显示出泛素化显著减少(). 所有这些结构均在EGFR-阴性的CHO或NR6细胞中表达。
泛化和内化。(A类)表达EGFRwt或Y1045F的CHO细胞裂解物（5 mg）用所示抗体进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）。(B类)CHO细胞与所示的GFP标记和各种基于EGFR的构建物共转染，并与罗丹明-EGF孵育。条形图表示EGF内化被抑制的细胞百分比（标准化以控制GFP转染细胞）。(C类)用指定的药物处理表达指定结构的NR6细胞。在高EGF存在的情况下，用抗EGFR13A9抗体监测内化。(天)表达所示结构的NR6细胞用filipin处理，然后用20 ng/ml孵育125I-EGF在37°C下持续15分钟。内化率表示为内化/表面结合放射性。描述的实验的实际图像B类和C类如图8所示。
在最初的一组实验中，我们监测了罗丹明结合EGF的内化(; 参见图8，发布为支持信息在PNAS网站上）。一般内吞抑制剂DynaminII-K44A(12,13)废除EGFR/Ubmut、EGFRwt和Y1045F的内部化(). 相反，突变型eps15（Δ95/295）主要干扰AP2(14)或选择性干扰氯氰菊酯的角蛋白片段（A1/SRR）(15)对EGFR/Ubmut的内吞无效，同时减少EGFRwt和Y1045F的内化(). 允许优先干扰非网格蛋白内化的药理学工具（菲利平、制霉菌素和低剂量染料木素）(16,17)有效抑制EGFR/Ubmut的内化(). 值得注意的是，另一种包含转铁蛋白受体胞外结构域和胞内Ub的嵌合受体也通过制霉菌素和丝裂霉素敏感途径内化，而野生型转铁蛋白接收器则通过包衣小孔内化，对这些药物不敏感（图9，发表于支持信息在PNAS网站上）。药物对EGFRwt的抑制程度较轻，尽管显著(). 相反，Y1045F突变体的内化对这些抑制剂不敏感().
通过测量125I-EGF公司(). 在高EGF时，虽然EGFRwt的内化对filipin部分敏感，但该药物对Y1045突变体的内吞作用没有显著影响，但它将EGFR/Ub的内化降低到背景水平().
Ub如何与非网格蛋白内吞的细胞内机制耦合？一个含有UIM的蛋白质家族与内吞有关，eps15和epsin在质膜上起作用(10,18,19)和肝细胞生长因子受体底物（HRS）(20). 这些蛋白与EGFR/Ubmut共同免疫沉淀()也在含有嵌合体和caveolin-1的caveolae中发现(). 此外，分离的UIM的过表达抑制了EGFR/Ubmut的内化，但不抑制转铁蛋白受体的内化(). 最后，当EGFR/Ubmut被修改时，例如包含无法与UIM交互的Ub部分(21)，它再也无法内化（图10，发布为支持信息在PNAS网站上）。UIM蛋白也以配体依赖的方式与内源性EGFR共免疫沉淀，并且具有与内吞途径不同站点的功能相容的时间动力学(). 有趣的是，eps15在晚时间点显示出第二个关联高峰，这表明在内胚体水平上还有一个额外的作用，这也是最近提出的(22). 这种关联依赖于Ub和功能性UIM的存在，如Y1045F与三种UIM蛋白缺乏共免疫沉淀所示()以及缺乏带有突变eps15和epsin的内源性EGFR，它们在UIM中携带缺失(). 因此，无论是生物合成添加到EGFR/Ubmut中，还是翻译后添加到EGFR中，Ub都可能通过与UIM蛋白的相互作用将受体引导到非网格蛋白内化。
UIM蛋白与泛素化EGFR结合。(A类)对HeLa细胞的裂解物（5 mg）进行免疫沉淀（IP）和带有指示抗体的免疫印迹（IB）。(B类)CHO细胞瞬时共转染EGFRwt或Y1045F，并分别转染epsin、eps15和肝细胞生长因子受体底物（Hrs）。如图所示，对裂解液（2 mg）进行免疫沉淀/免疫印迹。(C类)用所示的编码野生型eps15或eps15-UIM缺失突变的FLAG标记构建物转染HeLa细胞[eps15Δ859–897(29)]，或野生型epsin，或epsin-UIM缺失突变体[epsinΔ190-192(29)]. FLAG是一个空的控制矢量。如图所示，对裂解液（2 mg）进行免疫沉淀/免疫印迹。
为了解决这一点，我们敲除了HeLa细胞中的（KD）eps15、eps15R（一种相关蛋白）和epsin(). EGFR/Ubmut的内吞作用在三重eps15/eps15R/epsin KD细胞中被消除，但在单个KD细胞内没有消除(; 见图11A类，发布为支持信息在PNAS网站上）。在三重KD细胞中重新表达eps15而不是eps15-UIM缺失突变体恢复了EGFR/Ub的内化(，见图11B类). 因此，当一种膜蛋白在制霉菌素/菲律宾蛋白敏感途径中作为其泛素化的功能被完全内化时，与UIM蛋白eps15/eps15R/epsin的相互作用至关重要。此外，eps15/eps15R和epsin的功能在该途径中是多余的。
然后我们研究了内源性EGFR的行为。最初，我们调查了氯氰菊酯的作用，因为报道了不一致的结果(8,9,23). 我们推断，在其中一项研究中，氯氰菊酯KD的罕见作用可以通过在内化分析中使用高EGF来解释(8). 根据我们目前的数据，在这些条件下，氯氰菊酯非依赖性途径（根据其制霉菌素/杀鼠灵敏感性定义）的作用将是巨大的。如所示在低EGF时，氯菊酯的KD（KD细胞中氯菊酯水平)几乎完全废除了内化，证明在这种情况下，绝对需要氯菊酯。接下来，我们测试了该途径是否需要含UIM的蛋白质。在低EGF时，尽管eps15/eps15R或epsin的个体KDs没有影响，但三个eps15/eps15R/epsin KD的EGFR内化显著降低(). 在低EGF条件下，用菲利平治疗任何KD都没有效果(). 这些结果与黄报道的结果一致等. (23)并证明eps15/eps15R和epsin也（冗余地）参与了网格蛋白途径。然而，它们并不是严格必要的，因为在没有它们的情况下，氯氰菊酯内吞也会继续进行。
在高EGF下，氯菊酯KD减少了约50%的内化。然而，网格蛋白KD细胞的filipin处理将残余内化降低到背景水平(). 这些结果表明存在两种内化方式，一种依赖于氯菊酯（低EGF），另一种依赖氯菊酯依赖和氯菊酯非依赖途径（高EGF）。三重eps15/eps15R/epsin KD也降低了EGFR在高EGF时的内吞作用，尽管是以对丝氨酸不敏感的方式，这表明在三重KD中，EGFR内吞作用中的非丝氨酸制霉菌素/丝氨酸敏感成分被完全消除(). eps15/eps15R或epsin的单个KDs没有效果，强化了这些蛋白质之间冗余的概念（数据未显示）。最后，四个eps15/eps15R/epsin/clashrin KD将高、低剂量EGFR内化降低到背景水平(). 结合EGFR/Ubmut获得的数据，这些结果证明eps15/eps15R和epsin对EGFR的非甲氰菊酯内化是（多余的）不可或缺的。
讨论
我们的研究揭示了EGFR与作为EGF剂量函数的内化机制耦合的机制中的重要差异。在低剂量配体下，受体几乎完全通过氯氰菊酯依赖机制内化，而在高剂量下，根据其制霉菌素/丝氨酸敏感性定义的非氯氰菊酯途径出现，并与氯氰嘌呤途径一样相关。值得注意的是，低和高EGF浓度在生理上是相关的，如支持材料和方法非氯氰菊酯途径的出现与可检测到的泛素化EGFR的出现相关。分子遗传学方法为这种相关性提供了一个机制基础，因为即使在高剂量EGF下，也会有一种不再泛素化的突变EGFR（Y1045F）通过网格蛋白途径内化。
还原论方法进一步证实了非网格蛋白途径对泛素化的依赖性，该方法利用只能通过Ub部分发出信号的嵌合分子。还应该指出，这些分子并不是受体的“真实”表征。在基于EGFR-的嵌合体的情况下，我们之前已经证明嵌合体是组成性内化的，并被传递到降解室，即使在没有配体刺激的情况下也是如此(4). 然而，一旦在holo-EGFR上确定了非网格蛋白内吞作用中泛素化的相关性，如前所述，嵌合体被证明在简化激活受体上的过多信号以及允许将内化仅仅作为货物泛素化功能的研究中非常有用。
我们的结果与数据一致，数据表明EGFR通过网格蛋白包被的小孔内化需要Cbl，但不需要受体泛素化(5,24). 这些后一发现也间接强调了其他下游内吞蛋白的Cbl执行泛素化对正确的网格蛋白内吞的重要性。Stang最近的一份报告等. (25)这表明EGFR向涂层凹坑发展需要Cbl依赖性泛素化，进一步强化了这一概念。综上所述，我们的发现表明了一种机制，通过这种机制，内吞机制的泛素化，而非货物泛素化是内化到包被凹坑中所必需的。然而，在较高剂量的EGF下，当货物泛素化变得显著时，内吞作用部分转换为非网格蛋白途径。
这种“转换”是如何实现的？我们的结果直接暗示了eps15/eps15R和epsin在泛素化的货物中的招募，研究结果还表明EGFR/Ub嵌合物的表达能够诱导这些蛋白重新定位到小窝。此外，我们发现这些蛋白质在EGFR的非网格蛋白内吞作用中是多余必需的。信号是如何在该途径中进一步传播到这些分子下游的尚不清楚，需要进一步研究。此外，其他Ub结合蛋白也与内吞有关。因此，它们在泛素化货物内部化中的潜在作用（可能以细胞特有的方式）似乎也值得研究。
我们的结果还表明，eps15/eps15R和epsin在氯氰菊酯内化过程中发挥了作用（尽管不重要）。事实上，这些蛋白质与包衣凹坑的形成有关，并且被认为是泛素化货物和外套成分之间的适配器，如AP2和网格蛋白(2,26). 根据我们目前的数据，后一种可能性似乎不太可能，至少在低EGF浓度下，氯氰菊酯路线至关重要的情况下，这仅仅是因为在这些剂量下没有足够的货物泛素化。然而，我们之前已经表明，依赖于氯氰菊酯的突触小泡在秀丽隐杆线虫通过与dynamin的遗传相互作用机制，eps15的去除对其产生负面影响(27). 因此，至少在eps15的情况下，参与氯氰菊酯内吞可能涉及不同于与泛素化货物相互作用的机制。
最后，我们注意到TGF-β受体通过包衣凹坑和小凹内化(28). 这两种途径分别与受体信号增强和受体快速降解有关(28). 在表皮生长因子受体的情况下，在低表皮生长因子下（当内化完全通过包被凹坑进行时），受体已经完全能够进行效应器信号传导(). 相反，在高EGF时（当非氯氰菊酯内吞作用变得显著时），信号传导能力没有增加，但EGFR下调作用明显增加(). 因此，至少，小窝/筏内化对EGFR信号传导没有明显的贡献，并且可能优先与受体降解有关。
致谢
我们感谢A.Benmerah（巴黎第五大学）、P.De Camilli（耶鲁大学医学院，康涅狄格州纽黑文）、G.Gill（加州大学圣地亚哥分校，拉荷亚分校）、Genentech（加州南旧金山）、N.Sidenius和A.Andolfo（肿瘤研究所）提供试剂；P.Rubini和E.Cavallaro提供技术援助；以及P.De Camilli、A.Musaccchio、S.Confalonieri和G.Scita进行讨论。这项工作得到了意大利癌症研究协会（S.P.、P.P.D.F.和C.T.）、人类科学前沿计划、欧洲共同体（VI框架）和意大利卫生部（P.P.D.F）的资助。
笔记
缩写：KD，knowdown；Ub，泛素；UBmut，突变型Ub；UIM，Ub-相互作用基序；HA，血凝素。
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