在精神病患者中，皮层中间神经元过度表达DNA-甲基转移酶1

摘要

虽然单卵双胞胎携带相同的基因组序列，但它们可能表现出许多差异。事实上，在没有核苷酸序列突变的情况下，DNA可以通过胞嘧啶环的甲基化进行修饰。这种结构DNA修饰可以称为“表观遗传”，表示在传统遗传机制运行后发生的修饰(1).

在神经元中，包括谷氨酸脱羧酶67（GAD）在内的各种基因启动子CpG岛表达的胞嘧啶环5′位的表观遗传超甲基化₆₇)卷轴由DNA-甲基转移酶催化(2,三). 其中，DNA-甲基转移酶1（DNMT1）优先表达于Brodmann区（BA）10和BA17的皮质GABA分泌神经元，以及尾状核的中等棘神经元(4).

精神分裂症（SZ）患者（SZP）大脑中GABA能中间神经元（BA10）的reelin和GAD降低₆₇表达式(4–6)DNMT 1的表达增加(4).

在最近的一项研究中(7)发现人类reelin基因在GABA能神经元中的选择性表达受启动子CpG岛的表观遗传胞嘧啶高甲基化调控。事实上，当添加氮杂-2′-脱氧胞苷抑制DNMT1功能或组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导去甲基化下调DNMT1的功能时在体外瑞林的表达增加了几倍(7). 此外，在接受蛋氨酸（6.6 mmol/kg s.c.）15天的小鼠海马和额叶皮质中，瑞林和GAD的表达₆₇被下调(8,9).

总的来说，这些数据支持以下假设：(4,6,10–12)和GAD₆₇(5,13–15)使用不同患者队列的几个组报告的SZP在BA10或BA9中的表达可能与上述两个基因启动子中CpG岛的表观遗传超甲基化有关。此外，这种减少可能由SZP皮层GABA能神经元中DNMT1过度表达介导(4). GAD下调的唯一例外₆₇这种表达似乎在慢性住院老年人和精神错乱的SZP人群中发现(16).

斯坦利基金会对五个大脑队列进行了研究，每个队列的特征是是否存在特定的精神疾病[(我)深圳；(ii（ii）)双相情感障碍（BP）伴精神病（BP+）；(三)无精神病血压（BP-）；(四)无精神病的重度抑郁症；和(v（v）)非精神病受试者（NPS）、瑞林和GAD₆₇不仅SZP的BA9下调，而且BP+患者的BA9也下调(10). 有趣的是，GAD₆₇无精神病的重度抑郁症患者BA9 GABA能神经元的reelin表达没有降低。此外，就地对不同精神病患者队列的杂交研究表明GAD₆₇SZ或BP+患者前额叶皮层中层mRNA阳性神经元减少(5,13,15).

在本研究中，我们测试了SZ和BP+患者BA9的皮层GABA能神经元是否表达DNMT1 mRNA的选择性增加。这项研究是在McLean 66队列收集（哈佛脑组织资源中心，马萨诸塞州贝尔蒙特）获得的BA9组织切片上进行的。此集合包含(我)SZP、(ii（ii）)BP+患者(三)BP患者，以及(四)NPS（国家公园管理局）。我们解决了以下实验问题：

1. SZP脑BA10中间神经元DNMT1 mRNA表达上调(4)也存在于BA9的同源中间神经元中？
2. DNMT1表达上调是瑞林和GAD患者SZ和BP+患者大脑中的一个特殊特征吗₆₇也被下调了吗？
3. DNMT1 mRNA表达的增加与DNMT1蛋白水平的增加有关吗？
4. 是GAD的范围₆₇下调与同一神经元中DNMT1过度表达水平相关？

   SZ治疗的一个新趋势是联合使用抗精神病药物（APS）和丙戊酸钠（VPA），以提高APS的疗效(17,18). 因为VPA似乎可以通过(我)组蛋白去乙酰化酶的抑制(8,9,19)或(ii（ii）)DNA脱甲基诱导(9)可以推测，VPA诱导的染色质重塑有助于增强APS疗效。因此，该假设默认APS的疗效取决于染色质重塑。

   因为我们注意到，在McLean 66队列中的SZ和BP+患者的治疗中，VPA经常被用作APS的辅助物，我们还可以问：

5. VPA和APS联合使用是否降低了SZ或BP+患者皮层GABA能神经元DNMT1表达的上调？

方法

学科。从哈佛脑组织资源中心获得的BA9样本包括：19名SZ患者（3名精神分裂症患者和16名诊断为SZ的患者），19名BP患者（14名患有精神病，5名没有精神病），以及26名NPS大脑，其死后间隔（PMI）、性别和年龄相匹配(表1和表3，发布为支持信息在PNAS网站上）。这些精神病诊断是由两名资深精神科医生根据DSM IV标准，根据临床和家族史确定的。

组织收集和RNA完整性评估。尸检时，BA9块（表3）固定在4%甲醛中。从额极开始，沿冠状轴将大脑顶部切割成0.5厘米厚的薄片。因为BA9被包括在我们研究的第2节和第5节之间，所以我们得到了每个大脑的相同部分。在组织学制备前72小时，将所研究的每个样品在0.1 M PBS中转移到30%蔗糖中。

RNA质量由哈佛脑组织资源中心确定(http://www.brainbank.mclean.org/). 阵列上检测到的探针组总数的百分比（出现调用的百分比）、基因3′/5′[甘油醛-3-磷酸脱氢酶和β-肌动蛋白]比率，以及用Affymetrix’s马斯软件与安捷伦rRNA 18S/28S比值一起用于纳入或排除国家大脑数据库中的一例病例。

现场杂交（DNMT1和GAD₆₇).评估DNMT1和GAD的变化₆₇从上述队列的精神病患者和NPS中获得的BA9中的mRNA表达，使用以下顺序的标准对样本进行单独匹配：(我)pH和mRNA质量(ii（ii）)性别(三)年龄差异(四)PMI，以及(v（v）)半球。每个诊断组的一名患者同时接受常规治疗。然而，由于NPS和SZP组的患者数量大于BP组，在某些情况下，使用一个BP患者样本处理两个NPS和两个SZP样本。

为了可视化DNMT1 mRNA信号，将40μm厚的自由漂浮切片与两种与人类DNMT1 cDNA碱基1627–1650和4801–4824互补的反义寡核苷酸探针混合培养。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_001379”，“term_id”：“1677703423”，“term_text”：“NM_001378”}}NM_001379号). 检测GAD₆₇mRNA，我们将切片与人类GAD的反义探针1063–1086和2674–2697杂交₆₇cDNA（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_000817”，“term_id”：“1519242838”，“term_text”：“NM_000817“}}NM_000817号). Veldic中详细描述了这种探针的特异性等. (4).现场根据Rodriguez进行杂交等. (20)和Veldic等. (4).

免疫组织化学[DNMT1和神经元特异性核蛋白（NeuN）]。为了获得NeuN免疫标记，根据Rodriguez描述的程序，用稀释为1:500的小鼠抗NeuN单克隆抗血清（Chemicon）在4°C下培养40μm的漂浮切片3天等. (20)

用稀释1:2500的兔抗DNMT1抗血清（新英格兰生物实验室）孵育3天，在40μm漂浮切片中观察到DNMT1蛋白阳性神经元。在初步实验中，已确定以1:2500稀释度与抗DNMT1抗体孵育是必要的，足以标记每个给定切片中的最高神经元数量。

用人小脑提取物的Western blot分析检测DNMT1抗体的特异性。经10%SDS/PAGE和印迹后，检测到一条主要的免疫反应带。该条带的迁移率与在凝胶上运行10 ng重组DNMT1蛋白获得的迁移率相同。

无偏三维计数。无偏三维计数的标准和我们测量的再现性在支持文本，发布为支持信息在PNAS网站上。

细胞计数采用共聚焦显微镜，放大倍数为×40，以获取整个样本的连续光学切片z（z）轴。该方法通过使用Veldic的改进，允许在完全嵌入组织切片中的计数盒（100×100×20μm）中对二氨基联苯胺阳性细胞进行计数等. (4)Williams和Rakic描述的三维细胞计数过程(21).

对每个盒子中计数的细胞进行组织收缩校正，在我们的实验条件下，组织收缩在30%到35%之间。根据制造商的规范（德国莱卡Wetzlar），通过共焦显微镜测量每个截面的厚度，从试样的上表面到下表面，在间隔为2μm的截面上聚焦。

为了计数强染色细胞并从分析中排除弱染色细胞或非特定标记细胞，在3倍背景下建立染色阈值强度（由Leica Confocal软件测量）。

数字显微照片。图像由捕获公理视觉3.1（蔡司）。最终复合材料使用photoshop（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems）和幻灯片演示文稿软件（微软）。

统计分析。为了测试人口统计学和其他背景变量是否影响实验组和对照组之间的差异，我们对正常对照组和三个诊断组中有意义的变量进行了方差分析测试。我们评估了每个变量与不同诊断效果的相互作用，并给出了F类值和P（P）表和图图例中的这些评估值。

结果

SZ和BP+患者BA9中DNMT1 mRNA-阳性神经元密度增加。SZ患者DNMT1 mRNA阳性神经元的总数较高(表2)但与NPS相比，整个BP患者组中没有。BP患者队列被细分为两个亚组：(我)精神病患者（BP+）(n个=14）和(ii（ii）)无精神病患者（BP-）(n个= 5) (表2). 将BP+患者与NPS和BP患者与NPS进行两组配对比较，发现BP+组DNMT1 mRNA-阳性神经元密度显著增加，但BP组没有增加(表2).

此外，这种效果似乎是层特定的。因此，与NPS相比，SZ和BP+患者第一层DNMT1 mRNA表达神经元的数量显著增加30-40%(图1). 在SZ和BP+患者的第二层和第四层中，DNMT1 mRNA阳性神经元的数量也显著增加，尽管这种增加较为温和(图1). 在所有层中，BP+患者DNMT1mRNA阳性神经元的增加密度略低于SZP患者，但SZ和BP+患者之间DNMT1mRNA增加的程度没有显著差异。在第III、V和VI层中未检测到DNMT1 mRNA阳性神经元数量的显著变化。

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图1。

非精神病患者和精神病患者BA9各层中DNMT1 mRNA阳性神经元计数。对于NPS，n个= 26; 对于SZP，n个= 19; 对于BP+患者，n个= 14; 对于BP患者，n个= 5. 通过方差分析计算患有或不患有精神病的SZP和BP患者与NPS之间的差异，以及P（P）通过Dunnett的双边测试比较评估值。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05. 误差条代表SEM。

一个典型的例子显示，与NPS相比，SZP第一层和第二层中DNMT1 mRNA的数值密度增加，如图2A类注意，在层I和层II中就地DNMT1的杂交信号定位于小圆细胞(图2). 虽然已知第一层神经元几乎完全是GABA能神经元(22)，我们已经表明，在BA10的第二层，DNMT1 mRNA信号与GAD共定位_65/67和瑞林免疫反应性，但与胶质纤维酸性蛋白（胶质细胞标记物）或囊泡谷氨酸转运体2（锥体神经元标记物）免疫反应性无关(4). BA9和BA10中DNMT1 mRNA阳性神经元的分布和形态基本相同。这种分布和形态上的相似性使我们推断，DNMT1 mRNA的过度表达也发生在BA9的GABA能中间神经元中。

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图2。

照片显示了来自一个NPS和一个SZP的BA9的第一层和第二层中DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白神经元表达的示例。(A类)DNMT1 mRNA就地杂交信号。(B类)DNMT1蛋白免疫标记。注意SZP中神经元DNMT1 mRNA和蛋白标记增加。（比例尺，20μm）

在患有BP的受试者中-(n个=5）与NPS相比，DNMT1 mRNA阳性神经元的数量没有增加(图1).

在所研究的不同组的上述皮质层中，NeuN-免疫阳性神经元的数量密度相似。例如，在DNMT1增加最大的第二层中，SZP中NeuN-阳性细胞±SD的数量几乎相同[（92±15）/mm^三× 10^三]，血压+患者[（94±16）/mm^三× 10^三]，血压-患者[（90±13）/mm^三× 10^三]和NPS[（88±12）/mm^三× 10^三].

BA9神经元中的DNMT1-样免疫反应性（LI）。在我们测量DNMT1 mRNA阳性神经元数密度的同一组患者中，我们也测量了DNMT1-LI阳性神经元的数密度。

在合并的精神病患者组（SZP和BP+患者）的BA9中，n个=33），表达DNMT1-LI的神经元数量[（第一层，18±0.5；第二层，41±1.6；第四层，34±1.2 SEM）×10^三/毫米^三]高于NPS(n个=26）[（第一层，15±0.6；第二层，35±1.8；第四层，30±1.3 SEM）×10^三/毫米^三].P（P）=0.009（第一层），P（P）=0.03（第二层），以及P（P）与NPS相比，精神病患者第四层=0.028。

NPS和精神病患者的第三层和第五层表达相似的DNMT1-LI计数。与NPS相比，SZ患者第一层和第二层DNMTI-LI阳性神经元数量密度增加的典型示例如下图2B类.

GAD密度₆₇SZ和BP+患者的mRNA-阳性神经元减少。GAD的数值密度₆₇第一层mRNA阳性神经元减少(P（P）<0.001）和II(P（P）<0.001）SZP[（第一层，16±0.7；第二层，36±1.4 SEM）×10^三/毫米^三]和BP+患者[（第一层，16±0.8；第二层，36±1.3 SEM）×10^三/毫米^三]与NPS相比[（第一层，20±0.7；第二层，44±1.0 SEM）×10^三/毫米^三] (P（P）NPS与SZP之比<0.001，以及P（P）=I层NPS与BP+患者的0.002；P（P）NPS与SZP之比<0.001，以及P（P）第二层中NPS与BP+患者的对比<0.001）。

我们还测量了GAD的数值密度₆₇mRNA阳性神经元与DNMT1 mRNA阳性细胞的比较。在合并的SZP和BP+组中(图3)GAD的密度₆₇第一层mRNA阳性神经元减少约20%，而在同一患者中，DNMT1 mRNA阳性细胞的数量密度增加37%。在第二层中，GAD的密度₆₇SZP和BP+联合组mRNA阳性神经元减少约19%(F类_1,58= 33.0;P（P）<0.001）然而，在相同的患者中，DNMT1 mRNA阳性神经元的数量密度增加了25%(F类_1,58= 22.7;P（P）< 0.001). 有趣的是，在第一层，GAD的数量₆₇mRNA阳性神经元与DNMT1阳性神经元的数量呈负相关（参见图3).

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图3。

GAD之间的负相关₆₇NPS BA9第一层中的DNMT1 mRNAs阳性神经元(n个=26）和精神病患者（SZ+BP+）（PP）(n个= 33). (A类)GAD的NPS和PP之间的差异₆₇和DNMT1 mRNAs阳性神经元通过ANOVA计算，然后进行Bonferroni比较。*，P（P）< 0.001. 误差条代表SEM(B类)DNMT1 mRNA阳性神经元数量与GAD数量的Pearson相关性₆₇mRNA阳性神经元。

人口统计学变量。PMI和其他人口统计学变量的平均值（性别、死亡年龄、死因、脑pH值、3′/5′甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA比值、3′/5′β-肌动蛋白mRNA比值，RNA28S/18S比值、出现呼叫的百分比、样品在甲醛中保存的时间以及半球侧性差异）在所有四组中都是相似的(表1). 所有这些变量与DNMT1 mRNA、DNMT1蛋白和GAD数值密度的皮尔逊相关性₆₇第一层和第二层中的mRNA阳性神经元均无显著意义（表4，发表于支持信息在PNAS网站上）。死后大脑PMI为数小时；此外，PMI的范围从5小时到一天以上（即41小时）。尽管在使用尼塞尔染色和电子显微镜进行的初步光学显微镜研究中，哈佛收藏馆的大脑结构似乎得到了很好的保存，但一个合理的问题是PMI持续时间是否在相当程度上影响我们的测量结果。因此，我们研究了固定在不同PMI的小鼠大脑中DNMT1 mRNA表达水平的变化。在长达24小时（室温下4小时，4°C下20小时）的时间内，我们未能检测到小鼠额叶皮层中DNMT1 mRNA阳性细胞数量的任何显著变化。

有报告表明，包括昏迷、缺氧、发热、损伤和神经毒性物质在内的痛苦因素会影响大脑pH值，并可能改变死后大脑组织中RNA的完整性(23). pH或mRNA质量与DNMT1 mRNA、DNMT1蛋白和GAD的Pearson相关性₆₇NPS、SZ或BP患者的mRNA阳性神经元均无显著意义（表4）。

如前所述，哈佛脑组织资源中心提供了几种基于Affymetrix基因芯片微阵列数据的RNA完整性指标。尽管根据阵列上检测到的探针集总数的百分比（出现调用的百分比）判断，所有样本似乎都具有相当好的mRNA质量，但每组中的一些样本具有相对较低的RNA 28S/18S比率和相对较高的3′/5′RNA比率（表3）。

排除这些样本后，仍发现DNMT1 mRNA阳性神经元的密度具有统计学意义，即在SZP的i、II和IV层中，它们分别增加了43%、27%和19%(P（P）<0.001），II(P（P）<0.001）和IV(P（P）=0.01）]和分别为34%、24%和22%的BP+患者[第I层(P（P）=0.003），II(P（P）=0.003）和IV(P（P）= 0.01)].

尽管由于死后大脑中PMI和pH值的改变，RNA可能表现出不同程度的降解，但据报道，只有转录长度减少，而转录数量没有减少(24). 这一发现表明，即使5′末端区域已经被降解，指向3′区域的反义探针也可以与转录物杂交。因此，使用针对转录物3′端区域的反义探针，RNA质量或pH值与DNMT1 mRNA表达水平之间缺乏显著相关性并不奇怪。

在我们的队列中，有几个患者有酗酒或使用其他滥用药物的历史。滥用和依赖药物与第I、II和IV层的DNMT1 mRNA增加之间没有统计学意义上的交互作用[第I层(F类= 1.835;P（P）= 0.059); 第二层(F类= 1.349;P（P）= 0.214); 第四层(F类= 1.302;P（P）= 0.241)]. 对大脑、血液和尿液进行酒精和其他滥用物质的筛查。在任何研究组中，DNMT1 mRNA含量与毒理学报告中发现的物质之间没有统计学意义上的相互作用(F类= 0.160;P（P）= 0.853).

APS和VPA药物。大多数表现出严重精神病症状的SZ或BP患者都接受过APS药物治疗（表​（表11和3）。在包括SZ患者和BP+患者在内的联合组中，典型或非典型APS的摄入量与DNMT1 mRNA表达水平之间没有显著或一致的相关性，DNMT1mRNA表达与接受APS治疗的SZ或BP患者的平均水平几乎相同。由于我们队列中的一些SZP或BP+患者除了接受APS外还接受了情绪稳定剂VPA，因此我们评估了该药物对SZ和BP+患者联合组中DNMT1阳性神经元增加的可能影响。如所示图4在仅用APS或VPA处理的SZ和BP+联合组的第II层中，DNMT1 mRNA阳性神经元的密度显著增加(F类_3,54= 7.614,P（P）<0.001），而在严格的Bonferroni标准下，接受APS和VPA治疗的SZ和BP+组中DNMT1 mRNA阳性神经元相对较小的增加没有达到统计学意义[NPS vs.VPA(P（P）= 0.015); NPS与APS(P（P）< 0.001); NPS与（APS+VPA）(P（P）= 0.067)].

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图4。

NPS BA9第二层DNMT1 mRNA-阳性中间神经元(n个=26），SZP(n个=15），和BP患者(n个= 12). 抗精神病药物治疗的APS患者；VPA，丙戊酸钠治疗的患者。*，P（P）<0.001通过ANOVA测量，然后进行Bonferroni多重比较。

讨论

人们普遍认为，GABA能神经元的功能障碍伴随着包括瑞林和GAD在内的几种GABA能神经蛋白表达的下调₆₇代表SZ和BP病理生理学的主要特征(2,5,10,14,15,25). 因此，SZ发病率包括GABA能的功能改变，在确定药物干预的新方向时应予以考虑。

当我们寻找一种共同的机制来解释这些和其他特定基因的同时表达下调时[即小白蛋白和GABA转运体（GAT1）](26–28)在SZP皮层GABA能神经元中，我们观察到SZP的BA10 GABA能神经细胞表达DNMT1 mRNA和蛋白的上调，这可能导致这些中间神经元中表达的基因启动子的甲基化。这些发现与假设一致，即应研究SZP端脑GABA能中间神经元中DNMT1表达的增加作为reelin和GAD启动子高甲基化的可能原因₆₇这些中间神经元中表达的基因和可能的其他启动子基因。

DNMT1表达与精神病理学。在这项研究中，我们将先前关于DNMT1mRNA增加的研究结果从SZ患者的BA10样本的小队列扩展到SZ患者的BA9样本的大队列，以及类似的BP+患者队列。我们发现，在SZ或BP+患者的BA9中，DNMT1 mRNA的表达同样上调。相反，在一小部分BP患者中，DNMT1 mRNA阳性神经元的表达与NPS几乎相同(图1). DNMT1 mRNA的增加与核DNMT1蛋白表达的类似增加平行(图2). 因此，我们的数据与假设一致，即DNMT1表达的增加很可能与精神病症状的表达有关。

SZ和BP+患者中DNMT1 mRNA-阳性神经元的数量增加似乎普遍存在于所有层，但其数量更高，并且仅在层I、II和IV中达到显著水平。有趣的是，在层I中，神经元几乎完全是GABA能神经元（水平和双足细胞），SZ和BP+患者中DNMT1 mRNA阳性神经元的增加比例大于第二层和第四层。然而，如前所述，在第二层(图2)和IV（未显示），增加似乎仅限于小卵圆形，可能是GABA能神经元，而不是锥体神经元中DNMT1 mRNA或蛋白的增加表达。

DNMT1过度表达与GAD₆₇SZ和BP+患者不同皮层的下调。我们已经报道了SZ的BA10中卷轴mRNA阳性神经元的数量密度在第I、II和IV层中降低，并且这种降低与DNMT1表达增加有关(4). 在这里，我们发现，在第I层和第II层中，DNMT1的增加与GAD的统计学显著降低有关₆₇SZ和BP+患者中mRNA阳性神经元的程度相似。DNMT1与GAD比值的统计分析₆₇在第一层和第二层中，SZ和BP+患者的这一比率持续显著增加。因此，SZ和BP+患者GABA能神经元功能障碍的选择性进一步揭示了SZ和BP患者前额叶皮层GABA能神经传递改变背后的病理生理机制的相似性。此外，我们的数据表明GAD的减少₆₇mRNA和DNMT1 mRNA或蛋白表达的增加可能并不普遍，但可能发生在皮层GABA能神经元的选择性亚群中。由于GABA能中间神经元在解剖学和功能上是异质的，对DNMT1表达增加的GABA能中间神经元的鉴定可能会进一步阐明神经元回路紊乱的位置和功能后果，以及它们在SZ和BP症状学中的症状影响。该分析可能进一步支持以下假设，即建议使用GABA能药物干预SZ发病率。

GAD数值密度的数据₆₇-在SZ和BP患者中，阳性神经元与其他人使用就地杂交技术或定量RT-PCR(5,10,14,15,27). 因为用NeuN免疫染色评估的神经元密度明显没有降低（参见参考文献中以前的研究）。4和10)，建议GAD数量减少₆₇-中间神经元的表达不能归因于神经元的丢失，但更可能与GAD程度的改变有关₆₇表达下调。

值得注意的是，GAD的大小₆₇该队列中mRNA表达缺陷由就地SZP和BP+患者BA9第一层和第二层（20–25%）的杂交组织化学技术低于从斯坦利基金会获得的BA9组织提取物的定量RT-PCR测量结果，显示减少约40%(10).

这种差异是意料之中的，因为RNA表达的组织化学评估缺乏内部标准校正，并且识别能力相对较低。因此，组织化学就地杂交法虽然适用于细胞定位和选择性的研究，但可能不是准确测量DNMT1或GAD范围的最合适方法₆₇mRNA改变。

DNA甲基化控制卷轴和GAD₆₇表达式。因为皮质DNMT1主要在GABA能神经元中表达(13)我们倾向于认为DNMT1表达上调是表观遗传诱导的Relein和GAD的原因₆₇启动子超甲基化及其在SZP和BP+患者中表达的下调。

人们还应该考虑是否可以用阿霉素（adriamycin）治疗DNMT1增加，阿霉素是DNMT1活性的一种非常有效的抑制剂(29). 需要通过动物实验来支持或否定这一考虑。一个相关的问题是，表观遗传机制是与精神病理学的发病有关，还是与症状的程度和类型有关。尽管这是一个无法在死后大脑中研究的推断，但在对杂合子卷轴小鼠的初步研究中，其皮层卷轴mRNA和蛋白质含量减少了50%，我们观察到DNMT1 mRNA与野生型小鼠相比没有改变。然而，在这种情况下，卷轴缺陷主要是由于单倍体不足，而在SZ，这种缺陷是表观遗传的，可能仅次于DNMT1过度表达。这一结果表明，但并不证明DNMT1上调不是卷绕或GAD的结果₆₇下调监管。需要在动物中进行进一步的实验（例如使用阿霉素），以确定DNMT1的增加是否会导致GAD的降低₆₇表达，或GAD是否减少₆₇SZP皮层GABA能神经元DNMT1 mRNA上调的基础是其表达。

Reelin和GAD₆₇并不是SZ和BP+患者GABA能神经元中表达下调的唯一基因。例如，GABA转运体（GAT1）的表达(30)，帕瓦尔布明(25)或N个-甲基-d日-天冬氨酸受体亚单位(15)在SZ和BP+患者的GABA能神经元中也下调。SZ或BP+患者GABA能神经元中DNMT1的增加是否直接或间接负责这些基因或其他尚未确定的参与调节reelin和GAD的基因的转录下调，还有待研究₆₇表达_.

APS药物是否影响SZ和BP+患者DNMT1的变化？由于SZ和BP+患者有类似的精神病症状，他们经常接受APS药物治疗。因此，重要的是测试APS药物是否是DNMT1表达变化的一个因素。在包括SZ患者和BP+患者在内的联合组中，DNMT1水平与APS药物的使用没有相关性。此外，我们已经报道，对小鼠进行长期氟哌啶醇和氯氮平治疗无法改变大脑皮层和小脑中DNMT1 mRNA的含量(4). 总的来说，这些数据与以下观点一致：DNMT1表达增加不是抗精神病药物治疗的结果，抗精神病药治疗不能阻止DNMT1的表达上调。然而，如中所述图4VPA和APS的结合可能导致DNMT1过度表达的减少。

由于SZP通常是重度吸烟者，我们考虑了DNMT1表达的增加是否是暴露于高水平尼古丁的结果。为了验证这一假设，在一项初步研究中，用1.5 mg/kg酒石酸烟碱对小鼠（B6C3Fe株）进行为期8天的治疗，每天两次。尽管这种剂量的尼古丁会引起持续2小时以上的严重泪流、瞳孔缩小和全身震颤，但在这些小鼠的额叶皮层中未检测到DNMT1 mRNA阳性神经元的增加（M.V.，未发表数据）。这些数据表明尼古丁就其本身而言不是DNMT1过度表达的原因。然而，我们不能排除香烟烟雾中除尼古丁以外的活性化合物可能导致精神病患者DNMT1增加。

VPA药物是否影响SZ和BP+患者DNMT1的变化？最近，VPA和APS在治疗SZ和BP患者中的使用有所增加(17,18). 由于我们队列中接受APS治疗的一些SZ和BP+患者也接受了VPA（0.750至1.5 g/天），因此我们研究了VPA在DNMT1表达方面是否与APS治疗有任何交互作用。我们发现，接受APS和VPA治疗的SZ和BP+患者的DNMT1 mRNA表达水平较单独接受APS或VPA治疗者低(图4). 因此，VPA与APS联合可能减少DNMT1 mRNA表达增加的假设仍然有可能在大量接受这些药物治疗的患者中进行研究。

这些结果表明，关注其他更有效的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可能会提供所需的证据，证明我们认为HDAC的抑制是否是由于DNA-去甲基酶的诱导，而据报道，这种诱导是在VPA治疗后发生的(31). 这将是一个很好的线索来解释VPA和APS联合诱导DNMT1表达增加的减少。

总之，这些研究间接证明了GABA能神经元中DNMT1的增加在GAD的下调中起作用₆₇和卷轴式表达。尤其重要的是，VPA有助于下调DNMT1增加，这可能被认为是该药物有益作用的一种可能机制，并可能与VPA诱导的基因表达增加有关。事实上，因为这项工作表明，VPA治疗可以减少DNMT1过度表达的下调，也许VPA诱导的去甲基化是降低GABA能神经元中DNMT1表达增加的重要机制。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：M.V.、A.G.和E.C.设计的研究；M.V.和E.M.进行了研究；M.V.、A.G.、E.M.、J.M.D.和E.C.分析数据；M.V.、A.G.和E.C.撰写了这篇论文。

缩写：GAD₆₇谷氨酸脱羧酶67；DNMT1，DNA-甲基转移酶1；BA，布罗德曼地区；SZ，精神分裂症；SZP、SZ患者；双相情感障碍；BP+，BP伴精神病；血压-，血压无精神病；NPS，非精神科受试者；APS，抗精神病药物；丙戊酸钠；LI样免疫反应；PMI，死亡时间间隔；神经，神经元特异性核蛋白。

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