国际实验病理学杂志。2017年4月;98(2): 109–116.
神经肌肉接头(NMJ公司s) 烟碱乙酰胆碱受体的超微结构分析(美国国家卫生研究院)亚单位信使核糖核酸妊娠期间蛋白质限制子代的表达
,1 ,2 ,三 ,2 ,4和2 保拉·艾略·汤梅·德·苏萨·卡斯特罗(Paula Aiello Toméde Souza Castro)
1巴西圣保罗圣卡洛斯UFSCAR CBSH生物科学与健康中心物理治疗部
Ludimila Canuto Faccioni公司
2巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所形态学系
帕特里西亚·阿琳·波尔
三巴西圣保罗坎皮纳斯州立大学内科
罗布森·弗朗西斯科·卡瓦略
2巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所形态学系
塞尔玛·玛丽亚·米歇林·马修斯
4巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所解剖系
Maeli Dal‐Pai‐Silva公司
2巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所形态学系
1巴西圣保罗圣卡洛斯UFSCAR CBSH生物科学与健康中心物理治疗部
2巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所形态学系
三巴西圣保罗坎皮纳斯州立大学内科
4巴西圣保罗博图卡图UNESP生物科学研究所解剖系
通讯作者。 *通信:Maeli Dal‐Pai‐Silva公司形态学系波图卡图生物科学研究所18618‐970博图卡图圣保罗巴西电话:+55(14)3880 0470电子邮件:rb.psenu.bbi@ileam公司, 2016年3月21日收到;2017年2月17日接受。
版权©2017作者。国际实验病理杂志©2017国际实验病理学杂志 总结
妊娠期蛋白质限制可改变后代的骨骼肌表型;然而,关于这是否也影响神经肌肉接头,我们知之甚少(NMJ公司),因为肌肉表型的维持取决于NMJ公司功能完整性。本研究旨在评估母鼠在妊娠期间摄入低蛋白(6%)对雄性后代的影响NMJ公司形态与烟碱型乙酰胆碱受体(美国国家卫生研究院)比目鱼肌中α1、γ和ε亚基的表达(溶胶)和趾长伸肌(老挝国家电力公司)肌肉。研究了四组雄性Wistar子代大鼠。母鼠的后代喂食低蛋白(6%蛋白质,有限合伙人)和正常蛋白质(17%蛋白质,NP公司)在30日龄和120日龄时对饮食进行评估SOL公司和老挝国家电力公司采集肌肉进行分析。使用透射电子显微镜进行的形态学研究表明,只有SOL NMJ公司在有限合伙人组与NP公司组。SOL NMJ公司s表现出较少的突触折叠,突触后膜光滑,末端轴突也常可见髓鞘样结构。关于信使核糖核酸s编码美国国家卫生研究院亚基,仅30天龄有限合伙人后代老挝国家电力公司与对照组相比,肌肉中α、γ和ε亚基表达降低NP公司组。总之,我们的研究结果表明,在整个怀孕期间摄入低蛋白饮食(6%)会损害信使核糖核酸s编码美国国家卫生研究院α、 γ和ε亚基EDL NMJ公司并促进SOL NMJ公司30天大的子代,表明长期母亲蛋白限制后不同肌肉类型之间的特定差异。
关键词:神经肌肉接头、妊娠、蛋白质限制、骨骼肌
动物研究越来越强调妊娠期营养调控对骨骼肌发育的重要性(Fahey等.2005; 马林森等.2007; 托斯卡诺等.2008; 潘塔莱昂等.2013). 该组织根据功能需求呈现代谢和结构多样性(Campos等.2002)并且对一些特定刺激有很强的调节能力,例如运动(Magaudda等.2004; 胡贝尔等.2009),固定(Jackson等.2010)、饮食(Huber等.2009)、心力衰竭(Souza等.2011,2015)和营养不良(马林森等.2007; 托斯卡诺等.2008; 卡贝索等.2012).
怀孕期间,蛋白质限制等刺激会影响几个形态生理参数,这些参数会对成年后代产生影响(兰利·埃文斯2004). 这种现象所涉及的机制被称为“胎儿程序设计”,在这个过程中,关键发育期的环境侵略将对器官结构和功能产生永久性影响(卢卡斯1991; 吉凯尔等.2008). 怀孕期间的蛋白质限制可以改变后代的骨骼肌(Fahey等.2005; 朱等., 2006; 马林森等.2007; 托斯卡诺等.2008; 卡贝索等.2012); 然而,我们不知道这种情况是否影响神经肌肉接头(NMJ)。NMJ完整性的变化可能与肌肉表型的维持有关。
NMJ是一种特殊的突触,旨在通过化学递质乙酰胆碱(ACh)将电脉冲从神经末端传递到骨骼肌,以促进肌肉收缩(休斯等.2006). 在胚胎肌发生期间(小鼠约12至14天),烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)在肌肉纤维中央区域的位置被制备,并参与运动神经元的生长,形成突触接触(Witzemann2006). 突触传递在生长锥与肌管接触的几分钟内开始,最初由沿整个肌管表面表达的nAChRs介导(Mishina等.1986). 在胚胎发生过程中,nAChRs包含一个由β、δ、γ和两个α1亚单位组成的五聚体复合物。在出生后和成年阶段,ε亚基取代γ亚基,nAChRs呈簇状分布(Charbonnier等.2003). 结合褶皱形成后,在每个结合褶皱的肩部发现了成年nAChR(Martyn等.2009)电压门控钠(Na+)通道高度集中在突触后褶皱深度和交界区(Flucher&Daniels1989).
NMJ可以根据许多条件进行调整,例如年龄(Barker&Ip1966; 安东尼亚和法希姆1988; 法希姆1997; 科伊拉拉等.2003; 普尔兹比拉等.2006)、压迫、挤压和创伤性周围神经切断术(加图索等.1988),活动度(Deschenes等.1993; 法希姆1997)和先天性肌无力综合征(克罗森等.2001)这些变化可以通过NMJ大小的变化观察到(Andonian和Fahim1988; 韦海于格等.1992; 德舍纳等.1993; 法希姆1997)、突触小泡、nAChR弥散(Deschenes等.2000; 克罗克森等.2001)以及编码nAChR亚单位的mRNA表达的变化(Witzemann等.1996; 克罗克森等.2001). 这些NMJ变化可以改变肌肉功能能力,进而影响骨骼肌表型。
最近的研究表明,胎儿规划与长期疾病之间存在联系,例如心血管高血压、肥胖和神经退行性疾病(Barlow等.2003; 福登等.2006). 其中一些疾病,例如胰岛素抵抗(II型糖尿病)和阿尔茨海默病(巴洛等.2003; Ozanne公司等.2003; 潘塔莱昂等.2013)与骨骼肌的功能能力有关。尽管一些研究表明胎儿编程对大鼠骨骼肌的影响(Mallinson等.2007; 托斯卡诺等.2008; 胡贝尔等.2009),NMJ在这种情况下的变化没有特征。
因此,本研究旨在评估妊娠期喂食低蛋白饮食(6%蛋白质)的30和120日龄雄性后代比目鱼肌(SOL)和趾长伸肌(EDL)中NMJ形态和nAChRα1、γ和εmRNA的表达。
材料和方法
道德批准声明
本研究中使用的实验方案符合巴西动物实验学院(COBEA)制定的实验动物护理原则以及国家研究委员会(Clark)出版的《实验动物护理和使用指南》等.1997). 所有程序均由巴西波图卡图UNESP生物科学研究所伦理委员会批准(协议081/07‐CEEA)。
大坝老鼠
这些动物每天可以随意获得食物和水,并保持在23±1°C的温度下,进行12小时的光-暗循环。雌性Wistar大鼠(250和300g体重)与雄性在标准化条件下单独饲养。交配后,使用阴道涂片检测精子来评估怀孕情况。将16只怀孕大鼠分离并随机分为两个实验组;对照组在妊娠第一天至最后一天喂以正常蛋白质饮食(17%蛋白质),另一组喂以等热量低蛋白饮食(6%蛋白质)。这些饮食是在巴西坎皮纳斯大学的生理学实验室生产的,并进行了开发(Reeves等.1993)根据美国营养学会AIN‐93建议。LP和NP日粮为等热量日粮,其组成如表所示在后代出生后(第21天)直到断奶,母鼠随意根据美国国家研究委员会和美国国家卫生研究院的建议,获得普瑞纳标准大鼠杂粮(巴西拉比纳),其中含有(w/w)57.5%的淀粉、23%的蛋白质、2.5%的脂肪、9%的纤维素和8%的维生素和盐。
表1
成分(g/Kg) | 正常蛋白质饮食(17%蛋白质) | 低蛋白饮食(6%蛋白质) |
---|
玉米淀粉 | 397 | 480 |
糊精 | 130, 5 | 159 |
糖类 | 100 | 121 |
L-半胱氨酸 | 三 | 1 |
光纤 | 50 | 50 |
大豆油 | 70 | 70 |
矿物混合物AIN93G*
| 35 | 35 |
维生素混合物AIN93G†
| 10 | 10 |
酒石酸胆碱 | 2,5 | 2,5 |
后代
出生时,将幼崽的大小标准化为八只随机选择的幼崽,每窝幼崽包含四只雄性和四只雌性。虽然我们在实验中只使用雄性,以确保结果更加一致,但雌性幼鼠一直保持到断奶,以保持后代的同等食物可用性。断奶后,雄性大鼠喂食标准的大鼠杂粮(普瑞纳,拉比纳,巴西),含(w/w)57.5%淀粉,23%蛋白质,2.5%脂肪,9%纤维素和8%维生素和盐随意30天和120天(表).
分析的组
研究了四组婴儿:30天大的NP和LP以及120天大的NP和LP。NP组(n个=8)包括怀孕期间喂养正常蛋白质饮食(17%蛋白质)的母鼠所生的后代。LP集团(n个=8)包括怀孕期间喂养低蛋白饮食(6%蛋白质)的母鼠所生的后代。在30天和120天大时,对后代实施安乐死(图).
大鼠通过腹腔注射50 mg/ml氯胺酮(氯胺酮)的2:1溶液进行麻醉®)和20 mg/ml盐酸二甲苯嗪(二甲苯嗪®)(0.1 ml/100 g)并安乐死。采集趾长伸肌(EDL)和比目鱼肌(SOL),并妥善保存,以备日后分析。
神经肌肉接头(NMJ)的超微结构分析:SOL(n个=3)和EDL(n个=3)肌肉被解剖、移除、小心拉伸并夹在塑料框架上,以避免在加工过程中收缩,然后用Karnovsky固定剂固定(2.0%戊二醛和4.0%多聚甲醛1:1,在0.1M磷酸钠缓冲液中,pH 7.4)。肌神经连接如Cardasis&La Fontaine 1987所述。使用常规方法对含有NMJ的SOL和EDL肌肉区域进行处理,以通过透射电子显微镜进行定性分析。
实时聚合酶链反应分析nAChRs亚基的基因表达
RNA提取
使用TRIzol试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司)从肌肉样品中提取总RNA,该试剂基于硫氰酸胍法。将冷冻的肌肉在1 ml TRIzol试剂中机械均质。将分离出的总RNA重新悬浮在无RNase的水中,用DNase I(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司)处理以去除DNA,并使用NanoDrop分光光度计(美国加州圣克拉拉市安捷伦科技公司)定量以测量260 nm处的光密度(OD)。当OD260/280比率约为2.0,通过1%琼脂糖凝胶电泳和观察与18S和28S核糖体RNA相对应的清晰条带来验证RNA完整性。
反向转录
对于每个样品,使用高容量cDNA档案试剂盒(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司)从2μg总RNA合成cDNA。每个反应包含10μl的10×逆转录缓冲液、4μl的25×dNTP、10μl 10×随机引物、100单位的RNase抑制剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司)和250单位的逆转录酶MultiScribe™。用无核酸酶水将反应调节至200μl最终体积。cDNA合成反应条件为引物在25℃退火10 min,然后在37℃逆转录2 h。对照反应中省略了逆转录酶,所有cDNA样本都进行了PCR扩增,以确保没有DNA污染。将得到的cDNA样品校准并储存在−20°C下,使用2μl样品(相当于20 ng总RNA)进行实时PCR。
实时qPCR
cDNA样本被用作实时PCR的模板,使用7300实时PCR系统(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司),具有通用热循环条件:95°C 10分钟,然后是40个95°C循环15秒和60°C循环1分钟。使用0.4μM每种引物和2×Power SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)在25μl最终体积中进行两次反应。使用国家生物技术信息中心数据库中的登录号选择基因序列(表). 引物序列是使用引物表达v3.0软件(Life Technologies)。对于每个基因,对PCR产物进行五次稀释(10倍稀释),将PCR产物从含有等量cDNA的初始混合物中稀释500倍,以便于为qPCR最初选择的每个引物集生成五点标准曲线。使用7300系统为每个基因生成的标准曲线斜率计算qPCR线性和效率特别提款权软件(生命科技)。对标准曲线的分析显示出高线性(第页
2 = 0.99). PCR效率(Ex)根据公式Ex=10−1计算−1/斜率−1,其中−3.32的斜率表示100%的反应效率。所有基因的斜率约为-3.32,效率估计值在98.0%至100.5%之间。使用Livak和Schmittgen描述的ΔΔCq方法比较单个样本之间的基因表达(2001)和5个参考基因用于数据归一化:甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、TATA盒结合蛋白(TBP)、酸性核糖体磷酸蛋白(ARBP)和β肌动蛋白(ACTB)(Vandesompele等.2002).
统计分析
使用Student’s分析NP组和LP组之间α、γ和ε亚基mRNA表达的差异t吨独立样本测试(Zar2009)、和P(P)≤0.05表示存在统计学显著差异。结果表示为平均值±标准偏差。
结果
EDL和SOL NMJ的超微结构分析
对30天和120天龄NP组的SOL和EDL NMJ的超微结构分析显示,浅表突触沟的末端轴突扩张。末梢轴突呈现规则且数量众多的突触小泡。图3c描绘了一个多泡体,它是正常神经递质重吸收的结果。线粒体也散布在突触小泡中(图a、 c和a、 d)。在突触前膜上,可以在内表面观察到一些密集的斑点(活动区)。突触后膜出现许多连接褶皱,顶部有密集点;这些结构对应于nAChR聚集区(图d和c) 。
比目鱼鱼的电子显微照片(SOL公司)电机端板。面板a和e描述了30天龄和16周龄NP公司后代;面板b、c和d表示30天有限合伙人后代;面板F代表16周龄有限合伙人子代:A,肌纤维相关轴突终末;F、 接合褶皱;糖原颗粒;M、 线粒体;MVB,多泡体;N、 肌核;S、 肌节;SV公司,突触小泡;星号表示连接褶皱减少,箭头表示髓磷脂形态。粗箭头表示内质网扩张。a和b中的比例尺为0.43μm,c–f中为0.23μm。
趾长伸肌的电子显微照片(老挝国家电力公司)电机端板。面板a和b描述了30天龄和16周龄NP公司后代;面板c和d描述了30天龄和16周龄有限合伙人后代。A、 肌纤维相关轴突终末;DP,密集点;F、 接合褶皱;M、 线粒体;MVB,多泡体;N、 肌核;S、 肌节;SV,突触小泡。a、b、c和d中的比例尺分别为0.58、0.23、0.43和0.23μm。
关于LP组中的SOL NMJ(图),在30天大的后代中变化更为明显(图b–d)比120天大的后代(图f) ●●●●。突触后区的变化明显,连接褶皱减少,而突触后膜则呈现光滑状态(图b–d)。在末梢轴突中,髓鞘像(图b、 c)内质网经常扩张(图b、 d)。
两个年龄段的NP组的EDL NMJ形态相似(图).
α、γ和εnAChR亚基的基因表达
与NP后代相比,30天大的LP后代EDL肌肉中nAChRα、γ和ε亚单位mRNA的表达降低(P(P) < 0.05). 在120天大的LP后代中,与NP组相比,只有γ亚单位mRNA减少(P(P) < 0.05); 相反,在这个年龄段,nAChRα、γ和ε亚单位mRNA的SOL肌肉表达没有变化(表).
表3
| 有30天大的后代的组 | 有16周大孩子的组 |
---|
NP集团(n个= 8) | LP集团(n个= 8) | NP集团(n个= 8) | LP集团(n个= 8) |
---|
SOL肌肉 |
α亚单位 | 0.304 ± 0.117 | 0.338 ± 0.287 | 1.158 ± 0.554 | 1.072 ± 0.241 |
γ亚基 | 0.309 ± 0.215 | 0.276 ± 0.204 | 0.438 ± 0.209 | 0.587 ± 0.227 |
ε亚单位 | 0.355 ± 0.177 | 0.384 ± 0.295 | 0.652 ± 0.345 | 0.781 ± 0.229 |
EDL肌肉 |
α亚单位 | 0.779 ± 0.116 | 0.675 ± 0.091*
| 0.622 ± 0.225 | 0.765 ± 0.225 |
γ亚基 | 0.750 ± 0.176 | 0.604 ± 0.086*
| 1.920 ± 1.245 | 0.965 ± 0.358*
|
ε亚单位 | 1.040 ± 0.080 | 0.861 ± 0.128**
| 2.997 ± 0.799 | 2.449 ± 0.985 |
讨论
以前的报告已经证明妊娠蛋白限制对大鼠后代肌肉形态的影响(Fahey等.2005; 朱等2006年,马林森等.2007; 托斯卡诺等.2008; 卡贝索等.2012; 潘塔莱昂等.2013); 然而,这是首次研究表明,整个妊娠期的蛋白质限制可以影响后代NMJ的形态和分子方面。形态学上,我们观察到30日龄LP后代的突触折叠减少,突触后膜光滑。突触后膜层包含电压门控钠通道和nAChR富集区(Flucher&Daniels1989). 电压门控钠通道主要分布在突触后波谷,在nAChR集中的折叠峰中不存在。这种配置促进肌肉动作电位的启动(Flucher&Daniels1989; 木材和板条1997; 考德威尔2000; 休斯等.2006),而NMJ的变化会影响肌肉收缩。
突触后波谷中电压门控钠通道的减少可以缩短对肌肉和不接受刺激的肌肉的刺激(Wadman等.2012)或具有非兴奋性膜的可能出现纤维萎缩(比尔布拉尔等.2012). 值得注意的是,我们之前证明,由于妊娠蛋白限制(Cabeço等.2012). 从这些结果中,我们可以推断30天大的后代(Cabeço)SOL肌肉萎缩等.2012)部分可能与本研究中观察到的30日龄LP后代的NMJ形态变化有关。
此外,我们在30天大的LP后代(Fathi)的SOL NMJ中观察到圆柱形多层脂质管,如髓磷脂图形等.2013)、和Huang等. (2013)在低蛋白饮食模型中观察到2型糖尿病肾病大鼠比目鱼肌的类似结构。所谓的髓磷脂是由磷脂组成的卷绕膜结构,可以替代一簇死亡细胞。这些同心膜片层的形成与多种条件有关,例如给药、激素暴露、缺氧缺血条件、多种病理过程、衰老过程、肿瘤细胞和凋亡细胞死亡的有效诱导剂;患有先天性、变性、代谢性和感染性疾病;次级溶酶体包围着退化的细胞器(Fukuhara等.1985; Yagihashi和Sima1986; 卡斯泰翁2008). 我们认为,在我们的研究中,30天大的LP后代SOL NMJ中的髓磷脂数字可能与母鼠在整个妊娠期的不平衡营养状况有关。髓磷脂图形形成的机制尚不明确(卡斯特扬2008).
LP后代SOL NMJ中nAChRα、γ和ε亚单位mRNA的表达不随年龄变化。我们认为,具有光滑表面和减少突触折叠的突触后膜所证明的NMJ改变并没有改变突触后膜密集点中聚集的乙酰胆碱受体的区域。
在我们的研究中,120日龄LP子代SOL肌肉NMJ的正常形态可以用为动物提供的出生后正常营养条件的能力来解释,以逆转先前出现的异常NMJ超微结构特征;然而,在这个阶段,正常的营养状况并没有改善SOL肌肉萎缩(Cabeço等.2012).
SOL是一种主要由I型肌纤维组成的慢氧化肌肉,在姿势维持期间被吸收。此前,我们证明,妊娠蛋白限制(Cabeço等.2012). 然后,我们认为,在本研究中观察到的30日龄LP后代SOL NMJ超微结构的变化可能与Cabeço描述的30日日龄后代SOL肌肉萎缩有关等. (2012),尽管我们没有量化NMJ超微结构的变化。基于这些结果,有可能是由于母鼠在整个妊娠期的营养不良状况促进了NMJ超微结构的早期变化,而没有改变nAChR基因的表达。
相反,30日龄和120日龄LP后代的EDL NMJ没有出现超微结构变化。令人惊讶的是,与NP组相比,30天龄LP组的EDL肌肉确实显示出nAChRα、γ和ε亚基转录水平降低。
众所周知,肌肉纤维的调节伴随着nAChR的变化。出生后nAChR表达,通道开放时间延长,但Ca减少2+在SOL和EDL肌肉中,渗透性和离子电导刺激从快纤维类型向慢纤维类型的转变。nAChR诱导的“肌原性”和“突触性”基因表达的变化表明,nAChR-介导的突触后信号传导与调节纤维类型组成的信号通路有关(Jin等.2008).
EDL是一种快速糖酵解肌,主要由IIa型和IIb型纤维组成,在非持续快速活动中被吸收(约翰斯顿1985)在站立和跑步机行走时相对不活动。在我们早期的研究中,我们观察到与NP组(Cabeço等.2012). 鉴于这些数据,我们可以推断,在30天龄EDL肌肉中观察到的nAChRα、γ和ε亚基mRNA表达的变化可能与NMJ的肌纤维类型和调节有关。30日龄和120日龄LP后代EDL肌肉中的α、γ和ε亚基mRNA表达没有变化;与NP组相比,LP组只降低了γ亚基转录水平。γ亚基在胚胎期表达最丰富,在12天大鼠中被ε亚基取代(亚当斯等.1995; 沙博尼耶等.2003).
在我们的实验中观察到的SOL和EDL肌肉之间的差异是骨骼肌以特定纤维类型的方式进行代谢编程的结果(Janovská等.2010). 阿拉戈等. (2014)证明了这种联系,因为出生于蛋白质限制型母鼠的大鼠表现出II型纤维密度增加,比目鱼肌但EDL肌肉中的脂肪酸氧化和糖酵解速率降低。这些差异可以解释我们的观察结果,即SOL在营养不良后表现出形态改变,而EDL在肌肉纤维频率和一些nAChRs方面表现出改变。
总之,我们的结果表明,在整个怀孕期间摄入低蛋白饮食(6%)会损害EDL NMJ中nAChRα、γ和ε亚基mRNA的表达,并促进30天大的后代SOL NMJ的形态变化,进一步表明长期母亲蛋白限制后的肌型特异性差异。
致谢
本研究得到了FAPESP的支持,程序号2007/59970-8。
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