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自然遗传学。作者手稿；2017年8月23日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
自然遗传学。2017年1月；49(1): 125–130.
2016年12月5日在线发布。 数字对象标识：10.1038/ng.3738
预防性维修识别码：项目编号：C5451114
NIHMSID公司：尼姆斯859697
PMID：27918534

异位脂肪沉积的多种族全基因组荟萃分析确定与脂肪细胞发育和分化相关的基因座

奥黛丽·朱棣文,1,2,48 宣登,三，48 弗吉尼亚A Fisher,三，48 亚历山大·德隆,4 杨章,5,6 玛丽·费托萨,7 刘庆泰,三 奥利维亚周,6 奥黛丽·C·乔,8 清端,9 托马斯·戴尔,10 约翰·德·艾彻,1 郭秀清,11 南希·L·赫德-科斯塔,三 蒂姆·卡普洛夫斯基,12,13 小杰克·W·肯特,14 莱斯利·兰格,9 刘兴刚,15 库尔特·洛曼,16,17 灵异路,17 阿努巴·马哈扬,4 杰弗里·奥康奈尔,15 安基塔·帕里哈尔,15 胡安·佩拉尔塔,10 阿尔伯特·V·史密斯,18,19 张毅（音）,20 乔治·霍穆特,12 艾哈迈德·基斯巴,20,49 乔尔·库尔伯格,21 雷内·拉奎,22 Lenore J Launer公司,23 马蒂亚斯·诺克,24中，13 迈克尔·奥利维尔,14,20 帕特里夏·A·佩瑟,25 詹姆斯·G·特里,26 玛丽·沃钦斯基,7 杰瑶,11 劳伦斯·F·比拉克,25 约翰·布兰格罗,10 英格丽德·博雷基,7 唐纳德·波登,27,28 约翰·杰弗里·卡尔,26 斯特凡·谢尔温斯基,29 京中鼎,16,30 内尔·弗里德里希,24中，13 维尔蒙德·古德纳森,18,19 塔马拉B哈里斯,23 埃里克·英格尔森,31,32 安德鲁·约翰逊,1 沙龙LR卡迪亚,25 卡尔·德兰菲尔德,17 拉尔斯·林德,21 刘永美,16,33 布拉克斯顿·D·米切尔,15,34 安德鲁·莫里斯,35,4 托马斯·莫斯利,36 杰罗姆·罗特,11 阿兰·舒尔迪纳,15 布拉德福德镇,8 亨利·Völzke,37中，13中，38 亨利·瓦拉斯科夫斯基,24 詹姆斯·威尔逊,39 亚太区总裁马修,40 塞西莉亚·M·林格伦,41 沃尔夫拉姆·戈斯林,6,42,43,44,45 L阿德里安杯,1,三，50 马修·斯坦豪泽,5,6,45中，46,50和卡罗琳·S·福克斯1,47,50
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

引言段落

体脂分布的变化导致肥胖的代谢后遗症。人们对体脂分布的遗传决定因素知之甚少。这项研究的目的是通过对欧洲、非洲、西班牙裔和中国血统人群中多达9594名女性和8738名男性进行样本量加权固定效应全基因组关联荟萃分析，对身体脂肪分布的潜在遗传学获得新的见解，有或没有性别分层。共发现7个与异位脂肪性状相关的新基因座(ATXN1型,UBE2E2、EBF1、RREB1、GSDMB、GRAMD3和ENSA；P<5×10−8；FDR<1%）。对这些基因的功能分析表明，这两种基因的功能都丧失了ATXN1型和UBE2E2型在原代小鼠脂肪前体细胞中，脂肪细胞分化受损，提示其在生理上对ATXN1型和UBE2E2型脂肪生成。未来的研究需要进一步探索这些基因影响脂肪细胞生物学的机制，以及它们的扰动如何导致全身代谢性疾病。

关键词：GWAS、肥胖、异位脂肪、脂肪细胞发育、分化

主要文本

体脂分布的变化与心脏代谢风险相关，包括糖尿病、高血压和冠心病，1–5并且至少部分独立于总肥胖。脂肪组织可以使用计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）进行无创量化，以测量不同组织分区中的脂肪体积和脂肪衰减。我们之前证明，除了相对脂肪分布外，这两个指数也是心脏代谢风险的重要预测因子。6–11

几条证据表明，人体脂肪分布有独特的遗传成分。首先，即使在调整了体重指数（BMI）后，体脂分布指数仍可以遗传，其值在36-47%之间。12第二，体脂分布存在独特的遗传位点。例如，我们发现了一个与心包脂肪相关的SNP13与内脏脂肪无关，12BMI或腰臀比（WHR）。14,15第三，一些以异常体脂分布为特征的脂肪营养不良综合征是遗传介导的。16

目前的研究提出了一项全基因组关联研究，并对来自成像生物标记物的脂肪组织特征进行了荟萃分析(补充表1)来自欧洲、非洲、西班牙和中国血统的多达9594名女性和8738名男性的260万SNP（参见补充表2、3和4)并使用小鼠模型表征选定的基因座。

先前估计皮下和内脏脂肪组织（SAT，VAT）的遗传率分别为57%和36%12,17(补充表5). 为了评估脂肪衰减性状变异的遗传贡献，脂肪衰减性状是脂肪质量的间接标记（SAT Hounsfield单位[SATHU]和VATHU），遗传力（H2)在弗莱明翰心脏研究（FHS）中，对3312名女性和男性进行了评估，发现其在29-31%之间（P<1×10−15). 为了评估异位脂肪性状之间的共同遗传贡献，对3336名FHS女性和男性进行了遗传相关性评估。几乎所有异位脂肪性状对之间都存在中等至强的统计显著相关性（0.35至0.67和−0.74至−0.35，所有P<5×10−4；补充表6)，表明异位脂肪性状之间存在共享基因座。然而，并不是所有的基因都在性状之间共享（P＜5×10−11对于所有成对比较的非重叠相关性）。异位脂肪性状的遗传相关性也反映在表型相关性中(补充表7).

在这项多民族样本加权固定效应综合分析中18,19在多达18332名参与者中，共有11个本地关联（7个新关联和4个已知关联）达到全基因组显著性（P<5×10−8)在27次基因组扫描中（来自对3个层次的9个特征和模型的分析，总体而言，女性和男性）。在7个新基因座中，3个与皮下容积有关(GSDMB公司)和内脏脂肪特征(GRAMD3级和RREB1)，2例与心包脂肪相关(欧洲国家安全局和EBF1（EBF1）)，1与脂肪衰减有关(ATXN1型)1与相对脂肪分布（VAT/SAT比率[UBE2E2型]) (表1；补充图1a-g；插补质量补充表8). 在按祖先分类的敏感性分析中，关联性很强(补充图2a-g和3a-g；补充表9). 每个分析的曼哈顿图和QQ图显示关联测试统计的通货膨胀最小(补充图4a–g). 其余4个位点(LYPLAL1、LY86、FTO、TRIB2)获得全基因组意义之前已经确定。12,13

表1

与异位脂肪性状相关的SNP（p<5×10−8)1关联统计数据是使用METAL中实施的样本大小加权固定效应荟萃分析获得的。18,19

基因座2特质地层领导SNP氯代甲烷SNPID公司职位A1类三A2类4频率A15N个Z分数P值6
脂肪体积特征7,8
新款
 欧洲国家安全局PATadjHtWt（调整后重量）所有6587515卢比16587515卢比148875512一克0.0911027−5.942.8×10−9
 GRAMD3级增值税调整BMI女人10060123卢比510060123卢比125711809一c（c）0.2396235.474.5×10−8
 EBF1（EBF1）PATadjHtWt（调整后重量）所有1650505卢比51650505卢比157962312一克0.2411566−6.101.0×10−9
拍打所有52434264卢比157954781t吨克0.61116145.933.0×10−9
 RREB1型增值税调整BMI所有2842895卢比62842895卢比7051315c（c）克0.50172975.721.1×10−8
 GSDMB公司坐女人2123685卢比172123685卢比35307415t吨c（c）0.9471375.523.4×10−8
KNOWN（已知）
 TRIB2（有毒物质排放清单2）PATadjHtWt公司所有10198628卢比210198628卢比12881948一克0.4211572−8.886.7×10−19
PATadjHtWt（调整后重量）男子0.435466−6.682.4×10−11
PATadjHtWt（调整后重量）女人0.426106−6.021.8×10−9
拍打所有0.4211605−7.873.7×10−15
 自由贸易组织坐所有7185735卢比167185735卢比52380152一克0.5817812−6.051.4×10−9
脂肪衰减特性7,8
新款
 ATXN1型萨图男子2237199卢比62237199卢比16538000一克0.1157805.671.4×10−8
相对脂肪分布特征7,8
新款
 UBE2E2管增值税/增值税税率所有rs7374732号三rs7374732号23178458t吨c（c）0.6918205−6.293.1×10−10
VAT/SAT比率adjBMI所有0.6918190−5.641.7×10−8
KNOWN（已知）
 LYPLAL1型VAT/SAT比率所有6689335卢比16689335卢比217695305t吨c（c）0.5915214−5.592.3×10−8
VAT/SAT比率adjBMI所有16689335卢比217695305t吨c（c）0.5915199−5.533.2×10−8
 LY86型VAT/SAT比率所有912056卢比6912056卢比6681196一t吨0.3517387−5.962.5×10−9
VAT/SAT比率adjBMI所有0.3517372−5.982.3×10−9
1SNP根据异位脂肪特征进行分组，并根据新发现和先前确定的位点列出。任何达到全基因组显著性的关联（p＜5×10−8)已列出。
2基于该区域最近基因的传统位点名称
三A1是编码的等位基因
4A2是非编码等位基因
5FreqA1是等位基因1的等位基因频率
6P值经双基因组对照校正
7欧洲和非洲血统队列导致了所有异位脂肪特征；中国和西班牙血统队列仅对心包容积特征有贡献
8缩写：
  • SAT-皮下脂肪组织体积
  • VAT-内脏脂肪组织体积
  • PAT-心包脂肪组织体积
  • SATHU-皮下脂肪组织衰减
  • VATHU-内脏脂肪组织衰减
  • VAT/SAT比率-内脏与皮下脂肪组织体积比
  • adjBMI-针对BMI调整的模型
  • adjHtWt-根据高度和重量调整的模型

rs2123685，位于3个′的未翻译区域ZPBP2型和GSDMB、，仅女性与SAT相关（P妇女=3.4×10−8,补充表10a). 对女性相关异位性状的调查显示，与VAT存在方向一致的名义关联（P=4.8×10−4). SNP位于自由贸易组织标准BMI基因座与总样本中的SAT相关，达到全基因组显著性（P=1.4×10−9).

新确定的关联RREB1型带VATadjBMI（rs2842895，P=1.1×10−8)在总体样本和两性中观察到(补充表10b). 相关异位性状的检查表明，VAT和VAT/SAT比率adjBMI与正常相关（P=4.8×10−5P=8.9×10−6分别）。新发现的rs10060123近克3VAadjBMI是女性特有的（P=4.5×10−8). 该基因座名义上与女性VAT和VAT/SAT比率adjBMI相关(补充表10c).

PAT代表心脏周围明显的异位脂肪沉积。总样本中的两项发现欧洲国家安全局和EBF1（EBF1）位点（P=2.8×10−9和1.0×10−9分别为，表1)以前没有与异位脂肪、全身肥胖或体脂分布相关。协会位于欧洲国家安全局和电子束1似乎没有性别差异(补充表10d和10e). 进一步调查欧洲国家安全局和EBF1（EBF1）这些基因座与SAT、VAT或VAT/SAT比率没有关联，突出了它们对PAT的特异性。TRIB2（有毒物质排放清单2）在本次和我们之前的荟萃分析中与PAT相关（P<5×10−8).13

脂肪质量的细胞特征，如脂肪含量、血管和脂肪细胞的大小和数量，可能是影响代谢风险的重要因素，7,10但直接评估具有侵入性。通过计算机断层扫描评估的脂肪衰减特征与脂肪质量特征相关20,21从而代表了脂肪质量的间接标记。ATXN1型仅在男性中与SATHU相关（P=1.4×10−8)女性之间没有相关性（P=0.36，补充表10f). 对相关异位脂肪性状的检查表明，与VATHU的关联方向相似，而SAT和VAT的关联方向相反(补充表10f)这与流行病学调查结果一致。7

内脏脂肪体积与皮下脂肪体积之比（VAT/SAT比率）代表内脏储存脂肪的倾向。UBE2E2型与VAT/SAT比率相关（P=3.1×10−10)；VAT也与名义关联（P=1.4×10−3)但不是SAT，这表明这一发现主要是由于增值税相对丰度较高所致。两个性别阶层的关联方向是一致的(补充表10g). 两个已知的体脂分布位点，LYPLAL1型和LY86型，也与全基因组显著性的VAT/SAT比率相关(表1)与我们之前的分析一致。12,22

计算错误发现率（FDR）来解释27个荟萃分析中的多重测试，结果显示在每个GWAS中所有异位脂肪位点都达到全基因组显著性（P<5×10−8)FDR也达到<1%。

为了检查7个新发现的异位脂肪位点与BMI和WHR的相关性，在最近的GIANT meta-GWAS中对每个领先SNP进行了交叉特征评估，样本量约为当前研究的10–20倍。14,15Bonferroni校正多重测试后，14个SNP-性状（BMI或WHR）中只有2个相关性显著（P<0.05/14=3.6×10−3；补充表10a-g)强调异位脂肪位点的特异性和独特性。

评估已知97个BMI和49个WHR基因座之间的关系14,15以及异位脂肪性状，我们在男女多民族合并样本中检测了这些位点与脂肪体积和相对脂肪体积性状的相关性。由于异位脂肪数据可能无法确定具有统计意义的结果，我们假设BMI和WHR结果的方向与腹部异位特征方向一致，即使p值不显著(补充表11). 97个位点中有87个位点的SAT和BMI之间存在方向一致的SNP性状关联（P二项式=8.9×10−17). 当限制在与SAT名义相关的27个位点时（P坐<0.05），所有27个SNP-SAT相关性与BMI方向一致（P二项式的=7.5×10−9). SAT不是异位脂肪储存库，可能代表一个代谢库，用于更健康的脂肪储存，它与BMI高度相关，并具有共同的遗传风险因素（如方向一致关联的丰富数量所示），但也代表了具有独特遗传影响的独特脂肪分布指标（如GSDMB公司-SAT协会）。并没有其他性状和BMI或WHR表现出方向一致的相关性（均P>0.05）。这些结果进一步表明，与BMI和WHR相比，异位脂肪性状是一种独特的不同性状。

异位脂肪堆积与心脏代谢风险和心血管事件相关。8–11为了深入了解与这些条件相关的潜在机制，我们评估了新的异位脂肪基因座与大规模遗传联盟性状的关联。在66对主要SNP-性状关联中，有3种关联(UBE2E2型-2型糖尿病，EBF1（EBF1）-甘油三酯，以及EBF1（EBF1）-经Bonferroni多重测试校正后，HDL胆固醇）具有统计学意义（P<0.05/66=8×10−4；补充表12).

为了检查是否有任何新的变异与脂肪组织中已知的调控区域重叠，导致SNP和与主要SNP连锁不平衡（LD）的变异（r2>0.8）使用HaploReg中实现的ENCODE Consortium数据进行询问23和RegulomeDB。24除了ATXN1型，所有其他基因座都包含LD中的SNP，其中领先的SNP与脂肪组织中已知的调控区域重叠。例如，潜在客户UBE2E2管变体（rs7374732）和LD中的其他SNPs与脂肪来源干细胞中的已知增强子区域重叠(补充表13).

根据对区域关联图的目视检查，候选基因座列表进一步优先(补充图1a-g)和鉴定1）每个位点基因体内的局部关联(RREB1型,ATXN1型和UBE2E2型)，或2）基因体附近的局部关联，同时在领先SNP的1Mbp内缺乏其他基因(EBF1（EBF1）). 在应用这些标准时，选择了四个基因进行额外的功能研究。

为了验证脂肪细胞发育过程中基因表达或其动态调节的报告间差异将确定具有更高功能重要性可能性的候选基因的假设，4个基因的表达(Ebf1、Rreb1、Atxn1、Ube2e2)通过qPCR对小鼠SAT、VAT和PAT仓库进行评估。Ube2e2公司与SAT（2.1倍，p<0.05，n=5）或PAT（2.6倍，p<0.01，n=6）相比，6周龄C57BL/6小鼠性腺周VAT表达更高，但在资产负债表1,雷布1或Atxn1型(图1a). 此外，还评估了这4个基因在小鼠饮食诱导肥胖中的差异基因表达。2.1倍诱导Atxn1型观察到饮食诱导肥胖小鼠的SAT表达相对于瘦对照组（p<0.05，n=6）。未观察到以下方面的显著差异资产负债表1,雷布1，或Ube2e2公司对肥胖刺激的反应(图1b).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms859697f1.jpg
的功能特性Atxn1型,资产负债表1,雷布1和Ube2e2公司

（a、b、e）数据显示为方框图，其中中心线代表中间值，方框界限包含25第个–75第个百分位数和胡须跨越最大值/最小值。

（a） 通过qPCR测量小鼠皮下（SAT）、性腺周围内脏（VAT）和心包（PAT）脂肪组织（n=6只小鼠）中的基因表达。使用ANOVA和Sidak校正对多重比较进行统计显著性评估。

（b） 与正常食物喂养的对照组（每组n=5只小鼠）相比，高脂肪喂养8周后通过qPCR测量的小鼠脂肪组织中的基因表达。统计学显著性采用双侧T检验。

（c） 通过qPCR测定从皮下（SAT）或性腺周围内脏（VAT）仓库分离的培养脂肪祖细胞（n=4个重复）中的基因表达。诱导成脂分化后，细胞膨胀到汇合处，然后每隔一段时间收集。数据显示为平均值，误差bar=s.e.m.，使用ANOVA和Sidak校正对时间0的多次比较进行统计显著性评估。

（d） 皮下脂肪分离的祖细胞经逆转录病毒转染shRNA构建物后的油-红-氧染色体外脂肪生成的扩张和诱导。相对于携带干扰序列的控制载体，shRNA构建的特异性Atxn1型和Ube2e2公司脂肪分化受损。刻度=1mm。

（e） 用酒精提取Oil-red-o染色剂，并在OD下进行定量520（n=9个技术复制品）。使用ANOVA和Sidak校正对对照组的多次比较进行统计显著性评估（置乱）。代表3个独立实验的数据。

为了探索候选基因在脂肪细胞发育中的潜在作用，我们检测了它们在体外从C57BL/6小鼠皮下和内脏仓库分离的富含祖细胞的基质血管细胞组分的成脂分化。在脂肪分化过程中定期测量候选基因的表达。在分离自VAT和SAT的祖细胞中，我们观察到Atxn1型,Ube2e2公司、和资产负债表1脂肪生成期间(图1c和补充图5). 然而，在所有三种情况下，通过96小时的脂肪诱导，表达恢复到接近基线水平。相反，没有明显的转录调控雷布观察到成脂诱导后1(补充图5).

两者都有Atxn1型和Ube2Ee2公司有证据表明，在小鼠模型中，脂肪生成过程中基因表达存在动态调节，具有可变的去蛋白特异性表达，这为通过基因功能丧失检测进一步探讨其功能意义提供了理论基础。用特异性shRNA逆转录病毒结构敲除这两个基因体外SAT祖细胞的脂肪生成损害了与载体控制感染细胞相关的含脂脂肪细胞的形成，而只有Ube2e2公司敲除VAT分离的祖细胞脂肪生成受损(图1d，e).

我们的发现为深入了解人体脂肪分布的遗传学提供了依据。异位脂肪位点与更普遍的肥胖测量值（如BMI和WHR）之间观察到的显著相关性很少，14,15证明了异位脂肪关联的特异性，强调了脂肪分布精确表型的实用性，并提出了与更一般的肥胖测量相比，异位脂肪储存的不同机制。这种特异性在PAT基因座中尤其显著，这些基因座与SAT、VAT、VAT/SAT比率、BMI或WHR无关。

此外，异位脂肪位点和其他心脏代谢特征几乎没有观察到交叉特征关联，鉴于异位脂肪和心脏代谢风险之间的流行病学关联，这一点令人震惊1–5一个值得注意的例外是UBE2E2型，这是一个已知的T2D基因座25,26在我们的研究中，T2D单核苷酸多态性导联似乎不与SNP导联出现在LD中（r2[rs7374732，rs7612463]在所有HapMap2群体中<0.08），因此可能代表一个独立的信号。rs7374732的主要等位基因与较低的VAT/SAT比率和较低的T2D风险相关，表明靶向相对脂肪分布可能具有有益的下游效应。

功能研究支持以下生理作用：UBE2E2型和ATXN1型通过调节脂肪细胞分化。ATXN1型编码参与Notch信号抑制的染色质结合因子。它与神经系统疾病有关，包括脊髓小脑共济失调1，但没有报道SNP与ATXN1型和脂肪相关性状。相反，UBE2E2型是已知的T2D GWAS基因座，25–27尽管在本研究中，标记物的LD较低，SNP领先。UBE2E2型（3p24.2）编码泛素结合酶E2E2，该酶在人类胰腺、肝脏、肌肉和脂肪组织中表达。当前GWAS结果突出显示UBE2E2型与VAT/SAT比率相关，这是一种衡量脂肪储存在内脏腔而非皮下室的相对倾向的指标。因此，我们推测，SNP相关的基因表达或蛋白产物功能调节可能通过影响脂肪细胞分化而影响肥胖，脂肪细胞发育的相对损伤可能部分解释了与皮下沉积相比，内脏沉积的默认倾向。

鉴于异位脂肪特征的独特性，与其他荟萃分析相比，样本量有限。此外，基于接近GWAS信号的候选基因识别可能会错过基因和调控域之间的远距离相互作用。相比之下，本研究等多种族分析不仅增强了概括能力，而且可能增强某些性状的力量，特别是在有限的等位基因异质性的情况下。考虑到缺乏外部复制，假阳性基因座的可能性也是一个考虑因素。然而，所有新发现的位点通过FDR<1%。在以下情况下，此类统计限制得到了进一步缓解ATXN1型和UBE2E2型通过对小鼠脂肪组织中这些位点的功能验证。

将大规模发现人类遗传学与详细的脂肪表型分析和模型生物实验相结合，确定了7个与异位脂肪性状相关的新基因座，其中ATXN1型和UBE2E2管证明了在脂肪细胞分化过程中的功能作用。未来的研究应进一步探索神经递质调控的确切机制ATXN1型和UBE2E2型影响脂肪细胞分化，以及这种影响是否会导致全身代谢疾病。

联机方法

研究参与者

来自13个欧洲和非洲血统队列的18332名参与者可用于分析皮下和内脏脂肪组织体积特征，来自6个欧洲、非洲、亚洲和西班牙血统队列中的11596名参与者可用来分析心包脂肪体积特征，来自5个欧洲和非洲血统队列的12519名参与者可用于分析衰减特性，来自6个欧洲和非血统队列中的18191名参与者可用来分析相对脂肪分布特性。该流行病学样本构成了本项目开始时已知的最大的参与者集合，其中包括放射衍生异位脂肪测量和遗传数据。补充表2和3包含关于每个队列使用的成像模式、每个队列按性别和祖先分析的每个特征的分布以及队列描述性信息的信息。所有参与者都提供了知情同意书，每项研究都得到了其管理伦理委员会的批准。

特征评估

本研究测量的特征可分为三类：1）脂肪体积测量：皮下脂肪组织（SAT）、内脏脂肪组织（VAT）和心包脂肪组织（PAT）；2） 脂肪衰减测量：皮下脂肪组织衰减（SATHU）和内脏脂肪组织衰减；相对脂肪分布测量：内脏与皮下脂肪组织体积比（VAT/SAT比）。所有基于体积的测量均按照特定研究方案通过计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）进行评估；根据研究特定方案，通过CT评估基于衰减的测量。请参阅补充表2和补充说明了解更多详细信息。

以下特征由所有样本中的每个队列（女性和男性）创建：基于体积的特征-SAT、VAT、VAT（根据BMI调整）、PAT、PAT（根据身高和体重调整）；基于衰减的性状——SATHU和VATHU；相对分布特征——根据BMI心包特征调整的VAT/SAT比率、VAT/SAT-比率。包括异位脂肪特征、调整模型和性别分层分析的理由是4倍的。首先，异位脂肪测量值相互关联，并与一般肥胖症相关，我们希望调整这些因素作为潜在的混杂因素或中间产物，并检查独立于调整因素的遗传关联。请参阅补充表7FHS内所有性状的成对相关性，最大参与队列。例如，增值税和BMI之间的相关性为0.71至0.75，在检查增值税时，调整BMI可提供控制一般肥胖程度的增值税相对金额。尽管VAT/SAT比率和BMI之间的相关性不大，但调整BMI后，我们可以检查与一般肥胖无关的皮下脂肪相比，脂肪在内脏的储存倾向。其次，协变量的调整减少了与给定协变量相关的性状的剩余方差，从而提高了检测遗传关联的能力。第三，在肥胖症遗传学文献中，有证据表明性别二型基因座在女性中解释的差异大于男性28与男性相比，女性的基因座关联性明显更强，反之亦然。14,22最后，我们根据身高和体重调整了PAT，以与之前的工作保持一致13（请参见补充表1性状和调整模型命名指南）。

由于已知的不同性别的体脂分布差异，每个队列产生了性别和血统特异性残差，并根据年龄、年龄平方、吸烟状况、亚群分层测量值和家庭结构进行了调整（如有必要）。基于家庭的研究从所有参与者（包括女性和男性）中创建了一组额外的残差，以在分析整体样本时解释家庭结构。根据分析计划中的预先规定，具有缺失基因型、表型或协变量数据的参与者被排除在分析之外。

研究特定方案

每个队列的特征测量和描述可在补充材料在“队列特定信息和协议”下。

基因分型和插补

每个队列按照补充表4并根据HapMap项目第2阶段单倍型进行高达260万SNP的祖先特异性插补(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en). 在每个队列中，所有新发现的基因座均以>0.8的插补质量进行插补。根据基因座和队列的插补质量可在补充表8.

遗传力分析

利用SOLAR中的方差分量分析，从Framingham心脏研究中估计遗传力。16

遗传相关性分析

使用SOLAR计算皮下脂肪（体积和衰减）、内脏脂肪（体积与衰减）、脏器与皮下脂肪的比率和BMI之间的成对遗传相关性16在3312名参与者的弗雷明翰心脏研究中。我们使用了根据年龄和性别调整后的残差。测试了两个独立的假设：1）RhoG=0是重叠遗传相关性的测试，2）绝对值（RhoG）=1是非重叠遗传相关性测试。

统计分析

在每个队列中，根据血统和性别，对11个性状和模型组合进行全基因组线性回归分析，假设使用等位基因剂量的加性遗传模型。所有性状均接近正态分布，未转化性状用于分析。为了防止罕见变异和/或插补不良SNP的不当影响，我们纳入了次要等位基因计数>10且插补质量>0.4的变异（对于MaCH29)或>0.3（对于IMPUTE30)在每个队列中。

对于多种族分析，我们使用METAL中实施的样本量加权固定效应荟萃分析（Stouffer方法）合并所有队列特异性结果18,19考虑到不同队列中不同成像方式导致的特征测量和缩放差异。欧洲和非洲血统队列导致了所有异位脂肪特征；中国和西班牙血统队列仅对心包容积特征有贡献(补充表3). 对全部样本（All）、女性样本（women）和男性样本（men）进行了所有分析。所有分析都在队列水平上进行了基因组控制校正。我们排除了次要等位基因频率（MAF）<5%的变异，因为检测此类变异关联的能力较低。我们将传统的全基因组显著性阈值设置为P<5×10−8Bonferroni修正了基因组中独立和常见变异的数量（约100万SNP）。除非另有规定，否则所有p值均表示双面p值。所有区域关联图、曼哈顿图和QQ图均使用R版本3.1.1创建(https://cran.r-project.org/). 使用SNAP创建连锁不平衡图31和gap R包(https://www.jstatsoft.org/article/view/v023i08).

为了校正多重测试，使用qvalue R软件包计算了27次异位脂肪GWAS扫描的错误发现率（FDR）(http://github.com/jdstorey/qvalue). FDR<1%被设置为多重测试校正显著性阈值。

在小鼠研究中，以非盲的方式将单个笼子的小鼠随机分配到正常的食物或高脂肪饮食中。每个体内研究进行了一次，没有小鼠被排除在分析之外。如果没有先验的关于感兴趣组织中基因表达差异的数据，我们应用了我们经验中足够大的样本量来检测基因表达的两倍增加。对于来自两个以上组（Shapiro-Wilk）的正态分布数据，进行方差分析测试，然后进行Sidak的多重测试校正(图1a、c、e). 对于非正态数据，使用Kruskal-Wallis检验。用于两个正态分布组之间的比较(图1b使用双侧T检验，除非数据是非正常的，在这种情况下，使用Mann-Whitney检验。数据表示为平均值，s.e.m.双侧p<0.05。使用JMP10.0（SAS研究所）和Prism 6（Graphpad）对数据进行分析和绘图。

敏感性分析

为了确保我们的多民族分析中新发现的基因座是稳健的，并且不受与祖先相关的统计异常值的影响，我们将祖先特异性荟萃分析结果与次要等位基因、次要等位蛋白频率和Z评分关联统计的方向进行了比较(补充表9). 由于每个队列中成像方式的标度差异以及样本量加权荟萃分析的使用，无法计算异质性统计。

首席SNPGSDMB公司在非欧洲血统队列中未观察到与女性SAT相关的基因座，因此未纳入本分析。对于来自新发现的异位脂肪位点的其余6个先导SNP中的每一个，Z得分在所有的血统特异性荟萃分析中都是方向一致的（请参见补充图2每个地点的森林地块和补充图3遗传连锁不平衡[LD]图）。其中5个位点的次要等位基因在祖先之间是相同的；只有rs2842895的次要等位基因(RREB1型)欧洲血统和非洲血统之间存在差异。这一观察结果可以解释RREB1型在多民族荟萃分析中，合并欧洲和非洲血统后的VATadjBMI（P欧洲传统=5.8×10−9至P多民族的=1.1×10−8)尽管多种族研究结果在全基因组范围内仍具有重要意义。

相关性状分析

对于与任何异位脂肪性状相关的每个获得全基因组显著性的SNP，我们提取了我们研究中相关异位脂肪性状各分析层（ALL、WOMEN和MEN）的关联结果。

为了研究新的异位脂肪位点与全身性肥胖（BMI）和中心性肥胖（WHR）测量值的相关性，这两个特征与，但与异位脂肪不同的是，我们从最近的BMI和WHR的GIANT荟萃分析中评估了公开可用数据集中的全基因组显著SNPs。14,15

为了研究新基因座与心脏代谢特征的相关性，这些特征在流行病学上与异位脂肪相关，仅在MAGIC（空腹血糖和胰岛素的葡萄糖和胰岛素联合会荟萃分析32)GLGC（高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和总胆固醇全球脂质遗传学联合会33)，CARDIoGRAM+CAD联盟（冠心病全基因组复制和荟萃分析[CARDIoGRAM]+冠心病[C4D]冠心病和心肌梗死遗传学34,35)国际收缩压和舒张压血压联合会36)和图表（DIAbetes遗传学复制和荟萃分析25).

一般性肥胖和中枢性肥胖基因座分析

评估已知97个BMI和49个WHR基因座之间的关系14,15对于异位脂肪性状，我们在男女多民族合并样本中检测了这些位点与脂肪体积和相对脂肪体积性状的相关性。由于异位脂肪数据可能无法确定具有统计意义的结果，我们假设BMI和WHR结果的方向与异位脂肪特征方向一致，即使p值不显著。采用二项检验检验方向一致性关联的显著性（单侧p值）。如果BMI或WHR基因座的二项检验具有显著性，则进行第二次单侧二项检验，以评估仅限于SNP与名义上具有显著相关性的相关性的一致性（P<0.05）。

功能分析-生物信息学和注释

为了进一步表征新的全基因组显著基因座，查询了以下生物信息学数据库中的铅异位脂肪基因座：GWAS目录(https://www.ebi.ac.uk/gwas/；访问日期：2015年10月15日），以调查与新发现基因座和HaploReg相关的其他性状23和RegulomeDB24识别与指数SNP（r2>0.8;补充表13). 为了将新发现的异位位点和周围基因联系起来，SNIPPER(https://github.com/welchr/Snipper.git)用于寻找生物相关机制(补充表14).

差异解释

使用以下公式近似计算每个位点的方差R（右）2=β2var（SNP）/var（异位脂肪性状），其中β2是SNP对异位脂肪性状的估计影响，以及var（SNP）=2*MAFSNP公司*（1−空气流量SNP公司)由于样本大小加权固定效应荟萃分析没有估计效应大小，因此SNP与异位脂肪性状之间的关联的β系数以及异位脂肪性状的方差是从每个贡献研究的队列水平分析中获得的。所有贡献队列中每个基因座解释的方差平均值在0.1%到4.4%之间(补充表15).

功率计算

使用GWAPower计算异位脂肪全基因组扫描的发现能力37使用本研究中的样本量范围（5842–18332名参与者）和设置α=5×10−8对于所分析的最小样本量（N=5842），我们具有≥80%的检测能力，能够解释至少0.64%的性状方差。对于分析的最大样本量（N=18332），我们有≥80%的能力检测解释至少0.20%性状变异的基因座。例如，我们的新基因座解释了异位脂肪0.15-4.4%的性状变异，如补充表15.

为了解决查找分析中检测关联的能力，我们使用了GWAPower37对于每个数量性状数据集（52000–94000名参与者）的最大样本量，解释了适度的方差范围（0.01–0.05%；基于每个位点解释的方差[0.1–4.4%]以及异位脂肪和感兴趣的心脏代谢性状之间的年龄调整相关性[R2=0.02–0.46]）和修正的Bonferroniα=7.4×10-4（~0.05/66对SNP-性状关联）。对于最小的数据集（空腹胰岛素，N~52000），我们有80%的能力检测基因座，解释了至少0.030%的空腹胰岛素变异。对于最大的数据集（HDL-C和总胆固醇，N~94000），我们有80%的能力检测基因座，解释0.018%的HDL-C或总胆固醇方差。这些计算表明，我们在很大程度上对SNP-性状关联有足够的能力。

eQTL分析

通过收集脂肪相关组织的6个eQTL数据集，对新发现的异位脂肪位点的指数SNP与转录表达进行了检测。数据集是通过出版物、公开来源或私人合作收集的。eQTL数据集符合原始论文中描述的SNP基因转录物关联的统计阈值标准，并且仅限于索引SNPs和具有索引SNP的LD中的SNPs（r2>0.8）跨1000基因组项目试点（SNAP）中可用的所有祖先31). 对超过50项eQTL研究的更大集合的概述，这些研究的脂肪相关数据集（网膜脂肪、内脏脂肪和皮下脂肪，38–42)派生自已发布。43其他eQTL数据来自在线来源，包括ScanDB、Broad Institute GTEx Portal和Pritchard Lab（eQTL.uchicago.edu）。皮下脂肪组织的GTEx分析V4结果从GTEx门户网站下载，然后按如下所述进行额外过滤(网址：www.gtexport.org41). 保留了用sQTLseeker生成的假发现率P≤0.05的拼接QTL（sQTL）结果。对于所有基因水平的eQTL，如果在GTEx中至少有1个SNP超过组织特异性经验阈值，则始终保留该eQTLs的最佳SNP。P<1.67×10的所有基因水平eQTL单核苷酸多态性−11也保留了，反映了P=0.05/（30000个基因×1000000次测试）的全局阈值校正。

Cis-eQTL分析显示欧洲国家安全局（一个与PAT相关的位点）与多个转录本相关(MRPS21型,CTSK公司和LASS2标准，P<10−4)皮下和网膜脂肪组织(补充表16)，表明这些可能是该位点的相关转录本，而不是欧洲国家安全局，最接近铅关联信号的基因。然而欧洲国家安全局由于该区域基因太多，无法实际跟踪，因此未选择该位点进行功能验证。没有发现其他eQTL。

模型生物的特征

用于表征的位点选择

为了对异位脂肪位点进行功能随访和表征，根据区域关联图的目视检查，选择了四个基因图关联(补充图1a–g)在每个基因座的基因体内进行局部关联(RREB1型,ATXN1型和UBE2E2型)或基因体附近的局部关联，并且在领先SNP的1Mbp内缺乏其他基因(EBF1（EBF1）)增加在小鼠模型中实验检测可能的致病基因的可能性。

小鼠研究

实验得到了哈佛医学区动物常设委员会的批准，并符合该委员会的道德规范。雄性C57BL/6小鼠购自Charles River，饲养温度为22±2°C，光照12h（0700-1900 h），黑暗12h（1900-0700 h）随意获得食物和水。除中显示的数据外补充图6，实验在雄性小鼠中进行。使用与蔗糖含量匹配的高脂肪（D12492）和对照食物（D12450J）对饮食诱导的肥胖进行建模（Research Diets，Inc.）。采集脂肪组织，在Trizol（Life Technologies）中均质，并根据制造商协议提取RNA。cDNA是使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Life Technologies）合成的。qPCR在iCycler（Bio-Read）仪器上使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（加州Hercules市Bio-Rad）进行。请参见补充表17用于这些分析中的引物序列。基因表达标准化为18S。使用增量-增量CT方法计算转录水平的折叠变化。

Atxn1基线脂肪特异性表达的比较

鉴于SNP异位脂肪与ATXN1型仅限于男性，我们评估了Atxn1型表达式。在基线水平，脂肪特异性表达Atxn1型(补充图6).

脂肪生成试验

将C57BL/6小鼠的脂肪组织切碎，并在摇晃水浴中用胶原酶D（Roche）消化（37C，225rpm，40min）。将消化液在400g下离心10分钟。过滤颗粒基质血管细胞（40μm），然后用PBS洗涤，并进行额外的阴性选择（CD31负极/血统负极)改编自以前执行的方法44使用抗体涂层微球（Miltenyi Biotec）。细胞在胶原涂层板中培养汇合，并用地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤刺激诱导成脂分化。对于基因功能丧失分析，验证shRNA序列（Broad，Ube2e2：TRCN000004962；Atxn1:TRCN0000240655）或加扰序列亚克隆到逆转录病毒载体（pMKO.1）中。通过qPCR在3T3L1细胞中证实了基因敲除效率，在每一种情况下，可重复实现至少60%的转录活性降低。通过油红o（ORO）染色确定向成熟含脂脂肪细胞的分化，并通过测量光密度520 nm（OD520).

队列特定确认和资金

请参阅补充说明所有参与团队的致谢和资金声明。

补充材料

1

单击此处查看。（270万，docx）

致谢

请参阅补充说明确认和资金来源。

脚注

数据可用性声明：所有荟萃分析的汇总统计数据将在以下网站上提供https://www.nhlbi.nih.gov/research/inmural/researchers/ckdgen（网址：https://www.nhlbi.nih.gov/research/inmural/researchers/ckdgen）.

作者贡献

研究设计：X Guo、AH Kissebah、J Kullberg、LJ Launer、M Olivier、PA Peyser、IB Borecki、DW Boden、SA Czerwinski、J Ding、V Gudnason、TB Harris、C Langefeld、L Lind、Y Liu、JI Rotter、B Towne、M Allison

研究管理：张毅、LJ Launer、M Olivier、PA Peyser、JG Terry、IB Borecki、DW Boden、JJ Carr、SA Czerwinski、V Gudnason、TB Harris、L Lind、BD Mitchell、TH Mosely、Jr、JI Rotter、AR Shuldiner、Hölzke、JG Wilson、M Allison

受试者招募：AH Kissebah、J Kullberg、MK Wojczynski、DW Boden、SA Czerwinski、V Gudnason、L Lind、BD Mitchell、TH Mosely，Jr、AR Shuldiner、B Towne、Hölzke

结果解释：AY Chu、X Deng、VA Fisher、Yang Zhang、MF Feitosa、C Liu、O Weeks、AC Choh、Q Duan、X Guo、NL Heard-Costa、X Liu、L Lu、JR O'Connell、A Parihar、AV Smith、Yi Zhang，AH Kissebah、M Olivier、PA Peyser、JG Terry、MK Wojczynski、LF Bielak、IB Borecki、DW Boden、JJ Carr、SA Czerwinski、J Ding、N Friedrich、SL Kardia、C Langefeld、Y Liu、BD Mitchell、，JI Rotter、AR Shuldiner、B Towne、H Wallaschofski、M Allison、CM Lindgren、W Goessling、LA Cupples、ML Steinhauser、CS Fox

起草手稿：AY Chu、Yang Zhang、MF Feitosa、X Guo、JW Kent Jr.、Yi Zhang，AH Kissebah、MK Wojczynski、IB Borecki、CM Lindgren、ML Steinhauser、CS Fox评论：AY Chuo、X Deng、VA Fisher、MF Faitosa，C Liu、O Weeks、AC Choh、X Guu、NL Heard-Costa、JW肯特Jr.，X Liu，L Lu，A Mahajan，Jr O'Connell，A Parihar，Yi Zang，G Homuth，AH Kessebah（已故），J Kullberg、M Nauck、M Olivier、PA Peyser、JG Terry、LF Bielak、J Blangero、IB Borecki、DW Boden、JJ Carr、SA Czerwinski、J Ding、N Friedrich、E Ingelsson、SL Kardia、C Langefeld、L Lind、Y Liu、BD Mitchell、AP Morris、TH Mosely、Jr、JI Rotter、AR Shuldiner、B Towne、H Völzke、H Wallaschofski、M Allison、CM Lindgren、W Goessling、LA Cupples、，ML Steinhauser，CS福克斯

统计方法和分析：AY Chu、X Deng、VA Fisher、A Drong、Yang Zhang、MF Feitosa、AC Choh、Q Duan、TD Dyer、JD Eicher、X Guo、NL Heard-Costa、T Kacprowski、JW Kent Jr.、LA Lange、X Liu、K Lohman、L Lu、A Mahajan、Jr O'Connell、A Parihar、JM Peralta、AV Smith、J Yao、LF Bielak、J Ding、C Langefeld、Y Liu、BD Mitchell、AP Morris、CM Lindgren

基因分型：Yi Zhang、G Homuth、M Olivier、DW Boden、SA Czerwinski、E Ingelsson、SL Kardia、Y Liu、AP Morris、JI Rotter、AR Shuldiner、B Towne、CM Lindgren

生物信息学：AY Chu、X Deng、VA Fisher、MF Feitosa、C Liu、AC Choh、JD Eicher、AD Johnson、T Kacprowski、AV Smith、Yi Zhang

数据收集：Yang Zhang、O Weeks、R Laqua、N Friedrich、W Goessling、ML Steinhauser

动物工作/功能数据：杨张，ML Steinhauser

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披露：Caroline S.Fox和Audrey Y.Chu分别于2015年12月14日和2016年7月18日受雇于默克研究实验室。

免责声明：本手稿中表达的观点是作者的观点，并不一定代表国家心脏、肺和血液研究所的观点；国家卫生研究院；或美国卫生与公共服务部。请参阅补充说明确认和资金来源。

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