上皮-间质转化过程中整合素β6的转录激活确定了侵袭性结肠癌的新预后指标

Ets-1转录因子对β6整合素的转录控制。

虽然还没有研究β6整合素的转录调控，但我们最近报道了Ets-1转录因子的表达和活性在EMT期间被诱导(12). 这种原癌基因是转录因子家族中的一员，调节参与发育、细胞分化和细胞增殖的基因(13). 有趣的是，我们在人类β6启动子的前1 kb中发现了4个潜在的共有Ets-结合位点（编号为1-4，其中1个最接近转录起始位点；图​图2A）。2A） ●●●●。为了确定Ets-1是否能够反式激活β6启动子，我们对一些Ets家族成员进行了荧光素酶分析（图​（图2B）。2B） ●●●●。Ets-1显示了β6启动子的强烈激活（大于2.5倍），而测试的其他家族成员均未显示任何诱导作用。与PCI对照组相比，密切相关的因子Ets-2以及Mef和NERF2未能更大程度地激活启动子，而其他因子则测试了抑制活性（图​（图2B）。2B） ●●●●。由于所有这些家族成员都结合相同的核心识别序列，这一发现有力地证明了Ets-1在促进β6整合素转录中的选择性。为了评估这4个潜在调控位点的相对贡献，我们进行了凝胶位移分析。Ets-1与位点1强烈结合，其他3个以上的远端序列均无明显结合（图​（图2C）。2C） ●●●●。为了证实这一结果，我们在第一个位点对核心识别序列GGAA-TTAA进行了定点突变。当将增加剂量的野生型Ets-1滴定到转录分析中时，观察到β6启动子活性的明显剂量反应效应（图​（图2D）。2D） ●●●●。相反，位点1的突变完全消除了任何荧光素酶活性，与剂量无关，从而证实了Ets-1结合位点对调节β6转录的特异性和重要性。

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图2

Ets-1转录因子对β6的转录调节。(A类)人整合素β6启动子示意图。标记了转录起始位点（TSS）和翻译起始位点（ATG）。显示了推测的Ets-结合位点（三角形），并列出了4个相应的序列，包括位置细节。一致的DNA结合序列（GGAA）以粗体显示。(B类)与HEK293细胞中的空哺乳动物表达质粒（PCI）相比，一组Ets转录因子对β6荧光素酶报告子结构（-926/+208）的反激活。荧光素酶活性的变化表现为与PCI相比的折叠诱导。(C类)β6启动子中Ets-1与推测Ets位点结合的凝胶迁移率变化分析。如图所示，将体外翻译的Ets-1蛋白或对照提取物与编码推测Ets位点1-4的末端标记寡核苷酸探针一起使用。(D类)β6启动子的突变分析。显示了野生型（黑条）或突变型Ets-1结合位点-66/-63（白条）β6荧光素酶报告子结构的反激活，以响应Ets-1剂量的增加。

EMT后αvβ6表达升高促进致瘤功能。

为了说明αvβ6在EMT期间表达增加的功能作用，我们首先关注其作为纤维连接蛋白受体的经典作用(14). 尽管LIM 1863类有机物是不可移动的(11)，它们能够在EMT后发生趋化性(10). 事实上，使用涂有特定基质蛋白的Transwells（Corning Inc.），我们观察到，当Transwell被纤维连接蛋白包被时，EMT后细胞的趋化性明显高于未被层粘连蛋白包被或未被层粘蛋白包被的细胞（图​（图3A）。三A） ●●●●。这种迁移是由αvβ6介导的，不能归因于EMT后表型的替代性代偿反应，因为它被功能阻断β6抗体抑制（图​（图3B）。三B） ●●●●。这些数据表明，诱导αvβ6介导的纤维连接蛋白迁移是LIM 1863细胞EMT的结果。

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图3

αvβ6表达增加可促进纤连蛋白的迁移。(A类)在未经处理的对照Transwells（Con）或涂有层粘连蛋白（Lm）或纤维连接蛋白（Fn）的Transwell上，对EMT后LIM 1863细胞进行为期3天的趋化迁移分析。数据表示为从每个井中随机选择的8个单独字段的平均值和标准偏差，每个实验一式三份*P（P）< 0.05. (B类)如前所述，在未经处理的（Con）或经纤维连接蛋白涂层的Transwell上对LIM 1863细胞进行趋化试验。在100μg/ml浓度下，在没有（-）或存在功能阻断抗β6单克隆抗体（10D5）或同种匹配对照抗体（IgG）的情况下，对纤维连接蛋白进行趋化作用。抗β6抗体将趋化性降低到这些细胞的未涂层迁移对照水平*P（P）< 0.05.

TGF-β是EMT过程的中心调节剂(5,6,15)在LIM 1863球体模型中，正是这种细胞因子的外源应用驱动了EMT(10). 出乎意料的是，我们发现接受EMT的LIM 1863细胞表现出TGF-β的自分泌表达（图​（图4A）。4A） ●●●●。将类器官或细胞因子处理的细胞在补充有5%FCS的RPMI培养基中接种7小时，用无血清培养基洗涤3次以去除血清中存在的内源性TGF-β，然后再培养17小时。无血清培养基中不含TGF-β，而3次洗液中的最后一次洗液含有来自FCS的背景水平（图​（图4A）。4A） ●●●●。与对照组的剩余TGF-β水平相比，完整类有机物产生的TGF-α微不足道。相反，EMT后细胞分泌高水平的TGF-β，证实了这些细胞中存在自主生成TGF-。

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图4

EMT细胞中自分泌TGF-β的产生和αvβ6的激活。(A类)ELISA检测无血清培养基（培养基）、洗涤后培养基（Wash）或过夜培养基中LIM 1863细胞的类器官或EMT培养物（Org，EMT）分泌的TGF-β水平。(B类)Reporter和LIM 1863细胞培养16–20小时并裂解以测量荧光素酶活性。结果为类有机物（Org）和EMT细胞（EMT）。底部显示添加功能阻断抗β6单克隆抗体（3G9，30μg/ml）或对照抗体（Con）。相对荧光素酶活性（RLU）是测定的活性除以在功能块抗体存在下有机类（对照）细胞共培养的活性*P（P）< 0.001.

TGF-β家族成员作为潜在复合物分泌，需要激活才能结合其受体，αvβ6在结合和激活潜在TGF-(16). 因此，我们通过与稳定表达部分纤溶酶原激活物抑制剂1启动子的水貂肺上皮报告细胞共培养完整的类器官或EMT后细胞，评估EMT期间诱导的αvβ6是否能够激活TGF-β，如前所述(16,17). 与对照（类器官）细胞共培养相比，与EMT后细胞共培养导致荧光素酶水平显著增加（图​（图4B）。4B） ●●●●。值得注意的是，这种增加被抗β6（3G9）的功能阻断单克隆抗体所消除，这表明这种效应完全归因于这些细胞上αvβ6受体的表达增加。综上所述，这些结果表明，经EMT诱导的LIM 1863细胞不仅能自分泌TGF，而且还能利用αvβ6整合素处理和激活潜在的细胞因子。

体内EMT和αvβ6的表达。

发现αvβ6的上调是体外EMT过程的结果，我们试图建立EMT、β6表达和体内肿瘤进展之间的关系。为了达到这一目的，在对相关标记物进行免疫组织化学分析之前，在裸鼠体内皮下种植LIM 1863异种移植瘤。正如预期的那样，这些器官源性肿瘤的β6染色较弱（图​（图5A）。5A） ●●●●。然而，在肿瘤的局部区域有一个显著的β6表达诱导，如图所示​图5A，5A、 尤其是侵袭基质的肿瘤细胞。因此，从侵袭前沿移出的肿瘤细胞的受体表达明显增加。值得注意的是，当对连续肿瘤切片进行E-cadherin染色时，原位肿瘤细胞呈强阳性，而侵入细胞则完全失去了该分子的表达（图​（图5B）。5B） ●●●●。根据我们的模型，我们得出结论，入侵细胞在体内经历了EMT（很可能是基质因子的结果），导致上皮标记物E-cadherin的丢失，并伴随着β6的上调。这些形态学数据不仅支持我们的假设，即β6表达升高促进结肠癌细胞的侵袭和扩散，而且还提供了EMT与疾病进展相关的直接证据。

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图5

整合素αvβ6是体内EMT的标志物。整合素β6(A类)或E-cadherin(B类)LIM 1863异种移植物序列肿瘤切片的免疫染色。E-cadherin在肿瘤组织（T）中表达显著，在基质（S）中无表达。β6免疫反应性在肿瘤中相对较弱，但在侵袭基质的肿瘤细胞中强烈上调，E-cadherin表达也为阴性（箭头所示）。比例尺：50μm。

αvβ6在结肠癌中的高表达是预后不良的指标。

根据我们的EMT数据，我们预测人类疾病中αvβ6的表达频率倾向于晚期、更具侵袭性的肿瘤，而不是腺瘤和原位癌。为了验证这一假设，我们对临床结果已知的恶性大肠肿瘤组织阵列进行了免疫组织化学（图​（图6）。6). 表​表11总结488例成功染色的原发癌标本的患者特征，其中181例（37%）β6表达阳性。患者的中位年龄为68岁，范围为23至94岁。在随后的分析中，β6的染色强度被评分为0、1或2。在488份样本中，307份（63%）呈阴性（0分），95份（19%）呈低表达（1分），86份（18%）呈高表达（2分）（表​（表11).

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图6

αvβ6在恶性结肠癌中的表达。(A类——E类)正常人结肠的代表性β6免疫染色(A类)或恶性结肠癌组织(B类——E类). A否定(B类)和一个积极的(C类)显示肿瘤样本。β6免疫染色显示为D类肿瘤细胞浸润基质显示受体高表达。另一原发肿瘤中的异质性受体表达，强烈上调并优先定位于肿瘤胰岛，如图所示E类. (F类)肿瘤对应的阴性对照E类.比例尺：100μm(A类——C类,E类、和F类)和50微米(D类).

表1

患者特征

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正常结肠粘膜未显示任何β6染色（图​（图6A）。6A） ●●●●。β6表达阴性的肿瘤样本如图所示​图6B，6B、 与此相反，图中显示了β6表达的强免疫反应性示例（评分2）​图6C。6C.与αvβ6的表达是肿瘤进展的一个函数的假设相一致，在通过促结缔组织增生性基质侵入的分化较差的浸润性肿瘤细胞中检测到β6的高表达（图​（图6D）。6D） ●●●●。经常观察到异质分布模式（例如，图​图6E）6E） 这显示了整合素在浸润肿瘤岛边缘的强烈上调和优先定位。该肿瘤的连续切片被用作阴性对照（图​（图66F） 。

然后我们检查了αvβ6表达与患者生存率之间是否存在关联。我们通过仅将与疾病相关的死亡视为一个事件来分析数据，审查与疾病无关的死亡以及最后一次就诊时存活的患者。为了确定αvβ6表达不同（得分0-2）的患者之间癌症生存率的差异，进行了对数回归检验，相应的Kaplan-Meier曲线如图所示​图7：。7对数秩检验表明，得分为0的患者和得分为1的患者之间没有显著的生存差异(P（P）= 0.99). 然而，得分为0的患者与得分为2的患者之间存在显著差异(P（P）=0.048），得分为0或1的患者与得分为2的患者之间(P（P）= 0.04). 此外，Kaplan-Meier曲线图显示，得分为0或1的患者（即β6不表达或低表达）的生存时间比得分为2的患者（β6高表达）长。因此，我们将数据集中得分为0或1的患者合并，并将其生存率与得分为2的患者进行比较。生存率评估显示，两组的中位生存率存在显著差异：得分为0或1的组平均16.5年，而得分为2的组平均不到5年，5年生存率低15%（表​（表2）。2). 从生物学角度来看，我们得出结论，αvβ6的高表达是结直肠癌患者生存率低的预后指标。这一关键发现证实了球体模型预测的数据。

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图7

使用对数库检验进行Kaplan-Meier生存分析。根据β6表达水平（得分0，阴性；得分1，低表达；得分2，高表达）对样本进行分组，并使用log-rank检验分析总体生存率。

表2

疾病相关死亡的存活率估计

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log-rank结果表明，评分和分期的影响之间存在显著的交互作用，β6的存活效果可能仅与侵袭程度相关。因此，我们按阶段分离表达数据，早期（阶段1和2）或晚期（阶段3和4）（表​（表2）。2). 对于3期或4期肿瘤患者，β6的高表达导致5年和10年生存率轻微下降（4-5%），但不显著。与之形成鲜明对比的是，β6表达升高对早期肿瘤患者的生存率影响更大(P（P）=0.0015），与无表达或低表达患者相比，5年生存率下降了28%以上。重要的是，这些数据将β6表达定义为预测早期疾病预后的结直肠癌独立预后变量。

基于上述发现，通过调整年龄、性别、分期和肿瘤类型的影响，使用比例风险比模型对β6表达对生存率的影响进行更精确的估计。表​表3三总结了χ² P（P）所有变量的值、危险比和危险比的95%置信区间。再次，当将评分为0和1的患者（无表达或低表达）与评分为2的患者（高表达）进行比较时P（P）0.007的值显示了生存率的显著差异。正如预期的那样，检测时肿瘤分期和年龄的标准预后指标均对生存率有显著影响。值得注意的是，β6表达升高的风险比为1.6，这表明得分为2的患者的死亡风险比得分为0或1的患者高60%。该结果证实了log-rank检验将β6表达确定为独立变量的结果，重要的是，该结果表明结肠肿瘤中β6高表达是患者生存的重要风险因素。

表3

疾病相关死亡的多元分析（Cox回归模型）

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抗体。

针对αv整合素13C2的鼠单克隆抗体是M.Horton（英国伦敦皇家癌症研究基金会）赠送的一份礼物。抗β6单克隆抗体3G9和2G2是从S.Violette（Biogen Idec，Cambridge，Massachusetts，USA）获得的，最近报道了这些抗体的特异性(29). 抗β6抗体CSβ6和功能阻断单克隆10D5在我们的实验室中纯化，对照小鼠免疫球蛋白购自Sigma-Aldrich。多克隆E-cadherin抗体（H-108）购自Santa Cruz Biotechnology Inc。

实时定量PCR。

对RNA样品进行实时定量PCR，RNA样品首先被反转录，然后用DNA酶处理。根据从国家生物技术信息中心数据库获得的mRNA序列，使用Primer Express软件1.0版（Applied Biosystems）设计引物和探针（如下所列）(31). 所有反应均在ABI PRISM 7700序列检测系统（PerkinElmer Applied Biosystems）中进行。在50μl反应体积中进行三次反应，反应体积包含25μl 2×TaqMan PCR Master Mix、50-nM浓度的正向和反向引物、100-nM浓度双标记探针和1μg总cDNA。所有PCR反应的条件为50°C下2分钟和95°C下10分钟，然后是40个95°C循环10秒和60°C循环1分钟。对每个样本进行肌动蛋白（管家基因）归一化。循环阈值被导出到Excel（Microsoft Corp.）工作表中，用于根据°°CT方法计算折叠变化。引物和双标记探针（TET/TAMRA）如下：β6整合素意义，5′-CTACCTGGTGACCTGTAAC-3′；β6整合素反义，5′-GCTTGCCAGCTGAC-3′；β6整合素探针，5′/5TET/CTAAACGGAGCTGCATTGAGTGCCACC/36-TAM/3′。

表达载体和荧光素酶报告基因构建。

通过PCR从人类基因组DNA（BD Biosciences-Clontech）中克隆了与人类ITGβ6启动子的–926到+208核苷酸相对应的1134 bp片段，并将其亚克隆到pGL2荧光素酶报告载体（Promega Corp.）中。碎片被插入Nhe公司我-Xho公司我位于pGL2载体荧光素酶基因上游。

DNA转染分析。

2.5×10的共转染⁵如前所述，使用4μl LipofectAMINE（Invitrogen Corp.）对HEK293细胞进行不同数量的报告基因构建DNA和表达载体DNA的检测(32). 转染后16小时收获细胞，并测定荧光素酶活性。每个构建体的转染都是独立进行的，并且是重复的。省略了用于测定转染效率的第二个质粒的共转染，因为已经报道了该技术的潜在伪影，并且因为许多常用的病毒启动子包含Ets因子的潜在结合位点(33).

定点突变。

根据制造商的建议，使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）对ITGβ6进行定点突变。简言之，使用了编码ITGβ6启动子Ets位点的PCR引物，-66至-63，以及侧翼序列，其中TTAA取代GGAA（带下划线的突变）：5′-AACATGATTTACTTAATTGTTCCTTATAAGGAAGGCAGG-3′和3′-CCTGCCTCTTTATAAGGAGAAATTAAGTAAATCATGTT-5′。以野生型ITGβ6启动子荧光素酶报告子构建物为模板，采用PfuTurbo聚合酶（Stratagene）进行PCR。PCR反应用Dpn公司一、 并将未消化的质粒转化为DH5α细菌。对单个质粒制剂进行测序，以验证Ets位点突变的纳入。

电泳迁移率变化分析。

如前所述进行电泳迁移率变化分析(34). 简言之，2μl体外翻译产物和0.1–0.2 ng[³²P] dATP标记的双链寡核苷酸探针（5000–20000 cpm）在含有0.5×Tris-Borate-EDTA缓冲液的4%聚丙烯酰胺凝胶上运行。用作探针的寡核苷酸如下（Ets共有结合位点下划线）：人ITGβ6启动子位点–73至–51，5′-AAGACAAGGAGTAAATCATGTT-3′和3′-ACATGATTTACTTCTGTT-5′。

免疫沉淀和免疫印迹分析。

为了评估β6整合素蛋白水平，在含有蛋白酶抑制剂（胃蛋白酶抑制素、PMSF、抑肽酶和亮氨酸蛋白酶）的Triton X裂解缓冲液（1%Triton X-100、50 mM Tris、150 mM NaCl）中提取细胞1小时。通过离心澄清提取物。对于免疫沉淀，用抗鼠IgG-琼脂糖（Sigma-Aldrich）对裂解产物进行两次预处理。使用单克隆13C2或等型匹配对照IgG间接进行免疫沉淀，并用抗鼠IgG-琼脂糖捕获。通过SDS-PAGE分析提取物和沉淀物，并通过电泳将蛋白质转移到硝化纤维素。在含有5%脱脂奶的吐温/特里斯缓冲盐水（TBST）中阻断残余蛋白质位点。过滤器在TBST和2.5%脱脂奶中与针对β6（2G2）的单克隆抗体孵育1小时，并使用ECL进行培养。

异种移植研究。

LIM 1863类有机物（约3×10⁶细胞）接种到雌性裸鼠的侧翼。植入肿瘤时，这些动物的年龄为6-7周。16周后取肿瘤异种移植物，用福尔马林固定石蜡包埋切片进行免疫组化。所有动物研究均由贝斯以色列女执事医疗中心动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

流式细胞术。

用抗β6 mAb 3G9或同型匹配的对照IgG（PBS中为10μg/ml）培养细胞30分钟。清洗后，在FACScan分析（BD Biosciences）之前，细胞在黑暗中再次悬浮在FITC-结合二级抗体中30分钟。

免疫组织化学。

采用亲和素-生物素复合物方案对石蜡包埋组织进行免疫组化。如前所述生成组织微阵列载玻片(35). 简单地说，根据人类研究委员会（HIC）第8219号协议，从耶鲁大学病理学系（美国康涅狄格州纽黑文）的档案中检索到含有结肠癌标本的福尔马林固定石蜡包埋组织块。为了生成微阵列，使用组织微阵列仪（Beecher Instruments Inc.）选择浸润性癌区域进行取芯并放置到受体主块中。岩芯最大尺寸为0.6 mm，间距为0.8 mm。将组织微阵列切成5μm的切片，并通过胶带转移系统（Instrumedics Inc.）和紫外线交联将其粘附在载玻片上。为了进行转移染色，从Beth Israel Deaconess Medical Center病理科随机选择了4例肝转移病例和2例包含结肠转移的淋巴结样本进行研究（组织采购由机构审查委员会批准）。对于免疫组织化学，将载玻片脱蜡，并通过在过氧化氢/甲醇缓冲液中孵育阻断内源性过氧化物酶活性。然后通过在37°C的胃蛋白酶溶液（Zymed Laboratories Inc.）中培养载玻片来进行抗原提取。先用1×酪蛋白溶液（Vector Laboratories Inc.）封闭，然后在4°C下用0.1%BSA中的一级抗体（2G2，2μg/ml；E-cadherin，0.04μg/ml）隔夜培养。阴性对照通过PBS替代一级抗体进行。第二天，将生物素化抗鼠IgG（1:200；DakoCytomation）应用于载玻片，随后使用Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories Inc.）对载玻片进行处理。将载玻片与过氧化物酶溶液（DAKO EnVision+系统，过氧化物酶[DAB]；DakoCytomation）孵育10分钟，用苏木精染色，脱水，清除，然后装裱。

迁移测定。

迁移分析是通过使用6.5-mm Costar-Transwell腔（8μm孔径；Corning Inc.）评估细胞向3T3条件培养基迁移的能力来进行的。如有指示，在抽吸和PBS中3次洗涤之前，在Transwell膜的两个表面上涂上20μg/ml层粘连蛋白-1（Roche Diagnostics Corp.）或50μg/ml人细胞纤维连接蛋白（Sigma-Aldrich），在4°C下浸泡过夜。用TNF-α和TGF-β处理LIM 1863类有机物以诱导EMT，并将其添加到上腔，将3T3条件培养基添加到培养箱的下孔以诱导趋化性。对于抗体抑制研究，将细胞接种在不含抗体、抗β6（10D5）或同型匹配的对照IgG抗体（100μg/ml）的培养基中。3天后，用棉签从过滤器的上表面去除细胞，并将迁移到下表面的细胞固定在甲醇中。使用带有DAPI（Vector Laboratories Inc.）的VECTASHIELD安装介质将过滤器安装在显微镜载玻片上，并使用荧光显微镜通过目测计数量化迁移。检测分三次进行，结果为每个孔的8个随机场的平均值。

TGF-β生物测定。

在96孔板中，LIM 1863细胞在存在和不存在TNF-α和TGF-β的情况下培养24小时（在100μl RPMI加5%FCS中）。用含有10%FCS的DMEM轻轻清洗3次后，2×10⁴报告细胞(17)在不存在或存在β6阻断抗体3G9（30μg/ml）或同型匹配对照（CSβ6）的情况下，以每孔100μl的浓度接种到LIM 1863细胞上。细胞再培养16–20小时，如前所述，对裂解物进行荧光素酶活性分析(16).

这项工作得到了NIH拨款CA 80789和CA107548（给A.M.Mercurio）以及哈佛消化疾病中心（NIH拨款DK34854；给R.C.Bates）的支持。我们要感谢杰弗里·戈德史密斯（贝思以色列女执事医疗中心）、大卫·里姆（美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学）和谢莉娅·维奥莱特（美国马萨诸塞州剑桥Biogen Idec）通过试剂、技术和专业知识对本手稿做出的宝贵贡献。