增强基因组编辑工具箱：全基因组CRISPR阵列库

gRNA文库设计与合成

对于人类和小鼠基因组，设计了两个sgRNAs来靶向每个蛋白质编码基因。对于人类文库，根据以下规则设计了针对17166个蛋白质编码基因的34332个sgRNAs（图3a年，表^S1)：Ensembl v 75中的每个蛋白质编码基因智人对基因构建（GRCh38）进行检查，以找到其组成型编码外显子并对其进行排序——这些外显子由一个基因的所有编码转录物共享（1764409）。在这些外显子中，我们鉴定了所有CRISPR位点，并将设计限制在蛋白质编码序列的前50%（1012436）。每个站点的可能偏离目标得分最多为4次不匹配²¹移除基因组中任何与其他地方完全匹配的sgRNA（933281）。为了最大限度地减少不同遗传背景对sgRNA功能的影响，我们丢弃了在Ensemble Though Genome Phase 1变体集中发现的任何包含单核苷酸多态性的CRISPR位点（丢弃450484个）。最后，为每个基因选择两个5′-最多的sgRNA。对整个文库中靶向的外显子的评估表明，超过85%的sgRNA靶向任何基因的第5外显子，其中靶向外显子2和3的sgRNAs数量最多（图3亿).

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图3

人和小鼠sgRNA阵列库设计。(一)sgRNA全基因组文库设计工作流程示意图。(b条,c（c）)显示人类和小鼠sgRNA阵列库中每个基因外显子设计的sgRNA数量的图表。

类似地用40860个靶向20430个基因的sgRNA设计小鼠文库（图3a年，表^S2系列). 集成v72中的蛋白质编码基因小家鼠筛选并检查基因构建（GRCm38）的组成编码外显子。超过78%的设计sgRNA靶向各自基因的外显子1-3（图3立方厘米). 删除了基因组中与其他任何地方完全匹配的sgRNA，留下1329463个潜在sgRNA设计。由于研究中使用的大多数小鼠基因组要么是C57BL/6J，要么已经对基因组变异进行了充分注释，因此可以预测或避免下游实验中的SNP干扰²²因此，我们决定不过滤小鼠基因组gRNA设计的SNP，因为这会显著减少总库。

传统的限制性结扎克隆用于以384孔板格式组装人和小鼠文库（图4a、b). 评估单个sgRNA载体坐标的质量，以及载体的性能和基因编辑效率。随机选择了92个靶向46个不同人类基因的sgRNA载体。对每个载体进行测序，确认其对每个检测的克隆的身份是正确的，寡核苷酸合成的保真度是100%正确的。每个克隆被单独包装成慢病毒，用于感染表达Cas9的人类A549细胞（图4c类). 在包装的92种不同sgRNA载体中，所有载体都成功地产生了滴度大于10的感染性慢病毒⁶/通过流式细胞术中BFP表达评估ml。未经优化，平均转导效率达到41%（范围为22%至55%）。

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图4

(一)多孔板格式的sgRNA文库克隆策略示意图。(b条)在慢病毒-PB sgRNA载体中合成用于克隆的双寡核苷酸。(c（c）)从人类全基因组sgRNA文库中选择的92个sgRNA验证的实验策略示意图。(d日)CEL-1活性结果表明，在85个产生PCR产物的样品中，有81个样品的切割效率表明95%的功能性sgRNAs的成功率。观察到平均切割效率为27%。

为了评估基因编辑效率，用嘌呤霉素筛选BFP阳性细胞，扩增sgRNA靶位点，并用CEL-1切割法进行评估²³.通过一次通过引物设计，共产生了85个扩增子（表^第3章)其中81例（95%）从慢病毒转导的BFP阳性人群中进行了明确的CEL-I切割（表^S4系列). 慢病毒载体克隆的Cas9切割效率从7%到56%不等，平均为27%（图第4天，表^S4系列).

人类CRISPR位点的选择

Ensembl v 75中的每个蛋白质编码基因智人检测基因构建（GRCh38）以发现其组成编码外显子并对其进行排序。在这些外显子中，我们确定了所有CRISPR位点（N20NGG），仅限于蛋白质序列前50%内的位点。使用WGE数据库中的CRISPR-Analyser包对每个站点的可能偏离目标进行评分²¹。此软件包使用穷举搜索方法，允许CRISPR的sgRNA序列（N20）中的任何位置出现多达四个不匹配。任何在基因组中具有精确的非目标匹配的CRISPR都被丢弃，任何包含在Ensemble千基因组第一阶段变异集中发现的SNP的CRISRP位点也被丢弃。其余的CRISPR在基因内排列为5′至3′，并选择了前两个CRISRP位点。对于任何缺乏两个以这种方式选择的CRISPR的基因，我们从组成型编码外显子中的所有可能的CRISPR中重新选择，但允许来自千基因组变体的SNPs。

细胞培养和转染

雄性JM8小鼠ES细胞³³在37°C和5%CO下培养₂M15：敲除DMEM补充15%胎牛血清（FCS）、2 mML-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素、40μg/ml链霉素、100μMβ-巯基乙醇和1000 U/ml重组小鼠白血病抑制因子（LIF；Millipore）。除非另有规定，否则每天更换细胞培养基。ES细胞培养在γ射线照射（60灰色）SNL76/7 STO饲养层成纤维细胞上³⁴.293FT（Invitrogen）在含有10%FBS和1%谷氨酸Max的DMEM中培养。AML细胞系MOLM-13和MV4-11在含有10%FBS的RPMI 1640中生长。根据制造商的说明，使用Lipofectamine LTX（Invitrogen）转染小鼠ESCs和人类HEK 293细胞。简单地说，100 ng质粒DNA（90 ngPB（聚丁二烯）sgRNA构建和10 ng转座酶将构建物）和0.1μl PLUS试剂混合到10μl OPTI-MEM（Invitrogen）中，并在室温下培养5分钟。将0.3μl LTX试剂稀释到10μl OPTI-MEM中，并与DNA:PLUS混合物混合。在室温下培养30分钟。随后，将悬浮在80μl OPTI-MEM中的15000个ESC或HEK 293细胞与20μl DNA:PLUS:LTX混合物混合，并将其电镀到96 well板的孔上。这些细胞在37°C下培养1小时。然后去除转染混合物并添加150μl培养基。在进行相关功能分析之前，将转染细胞培养6-7天。转染后24小时用嘌呤霉素筛选转染细胞2天或整个细胞培养期。在涉及小鼠细胞的实验中使用的非靶向sgRNA控制是“GCTATATACTCGACACCCCA”，而在涉及人类细胞的实验上使用的非目标sgRNA控制器是“ATTTCGTACCTGGGACGC”。

流式细胞术

购买荧光蛋白（Alexa488）标记的溶血素（FLAER）（VH-bio），并在室温下在PBS中的1%BSA中25 nM的条件下进行细胞染色20分钟。染色细胞在LSRII或LSRFortessa仪器（BD）和Beckman-Coulter-CytolFLEX上进行分析。随后使用FlowJo分析数据。

慢病毒的产生和转导

将3μg慢病毒载体、9μg ViraPower慢病毒包装混合物（Invitrogen）和12μl PLUS试剂添加到3 ml OPTI-MEM中，并在室温下培养5分钟。然后将36μL LTX试剂添加到该混合物中，并在室温下进一步培养30分钟。将转染复合物添加到80%融合的293FT细胞中并培养3小时。转染后24小时用新鲜培养基替换培养基。在转染后48小时收集病毒上清液，并在−80°C下保存。ESCs的转导是在悬浮液中进行的，如下所示：将15000个ESCs和稀释的病毒混合在100μl含有8μg ml-1聚brene（Millipore）的ESC培养基中，在37°C的圆底96-well板孔中培养30分钟，然后将其涂布在明胶涂层96-well板孔中，培养至分析。

将15000个AML细胞和稀释的病毒混合在100μl的RPMI 1640中，加入10%的FBS和8μg ml-1聚Brene（Millipore），在37℃孵育30分钟°C，置于96-well圆底板的孔中，将其置于96-well板的孔上，培养至病毒转导后12天进行功能分析。转导后48小时用嘌呤霉素筛选含有sgRNA结构的AML细胞，并维持筛选2天。

全基因组小鼠和人类sgRNA慢病毒-PiggyBac公司图书馆建设

顶部和底部26-nt寡核苷酸（补充表¹和²)分别以5μM的浓度在10 mM Tris-HCl（pH8.0）和5 mM MgCl中混合₂384孔板中的总体积为50μl。将混合物在95°C下孵育5分钟，并冷却至室温。然后将双链寡核苷酸克隆到英国广播公司pKLV-PB-U6gRNA的I位点(英国广播公司一） -384孔板格式的PGKpuro2ABFP（Lenti-PB）。

然后将克隆的质粒转化为Dh5α细菌，然后在琼脂平板上划线并挑选单个菌落。选取单个菌落后，对所有克隆进行序列验证。此步骤消除了任何空载体污染。甘油储备是由单个菌落的生长形成的。此外，对于任何未通过测序质量控制的克隆，我们重复该过程以恢复所有克隆，以实现整个库的100%序列验证。

所有的高通量液体处理都是使用自动96和384通道移液器Felix（Cybio）进行的。

我们感谢Gabriel Balmus博士对手稿的批判性阅读。我们感谢Sandeep Sundara Rajan博士对基因编辑实验的帮助。我们还感谢Shawn Shafer和Gurpreet Balrey在WTSI和MilliporeSIGMA合作分发阵列库方面的专业知识和努力。Allan Bradley实验室的研究由Wellcome信托基金（WT098051）资助。Liliana Antunes是FCT葡萄牙科学技术基金会（SFRH/BD/84964/2012）博士奖学金的获得者。Emmanouil Metzakopian由英国帕金森氏病（F-1501）资助。