成纤维细胞生长因子1至23（FGF1至FGF23）调节胚胎发育和成人体内平衡期间的各种生物过程(17,21). 此外，FGF信号通路的异常激活与几种颅缝骨化和侏儒综合征有关，如Apert综合征、Pfeiffer综合征和软骨发育不全(11,19,36)和人类磷消耗性疾病，包括常染色体显性低磷性佝偻病和肿瘤诱导的骨软化(31,34). FGF通过结合、二聚和激活细胞表面FGF受体（FGFR）酪氨酸激酶介导其生物效应。FGFR二聚化还需要肝素或硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）(22,28,37). FGFRs的细胞外配体结合部分由三个免疫球蛋白样结构域（D1至D3）组成。D2、D3和互连连接子具有配体结合和特异性的决定因素，而D1已被证明在FGFR信号传导中起到自抑制作用(12,14,20,33). 编码FGFR1至-3胞外结构域的外显子的选择性剪接导致具有独特配体结合特异性和组织定位的c和b亚型(18,38,39).
最近对FGF-FGFR二元和FGF-FGFR-肝素三元配合物的晶体学分析为FGFR二聚提供了两种流行的模型（图。) (24,27,30,32). 对称双端模型基于在不含肝素的情况下获得的对称2-2 FGF2-FGFR1c二聚体（蛋白质数据库标识符[PDB ID]，1CVS）的晶体结构（图。) (27). 就蛋白质相互作用而言，每个配体都是二价的，每个受体都是三价的。FGF和FGFR通过广泛的一级相互作用位点相互作用，形成单体FGF-FGFR复合物（图。). 此外，来自一个单体FGF-FGFR复合体的配体通过与相邻FGF-FGFR复合体的D2的明显二次相互作用促进二聚化（图。). 二聚体界面通过直接受体-受体接触进一步扩大（图。). 二聚体的膜远端形成一个带正电荷的峡谷，位于两个位于中心位置的D2的向内肝素结合位点之间的深处，并逐渐减弱到每个FGF配体的肝素结合表面（图。). 在没有肝素的情况下，一系列硫酸根离子结合到峡谷中，并被提议模拟肝素的硫酸根部分。肝素扩散到2-2 FGF2-FGFR1c晶体中，导致两个肝素分子对称结合到峡谷（图。)（PDB ID，1FQ9）(30). 每种肝素寡糖与二聚体中的一个配体和两个受体相互作用，从而通过增强FGF-FGFR在一级和二级相互作用位点的结合以及通过稳定受体-受体接触来促进FGFR二聚化。重要的是，FGF1-FGFR2c（PDB ID，1DJS）(32)和FGF10-FGFR2b（PDB ID，1NUN）(39)配合物也使用高硫酸铵缓冲液结晶，这有助于在两种情况下形成峡谷二聚体。尽管FGF和FGFR成分不同，但这些峡谷二聚体的复发表明峡谷二聚物中观察到的二聚体模式具有生理相关性。
FGFR二聚化的两种竞争模型。（A） FGF2-FGFR1c-肝素晶体结构（PDB ID，1FQ9）在两个视图中的带状图，这两个视图与水平轴旋转90°有关。在对称双端模型中，D3末端的膜插入点之间的距离为48º。FGF配体和D2分别为橙色和绿色。D3的前半部分被着色为蓝色，并且D3的交替拼接区域被着色为紫色。肝素的原子着色如下：氧红色、硫黄色、氮蓝色和碳灰色。（B） FGF1-FGFR2c-肝素晶体结构的带状图（PDB ID，1E0O）。注意，在不对称模型中，肝素仅与二聚体左半部的FGFR相互作用。在此模型中，D3末端的膜插入点之间的距离为74º。着色如图A所示。每个模型中βC′-βE特异性环的位置用箭头表示。对于每个结构，都指出了D2-D3连接体不变脯氨酸的位置和异构化状态。
Pellegrini等人(24)基于通过共结晶获得的2-2-1 FGF1-FGFR2c-肝素复合物（PDB ID，1E0O）的晶体结构，提出了一个完全不同的FGFR二聚模型（图。). 在这种结构中，两个FGF-FGFR复合物与肝素寡糖的相对侧结合(24). 在这个模型中，FGF和FGFR在蛋白质相互作用方面都是单价的，因此，二聚体界面缺乏蛋白质接触。因此，两个FGF-FGFR半体完全由肝素结合在一起。肝素与每个配体的相互作用不同，只与一个受体结合，导致该模型的明显不对称性（图。). 由于这种不对称性，肝素仅增强两种FGF-FGFR复合物中一种的配体-受体结合。为了进行比较，我们将此模型称为非对称模型。除了二聚化模式不同外，不对称模型在1-1 FGF-FGFR结合模式上也不同于对称的两端模型。这是因为在1E0O中，D2-D3连接体不变脯氨酸（Pro253）在顺式构象，而在所有其他报道的FGF-FGFR结构（PDB ID、1CVS、1DJS、1EVT、1EV2、1FQ9、1NUN和1RY7）中，类似脯氨酸假定反式构象。这个顺式D2-D3连接体不变脯氨酸的构象不会影响FGF-D2界面，但会重新定向D3，导致D3在1E0O中与所有其他FGF-FGFR结构（PDB ID、1CVS、1DJS、1EVT、1EV2、1FQ9、1NUN和1RY7）中接触FGF配体的区域完全不同。
Pellegrini等人(24)建议反式二元FGF-FGFR复合物中D2-D3连接体不变性脯氨酸的构型是非活性的，而且从广义上讲，对称双端模型中的二聚化模式与生理学无关。有人提出，肝素通过催化反式-至-顺式D2-D3连接体不变性脯氨酸的异构化。导致Apert综合征的FGFR2中S252W获得功能突变(35)，被用作支持该假设的间接证据。有人提出，S252W突变通过促进反式-至-顺式Pro253异构化(24)，因为脯氨酸之前的芳香族氨基酸已被证明可诱导高比例的顺式测试肽中的异构体(29). 然而，我们最近阐明了S252W FGFR2c与FGF2配合物的晶体结构，并明确表明Pro253仍存在于反式构象(6). 相反，我们发现S252W突变通过引入额外的受体-受体接触物导致受体功能增强(6)增强1-1 FGF-FGFR结合亲和力(1,7).
明确FGFR二聚化的确切机制不仅对我们理解FGFR功能很重要，而且对我们为治疗目的操纵FGFR信号的能力也很重要。因此，为了解决FGFR二聚化模式的不确定性，我们利用细胞增殖、基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）和实时结合实验，研究了消除仅在对称双端模型中观察到的次级配体-受体相互作用位点的效果。次级配体-受体相互作用位点FGF10突变体的受体和肝素结合亲和力与野生型FGF10的受体和肝素结合亲和性没有区别。然而，这些突变降低了FGF10诱导受体二聚化和信号传导的能力，并为支持FGFR信号传导的次级配体-受体相互作用位点提供了直接的生物学证据。我们还研究了FGFR2中自然发生的Pfeiffer综合征突变Ala172→Phe的影响，该突变巧合地映射到对称两端模型中的受体-受体相互作用位点。事实上，A172F FGFR2b与FGF10复合物的晶体结构表明，这种取代通过增加受体-受体接触导致受体功能增强。最后反式D2-D3连接体不变脯氨酸的构型通过FGF10突变得到验证，该突变消除了仅在对称双端模型中发生的D3-FGF相互作用。总之，我们的研究结果支持对称双端模型中的配体受体结合和二聚化模式，并且与FGFR二聚化的不对称模型不一致。
材料和方法
蛋白质表达和纯化。
将次级配体受体界面突变（E158A、K195A和E158A-K195A）和Pfeiffer综合征突变（A172F）分别引入全长人类FGF10（残基38至208）和人类FGFR2b的最小配体结合部分（D2-D3）（残基140至369），使用快速更换定点突变试剂盒（Stratagene）。野生型和突变型FGF10蛋白在大肠杆菌如前所述，通过肝素亲和性、阳离子交换和体积排阻色谱纯化(39). 野生型和A172F突变型FGFR2b在大肠杆菌，体外复性，通过肝素亲和层析和体积排阻层析纯化(39).
表面等离子体共振分析。
如前所述，使用BIAcore（瑞典乌普萨拉）3000仪器对所有相互作用进行表征(8,9,40). 为了研究FGF10突变（E158A、K195A和E158A-K195A）或致病性FGFR2突变（A172F）对1-1-FGF10-FGFR2b结合的影响，根据标准胺偶联协议（Biacore AB），将野生型或突变型FGF10固定在研究级CM5芯片上(8). FGF同源因子1b（FHF1b），以前称为FGF12b，是一种不与FGFR结合的结构同源蛋白，固定在控制流细胞上(8). 野生型和突变型（E158A、K195A和E158A-K195A）FGF10以及FHF1b均固定到类似水平（反应单位变化，～1000）。为了获得野生型或突变型FGF10-FGFR2b相互作用的动力学数据，在含有野生型和突变型FGF10配体的传感器芯片上以50μl/min的速度注射HBS-EP缓冲液（0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%[vol/vol]聚山梨醇酯20、pH 7.4）中不同浓度的分析物（野生型和A172F FGFR2b）。
使用新蛋白聚糖传感器芯片生成FGF10-肝素和FGFR2b-肝素相互作用的数据，该传感器芯片通过共价固定白蛋白-肝素结合物（密苏里州圣路易斯Sigma）制备，如前所述(9,40). 白蛋白固定在控制流细胞上。为了获得动力学数据，将HBS-EP缓冲液中不同浓度的分析物、野生型和突变型（E158A、K195A和E158A-K195A）FGF10或野生型和A172F FGFR2b以50μl/min的速度注入肝素白蛋白传感器芯片。
使用BiaEvaluation软件（Biacore AB）分别从FGF10（野生型和突变型）或白蛋白-肝素流动细胞中减去来自对照流动细胞（FGF12或白蛋白）的参考响应。通过使用BiaEvaluation软件（Biacore AB）将传感器图全局拟合为1-1交互作用，计算动力学参数。排除了每个感测图开始和结束时的干扰。至少使用四种不同的分析物浓度来确定每种相互作用的动力学参数。在曲线拟合之后，手动检查每个传感器图，以确定模型与实验数据的拟合程度。χ2<10%R（右）最大值在所有情况下。
BALB/MK细胞分析。
DNA合成通过[三H] 如前所述，使用BALB/MK细胞的血清饥饿融合培养物进行胸苷掺入测定(10). 为了研究MEK和MAP激酶的激活，用不同浓度的野生型或E158A-K195A突变型FGF10加或减0.3μg肝素（Sigma）/ml刺激血清饥饿的BALB/MK细胞。通过在150 mM NaCl-50 mM Tris（pH 7.4）中溶解BALB/MK细胞进行免疫印迹实验-1%Triton-10μg抑肽酶/ml-2μM苯甲基磺酰基氟化物-2μM原钒酸钠，在4°C下以14000 rpm（Sorvall）离心20 min，清除溶解物中的不溶物。蛋白质（100μg）通过十二烷基硫酸钠-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜被阻断，并用抗体进行探测，包括抗MEK（圣克鲁斯生物技术）、抗磷酸-MEK、抗MAPK和抗磷酸-MAPK（均来自细胞信号）和抗管蛋白（西格玛）。用化学发光法（Amersham）检测蛋白质的免疫反应性。
MALDI-TOF质谱法。
将含有25 pmol野生型或突变型FGF10-FGFR2b复合物的蛋白质样品（0.5μl）与0.5μl基质溶液（10 mgα-氰基-4-羟基肉桂酸/ml溶于0.1%三氟乙酸和50%乙腈中）混合。允许混合物在室温下干燥，并在单独的基体预成型薄结晶层顶部结晶(4). 使用具有时滞聚焦的微质量TofSpec-2E MALDI-TOF质谱仪以线性模式获得正离子质谱。通过337nm波长N的照射形成离子2脉冲时间为4ns的激光，然后以22.5kV的电势加速。设置矩阵抑制透镜以抑制以下离子米/z5000，使用高质量检测器检测离子。每个光谱总计200次激光照射。使用制造商提供的MassLynx软件采集和处理数据。
结晶、数据收集、结构测定和精炼。
使用先前报道的野生型FGFR2b-FGF10结晶条件（2M硫酸铵）生长A172F FGFR2b-FGF10复合物的晶体(39). A172F FGFR2b-FGF10晶体属于空间群P6422和与野生型FGFR2-FGF10晶体同晶(39). A172F FGFR2b-FGF10晶体的单位晶胞尺寸如下：a=b=115.109º和c=161.957º。不对称单元包含单个A172F-FGFR2b-FGF10复合物。布鲁克海文国家实验室国家同步辐射光源的光束线X-4A处的电荷耦合器件探测器上，从闪速冷冻晶体（在干燥氮气流中）中收集了2.8Ω数据集。使用DENZO和SCALEPACK软件处理数据(23).
使用CNS软件进行刚体、位置和B因子细化以及模拟退火(三). 在FGF10、D2和D3主链原子的精细化过程中，施加了严格的非晶态对称约束。使用程序O对2Fo-Fc和Fo-Fc电子密度图进行建模(15). 最终模型由一个FGF10（残基72至207）、一个FGFR2b（残基151至359）、两个硫酸根离子和一个PEG-400分子组成。所有蛋白质原子的平均B因子为64º2.
结果和讨论
晶体FGF10-FGFR2b二聚体界面上的相互作用。
我们最近报道了FGF10-FGFR2b复合物（PDB ID，1NUN）的晶体结构(39). 该晶体是在高硫酸铵中生长的，含有双重结晶峡谷二聚体（图。)类似于非结晶FGF2-FGFR1c（PDB ID，1CVS）(27)和晶体学FGF1-FGFR2c（PDB ID，1DJS）(32)峡谷二聚体。二聚体界面由次级配体-受体相互作用和直接受体-受体接触组成。
结晶FGF10-FGFR2b二聚体界面。（A） 双晶体FGF10-FGFR2b峡谷二聚体在两个视图中的带状图，与水平轴旋转90°有关。（B） 二聚体界面的二次相互作用位点。（C） 接收器-接收器接口的相互作用。D2、D3和FGF的颜色如图所示。。显示所选相互作用残基的侧链。氧原子是红色的，氮原子是蓝色的，碳原子与它们所属的分子是相同的颜色。右侧是整个结构的视图，其方向与详细视图显示的方向完全一致，并将感兴趣的区域框起来。
次级配体-受体相互作用位点，埋藏表面积为500Ω2由FGF10的β8-β9和β11-β12环区和FGFR2b的D2的βE-βF和βC′-βD环组成（图。). 与FGF2-FGFR1c和FGF1-FGFR2c二聚体结构一样，大多数次级配体-受体相互作用是范德瓦尔斯接触。主要的范德华接触涉及FGFR2b的FGFR不变量Ile204（来自βC′-βD环），其被FGF10的Glu158和Asn159（来自β8-β9环）以及Lys195和His200（来自β11-β12环）包围。此外，氢键加强了这种界面。在FGF2-FGFR1c和FGF1-FGFR2c结构中，FGF配体的主链原子介导氢键，而在FGF10-FGFR2b结构中，GFF10的侧链与受体形成氢键（图。). 具体而言，Glu158的侧链（来自FGF10的β8-β9环）与Ser224（来自βE-βF环）形成两个氢键，Lys195的侧链则与His202的主链形成一个氢键（图。). FGF10侧链原子参与次级配体-受体相互作用位点，使FGF10-FGFR2b二聚体成为研究对称双端模型中观察到的次级配体/受体相互作用的生物相关性的理想材料。
如上所述，在不对称模型（PDB ID，1E0O）中没有促进二聚化的蛋白-蛋白质界面。我们强调了FGF1的Glu105和Gly140的位置，它们分别对应于不对称模型中FGF10的Glu158和Lys195（图。). 由于顺式-FGF1的Glu105通过与D3的Ile257进行范德瓦尔斯接触，形成D2-D3连接体不变性脯氨酸，从而促进1-1 FGF1-FGFR2c结合（图。). FGF1的Gly140不与受体或肝素相互作用（图。). 这两个残基在每个模型中的不同作用为确定FGFR二聚化的正确模型提供了一个诱人的机会。对称双端模型预测，E158A和K195A突变会降低FGF10促进FGFR2b信号传导的能力，因为二聚效率降低。然而，在对称双端模型中，E158A和K195A突变不应影响FGF10对FGFR2b的1-1结合亲和力。不对称模型还预测，FGF10中的E158A突变将降低FGF10激活FGFR2b的能力，但相反，这是由于1-1 FGF10-FGFR2b结合亲和力降低所致。不对称模型预测K195A突变对1-1 FGF10-FGFR2b结合亲和力或FGFR2b信号无影响。
FGF1-FGFR2c-分离蛋白结构的分析（PDB ID，1E0O）。显示了FGF1残基在1E0O中对应于FGF10的Glu158和Lys195的位置。D2、D3和FGF的颜色如图所示。氧原子是红色的，氮原子是蓝色的，碳原子与它们所属的分子是相同的颜色。指出了D2-D3连接体不变脯氨酸的位置和异构化状态。
E158A和K195A突变体以及E158A-K195A双突变体不影响FGF10-FGFR2b或FGF10-肝素相互作用。
我们将FGF10的Glu158和Lys195单独或联合突变为丙氨酸。野生型和突变型（E158A、K195A和E158A-K195A）FGF10蛋白在大肠杆菌并通过肝素亲和、离子交换和尺寸排除色谱纯化。为了测量1-1 FGF10-FGFR2b的结合，我们在没有肝素的情况下进行了表面等离子共振（SPR）研究。所有三个FGF10突变体都与FGFR2b以及野生型FGF10结合（图。和表). 这些数据与对称两端模型中Glu158和Lys195在次级配体-受体相互作用位点的参与一致。重要的是，E158A突变对1-1 FGF10-FGFR2b结合亲和力的影响不足，这与不对称模型中观察到的1-1 FGF-FGFR结合模式不一致。我们还使用SPR检测了E158A、K195A和E158A-K195A FGF10突变体与肝素的结合。SPR数据显示，E158A，K195A，和E158A-K195A的FGF10突变与肝素结合的亲和力与野生型FGF10的亲和力相似（图。和表).
野生型（WT）和突变型FGF10-FGFR2b相互作用的表面等离子体共振分析。图中显示了FGFR2b与（A）野生型FGF10、（B）E158A FGF10，（C）K195A FGF10.（D）E158A-K195A FAGF10和（E）R78A FGF10-结合的传感器图。在面板F中，显示了与野生型FGF10结合的A172F FGFR2b的传感器图。分析物浓度的颜色如下：50 nM，蓝色；100 nM，红色；200 nM，绿色；400 nM，紫色；和800 nM，棕色。表中总结了动力学数据.RU，响应单元。
野生型（WT）和突变型FGF10或FGFR2b与肝素相互作用的表面等离子共振分析。显示了肝素与（A）野生型FGF10。在面板E和F中，分别显示了肝素与野生型FGFR2b和A172F FGFR2b结合的感测图。分析物浓度的颜色如下：50 nM，蓝色；100 nM，红色；200 nMm，绿色；400 nM，紫色；和800 nM，棕色。表中总结了动力学数据.RU，响应单元。
表1。
野生型和突变型FGF10-FGFR2b相互作用的动力学数据总结
| FGF10-FGFR2b型 | 参数 | 价值 |
|---|
| FGF10-FGFR2b型 | K（K）在（/月/日）一 | 1.38 × 105 |
| K（K）远离的（/秒）一 | 8.58 × 10−2 |
| K（K）D类（百万）b条 | 6.23 × 10−7 |
| E158A FGF10-FGFR2b | K（K）在（/月/日） | 1.25 × 105 |
| K（K）远离的（/秒） | 7.57 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 6.04 × 10−7 |
| K195A FGF10-FGFR2b | K（K）在（/月/日） | 1.22 × 105 |
| K（K）远离的（/秒） | 7.46 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 6.13 × 10−7 |
| E158A-K195A FGF10-FGFR2b | K（K）在（/月/日） | 1.43 × 105 |
| K（K）远离的（/秒） | 8.69 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 6.08 × 10−7 |
| R78A FGF10-FGFR2b型 | K（K）在（/月/日） | 2.24 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 4.99 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 2.23 × 10−6 |
| A172F FGFR2b-FGF10型 | K（K）在（/月/日） | 1.27 × 105 |
| K（K）远离的（/秒） | 7.88 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 6.22 × 10−7 |
表2。
野生型和突变型FGF10-肝素以及野生型和变异型FGFR2b-肝素相互作用的动力学数据汇总
| 蛋白肝素 | 参数 | 价值 |
|---|
| FGF10公司 | K（K）在（/月/日）一 | 6.33 × 104 |
| K（K）远离的（/秒）一 | 2.27 × 10−2 |
| K（K）D类（百万）b条 | 4.38 × 10−7 |
| E158A FGF10型 | K（K）在（/月/日） | 6.36 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 2.89 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 4.55 × 10−7 |
| K195A FGF10型 | K（K）在（/月/日） | 5.13 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 2.52 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 4.90 × 10−7 |
| E158A/K195A FGF10 | K（K）在（/月/日） | 6.71 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 2.86 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 4.22 × 10−7 |
| FGFR2b公司 | K（K）在（/月/日） | 6.85 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 1.58 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 2.31 × 10−7 |
| A172F FGFR2b型 | K（K）在（/月/日） | 6.67 × 104 |
| K（K）远离的（/秒） | 1.65 × 10−2 |
| K（K）D类（百万） | 2.48 × 10−7 |
FGF10的突变证实了Glu158和Lys195对FGFR2b信号的重要性。
众所周知，FGFR二聚化是促进所有FGF生物活性的先决条件，包括有丝分裂。因此，为了评估这些突变对受体二聚化的影响，我们检测了野生型和突变型FGF10配体在自然表达FGFR2b的BALB/MK细胞上的有丝分裂活性。与对称双端模型中Glu158和Lys195残基在受体二聚化中的作用一致，所有三个FGF10突变体相对于野生型FGF10诱导DNA合成的能力降低（图。). E158A突变比K195A突变的影响更大，这与二级配体-受体相互作用位点中生成的氢键Glu158和Lys195（两个氢键对一个氢键）的数量一致（图。). 因此，E158A-K195A双突变表现出最低的有丝分裂活性，并反映了这两个突变对FGFR激活的加性效应。接下来，我们比较了野生型和E158A-K195A FGF10刺激MEK和MAP激酶激活的能力（图。). 与有丝分裂数据一致，E158A-K195A双突变损害了FGF10激活MEK和MAP激酶的能力（图。)增加1到2个数量级。值得一提的是，这些数据排除了E158A和K195A突变通过破坏FGF10的三级结构导致有丝分裂活性降低的可能性。有丝分裂分析需要在37°C下延长配体暴露时间（过夜），而磷酸化研究则需要短时间（5分钟）暴露。结合SPR数据，这些数据提供了生理学证据，证明这些残基参与二级受体-受体相互作用，对FGFR2b二聚化和信号转导很重要。重要的是，根据SPR数据，E158A FGF10和K195A FGF10-的生物活性降低与不对称模型不一致。
FGF10的基于结构的诱变证实了Glu158和Lys195对FGF10生物活性的重要性。（A） 增加野生型FGF10或E158A、K195A或E158A-K195A FGF10突变体的浓度，再加上0.3μg肝素（Sigma）/ml，刺激血清饥饿的BALB/MK细胞。16小时后[三H] 加入胸腺嘧啶核苷6h，并按前述方法测定掺入量(39). 误差线表示标准偏差。FL，全长；EK，E158A-K195A。（B和C）将汇合的BALB/MK培养物在无血清培养基中培养过夜，然后在37°C下暴露于纯化的野生型（WT）FGF10或E158A-K195A FGF10突变株，在有（+）或无（−）0.3μg/ml肝素的情况下暴露5分钟。如材料和方法所述，制备约100μg细胞裂解物，并对（B）MEK和P-MEK以及（C）MAPK和P-MAPK进行免疫印迹分析，以评估FGF10通路下游成分的激活。微管蛋白免疫印迹作为负荷对照。
MALDI-TOF分析表明E158A和K195A突变直接损害二聚化效率。
MALDI-TOF最近成为研究非共价蛋白质相互作用的有用工具(2,13). 根据相互作用的亲和力，不同数量的蛋白质复合物可以在电离过程中存活下来，并在质谱仪的电磁场中一起飞行，从而允许对复合物进行半定量评估。我们发展了一种半定量MALDI-TOF方法来研究FGF10-FGFR2b复合物的二聚化。在不存在肝素的情况下野生型FGF10-FGFR2b复合物的MALDI-TOF分析（图。)显示FGF10（～20 kDa）和FGFR2b（～25 kDa。将一当量肝素十二糖添加到野生型FGF10-FGFR2b复合物中，导致在～90 kDa时出现稳定的可重复峰（图。)，对应于二聚体2-2 FGF10-FGFR2b复合物。在确定MALDI-TOF能够检测肝素诱导的FGF-FGFR复合物二聚化后，我们接下来研究了E158A和K195A突变在有无肝素的情况下对FGFR二聚化的影响（图。). 在存在一种等效肝素十二糖的情况下分析E158A-K195A FGF10-FGFR2b复合物（图。)揭示了在肝素存在下比在野生型FGF10-FGFR2b复合物中观察到的明显更小的二聚体峰（图。). 因此，这些数据提供了FGF10的Glu158和Lys195参与FGF10-FGFR2b二聚体的直接证据。
FGF10-FGFR2b二聚体的MALDI-TOF分析。如材料和方法中所述，采用MALDI-TOF质谱法在线性离子模式下分析了25个含有或不含有25 pmol肝素十二糖的1-1 FGF10-FGFR2b复合物（野生型和突变型）的微粒体。（A） 不含肝素的野生型FGF10-FGFR2b复合物A172F FGFR2b-FGF10复合物与一种等效肝素。
致病性FGFR2突变的结构和生物物理分析支持对称双端模型的生理意义。
除了次级配体-受体相互作用位点外，对称双端模型中的二聚化也通过直接受体-受体接触促进。在FGF10-FGFR2b二聚体中，直接接触FGFR2b-FGFRR2b（埋藏表面积，240º2)发生在D2底部，涉及两个单体的βA′-βB和βE-βF环（图。). 一个受体的Ala172与另一个受体相应的Ala进行疏水性相互作用。此外，来自一个受体的Ser220侧链与相邻受体中相应的Ser侧链和Ala172主链氢键结合（图。).
FGFR2的功能获得突变是多种颅缝闭合综合征的原因(11,19). 巧合的是，最近在1964年Pfeiffer最初描述的一个家族中发现了一种新的致病性FGFR2突变，A172F(16,25)并映射到对称双端模型中的接收器-接收器接口。基于此模型，在FGFR2的残基172处引入Phe将增加疏水相互作用的程度，并进一步稳定二聚体。为了验证这个假设，我们结晶了A172F FGFR2b-FGF10复合物。A172F FGFR2b-FGF10复合晶体是在与野生型FGFR2b-FGF10复合物类似的条件下生长的，并且与野生型的FGFR2b-FGF10晶体同晶（PDB ID，1NUN）(39). A172F FGFR2b-FGF10复合物的整体构象与野生型FGFR2b-FGF10复合物的构象相同，两个A172F GFFR2b-GF10复合体形成对称的峡谷二聚体。表中给出了数据收集和细化统计数据对受体-受体界面的检查表明，来自两个受体的Phe172残基参与疏水性相互作用，其芳香苄基相互最佳堆叠（图。). 两个Phe172分子之间最接近的距离是3.3欧姆，共187欧姆2两个残基之间的表面积，而在野生型FGFR2b-FGF10结构中，两个Ala172分子之间的最近距离为3.8º，只有76º2的表面积埋在两个丙氨酸残基之间。因此，晶体结构提供了证据，证明A172F突变通过促进受体-受体接触而导致受体功能增强，如对称双端模型所观察到的。与观察到的功能获得模式一致，SPR分析显示A172F突变不影响1-1 FGF10-FGFR2b或FGFR2b肝素结合（图。和和表和).
A172F FGFR2b-FGF10二聚体中的功能获得相互作用。接收器-接收器接口的详细视图。显示了导致受体-受体接触增加的相互作用残基的侧链。右侧是整个结构的视图，其方向与详细视图显示的方向一致，感兴趣的区域被框住。D2、D3和FGF10的颜色如图所示。.
表3。
数据收集统计
| 精炼统计c
|
|---|
| 分辨率（Ω） | 反射（总计/唯一） | 完整性（%） | R（右）sym（对称）一(%) | 信号（〈我/σ我〉) | 分辨率（Ω） | 反思 | R（右）晶体/R（右）自由的d日(%) | 根-平方偏差
|
|---|
| 债券（Å） | 角度（度） | B因素e（电子）(Å2) |
|---|
| 30-2.8 | 179,609/15,732 | 96.7 (100)b条 | 6.3 (26.8)b条 | 26.9 | 25-2.8 | 15,252 | 25.3/28.8 | 0.014 | 1.64 | 64 |
为了进一步证实这些结构发现，我们在肝素存在和不存在的情况下对A172F-FGFR2b-FGF10复合物进行了MALDI-TOF分析（图。). 在这个含有肝素的突变样品中观察到明显较大的二聚体复合物峰（图。)与肝素存在时野生型FGFR2b-FGF10复合物相比（图。)从而进一步证明A172F突变直接增强了受体二聚体。有趣的是，在没有肝素的情况下，A172F FGFR2b-FGF10样品中出现了对应于二聚物的峰（图。)这表明A172F突变减少了FGFR2b-FGF10复合物二聚化中对肝素的需求。这与我们的结构发现一致，因为A172F突变加强了二聚化界面，从而减少了肝素在二聚化中的需要。因此，A172F突变导致FGFR功能增益的机制是全新的，并且与对称的两端模型一致。重要的是，由于Ala172不参与1E0O中的任何功能性相互作用，不对称模型不能提供通过A172F突变获得受体功能的机制。
FGF10突变体的SPR分析再次证实了反式D2-D3连接体不变脯氨酸的配置。
除了受体二聚化的模式不同之外，不对称模型与对称两端模型在1-1 FGF-FGFR结合的模式上也不同。在FGF10-FGFR2b晶体结构（PDB ID，1NUN）中，以及除1E0O以外的所有其他FGF-FGFR晶体结构中，D2-D3连接体不变脯氨酸位于反式构象。我们之前已经证明FGF10的Asp76、Arg78和Arg155在初级配体-受体界面内与D3特异性接触，D76A、R78A和R155A突变降低了FGF10有丝分裂活性(39). 使用FGF10-FGFR2b模型和D2-D3连接体不变脯氨酸顺式构型，我们表明D3的重新定向阻止了这些残基和D3之间的相互作用(39). 这些数据反驳了顺式D2-D3连接体不变脯氨酸的配置。为了进一步证明D2-D3连接体不变性脯氨酸采用反式我们使用SPR分析了R78A FGF10突变体与FGFR2b的结合（图。和表). R78A突变导致1-1 FGF10-FGFR2b结合亲和力降低约4倍，这是由于FGF10-FGFR2b复合物中初级配体受体界面内发生的几个氢键丢失所致(39). 加上E158A突变对FGF10-FGFR2b结合亲和力没有影响（图。)，这些发现证实了D2-D3连接体不变性脯氨酸必须采用反式配置。
配体结合特异性只能由反式D2-D3连接子不变脯氨酸的构象。
通过比较FGF2-FGFR2c和FGF10-FGFR2b的晶体结构(26,39)，我们已经表明，FGF和剪接异构体特异性βC′-βE环之间的接触是每个配体优先与FGFR2的一个剪接亚型结合的基础(26,39). 这些结构数据与非对称模型相矛盾顺式D2-D3连接子不变脯氨酸在1E0O中的构象使βC′-βE环远离FGF（图。)因此，在不对称模型中，这个环在配体结合中不起任何作用。此外，对定位于FGFR2c的βC′-βE环的致病性FGFR突变的影响的分析提供了反对顺式D2-D3连接体不变脯氨酸的构象(7). 我们已经证明，这些βC′-βE环致病性突变会不同程度地影响各种FGF的结合，甚至能够改变FGFR2c的FGF结合特异性(7). 有趣的是，哈默和他的同事最近意识到D2-D3连接体不变性脯氨酸必须假定反式配置，因为他们无法使用包含顺式-配置的D2-D3连接体不变脯氨酸(5). 相反，通过使用包含反式-他们还得出结论，FGF19和FGFR4的βC′-βE环之间的特异性相互作用在决定FGF19-FGFR4复合物的精细特异性方面起着关键作用(5).
FGF1-FGFR2c-肝素晶体中也形成峡谷二聚体。
Pellegrini等人报告的FGF1-FGFR2c-肝素复合物（PDB ID，1E0O）(24)也在高硫酸盐离子条件下结晶（1 M硫酸锂）。有趣的是，除了Pellegrini等人报告的不对称二聚体外，对1E0O中的晶体堆积进行的检查表明(24)，晶格还包含对称的峡谷状二聚体，其通过次级配体-受体相互作用以及直接受体-受体接触来稳定（图。). 我们注意到，在这种对称的峡谷状二聚体（PDB ID，1E0O）中，D3结构域是共面的，而不是垂直于质膜（与其他峡谷二聚体一样），这是由于顺式D2-D3连接体不变脯氨酸的构象（图。). 此外，单个肝素分子结合到峡谷的一半，有序的硫酸根离子装饰着峡谷的另一半。峡谷中出现单一肝素分子并不意外，这反映了FGF1-FGFR2c-肝素复合物结晶过程中使用的2-2-1 FGF-FGFR-肝素化学计量比。尽管D2-D3连接体不变脯氨酸的构象不正确，但这种对称的峡谷状二聚体的形成是显著的，并重申了对称双端模型中FGFR二聚体模式的生理意义。矛盾的是，不正确的顺式D2-D3连接体不变性脯氨酸的构型一定阻止了Harmer及其同事考虑在其晶体中观察到的对称的峡谷状二聚体。
在1E0O中观察到对称的峡谷状二聚体。（A） 1E0O中峡谷二聚体的GRASP（图形表示和分析或结构属性）表示。这两个视图通过绕水平轴旋转90°来关联。D2、D3、FGF1和肝素的着色如图所示。注意，D3末端的膜插入点（箭头所示）与质膜共面，这是由于D2-D3连接体不变脯氨酸的构象不正确所致。在此表示中，D3末端的膜插入点之间的距离为84º。图中只显示了与峡谷结合的硫酸盐离子，它们的颜色如下：氧红色、硫黄色和氮蓝色。（B） 为了进行比较，FGF2-FGFR1c-肝素结构（PDB ID，1FQ9）中观察到的峡谷二聚体的GRASP表示。这两个视图通过绕水平轴旋转90°来关联。在该表示中，D3末端的膜插入点之间的距离（由箭头指示）为48Å。着色如面板A所示。
结束语。
受体二聚化是受体酪氨酸激酶激活的普遍机制。最近的晶体学研究表明，受体酪氨酸激酶亚家族的受体二聚化模式差异很大，并且是为了满足其各自的生物学功能而定制的。在对称两端模型中观察到的受体二聚化模式是高度协作的，非常适合执行FGF信号在发育中的重要作用。该模型基于协同结合事件，包括次级配体-受体和受体-受体相互作用，这是由HSPG促进的。因此，这种二聚化模式能够感应和响应发育过程中HSPG的动态变化。未来的挑战包括对这些变化如何调节二聚体组装的结构和生物化学研究，并将进一步深入了解FGF信号在生理和病理生理环境中的作用。
