摩尔内分泌。2010年1月1日；24(1): 218–228.
脂联素通过AdipoR1-AMPK-iNOS途径抑制脂多糖诱导的外膜成纤维细胞迁移和向肌成纤维细胞的转化
心血管重塑与功能研究重点实验室（X.-j.C，L.C.，L.L.，M.F.，X.L.，K.Z.，Y.-Y.R.，X-b.H.，M.-X.A.，Y.Z，中华人民共和国；和山东大学附属济南中心医院（X.-j.C），山东济南，250014，中华人民共和国
将所有信件和转载请求发送至：中国教育部和卫生部心血管重塑与功能研究重点实验室，山东大学齐鲁医院，中华人民共和国山东省济南市文化西路107号，邮编：250012。电子邮件：摩卡人anis.piv@hxiad. 收到日期：2009年3月19日；2009年9月22日接受。
摘要
脂联素是一种重要的抗动脉粥样硬化脂肪细胞因子，可抑制炎症、胰岛素抵抗和氧化应激。血管外膜的炎症是动脉粥样硬化发病的关键因素。外膜成纤维细胞（AFs）在炎症和动脉粥样硬化状态下可增殖、分裂为肌成纤维细胞，并迁移至内膜成为动脉粥样硬化斑块的新成分。我们研究脂联素是否可以阻止AF增殖、迁移和转化为肌成纤维细胞。在存在或不存在脂联素的情况下，用脂多糖（LPS）刺激培养的AF。甲基噻唑四氮唑试验、迁移和划痕试验表明，脂联素分别降低了LPS诱导的房颤增殖和迁移，而AdipoR1小干扰（si）RNA（siAdipoR1）、AMP-activated protein kinase（AMPK）siRNA（siAMPK。免疫细胞化学和Western blot显示，脂联素减少了AF向肌成纤维细胞的转化，用siAdipoR1、siAMPK和AMPK抑制剂治疗可增加这种转化。RT-PCR、Western blotting和一氧化氮（NO）分析表明，脂联素降低诱导的一氧化氮合酶（iNOS）和硝基酪氨酸的表达以及NO和ONOO−LPS诱导的生产。用siAdipoR1、siAMPK和AMPK抑制剂处理后，显著减弱脂联素诱导的AMPK及其下游靶乙酰辅酶A羧化酶磷酸化，上调iNOS mRNA和蛋白表达，导致NO和ONOO显著增加−生产。在载脂蛋白E缺乏小鼠中，经处理的血管外膜免疫组化显示iNOS表达和ONOO−腺病毒-双连接蛋白载体可以逆转其产生。综上所述，这些结果表明脂联素通过抑制AF中的AdipoR1-AMPK-iNOS通路，减少LPS诱导的NO生成和亚硝化应激，防止AF增殖、转化为成肌纤维细胞并迁移至内膜，从而加重动脉粥样硬化。
脂联素可以抑制LPS诱导的AFs迁移和转换。外膜周围脂肪组织分泌的脂联素可能是动脉粥样硬化的新靶点。
动脉粥样硬化被认为是一种炎症性疾病。氧化应激，产生•O2−及其衍生的氧化剂，如过氧亚硝酸盐（ONOO−)有助于动脉粥样硬化的发生(1). 由于动脉损伤通常是在与循环血液的界面处开始的，因此，大多数旨在揭示损伤诱导动脉反应机制的研究都集中在最内层（内膜），而不是最外层外膜。然而，越来越多的证据表明外膜是动脉粥样硬化和血管功能障碍的介质(2,3,4).
外膜成纤维细胞（AFs）是外膜中的主要细胞类型，可分化为肌成纤维细胞，迁移、增殖和分泌细胞因子，在外膜损伤反应中发挥重要作用。值得注意的是，主动脉外膜是一氧化氮（NO）的潜在来源(5)外膜炎症可以刺激自由基氧物种的形成(6). 然而，由外膜炎症引起的一氧化氮应激的生理或病理生理作用仍不清楚，其与心血管疾病的关系也不清楚。
脂联素是一种由脂肪组织分泌的脂肪细胞因子(7). 脂联素作为一种抗炎因子发挥作用，也与动脉粥样硬化、高血压和冠心病的发展有关(8,9,10,11). 脂联素的过度表达可以通过减轻载脂蛋白E缺乏症（ApoE）的内皮炎症反应来改善动脉粥样硬化−/−)老鼠(11). 我们以前的研究表明，外膜脂联素治疗也可以减小动脉粥样硬化斑块的大小(12). 我们最近报道了脂联素受体在外膜组织和AF中表达，这意味着脂联素可以通过外膜产生生物效应。然而，脂联素通过血管外膜发挥抗动脉粥样硬化作用的机制尚不清楚。
我们的目的是确定外膜炎症诱导的氧化应激和硝酸应激是否会加剧动脉粥样硬化，以及外膜注射脂联素是否可以缓解氧化应激和硝化应激的增强。我们还旨在描述脂联素在动脉粥样硬化和炎症条件下通过外膜发挥抗炎作用的机制。
结果
脂联素（APN）抑制脂多糖（LPS）诱导的AFs增殖和迁移
与LPS组的AFs相比，甲基噻唑四氮唑（MTT）分析显示APN+LPS组AFs的490 nm OD值显著降低（图1A). APN（10μg/ml）显著降低了10μg/mlLPS诱导的AFs迁移增加（42.83±2.14与。15.67 ± 1.58,P（P）<0.01）（图1B). 为了进一步确定APN对AF迁移的影响，进行了划伤试验，以检查细胞穿过伤口边缘迁移到划伤区域（图1B). APN比单独使用LPS处理的AF减少了LPS诱导的AF向划痕区域的迁移。这表明APN对减少LPS介导的AF增殖和迁移有重要作用。
APN减少LPS诱导的AF向MF的转化
免疫细胞化学显示，与LPS处理的AF相比，APN和LPS处理后的AF向MF的转化减少（图1C). 此外，与免疫细胞化学结果类似，Western blotting显示APN+LPS组抗α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达高于LPS组（图1D).
APN抑制LPS诱导的AFs一氧化氮合酶（iNOS）表达和NO生成
为了评估APN对LPS诱导的AFs中iNOS表达和NO生成的影响，我们检测了iNOS mRNA和蛋白的表达以及NO生成。用不同剂量（3、10和30μg/ml）的APN预处理AFs 2 h，用10μg/ml的APN处理不同时间（1/2、1、2、6、12、24和48 h）。然后用LPS（10μg/ml）处理AFs 24 h。数据表明，APN以剂量依赖性的方式降低LPS诱导的iNOS mRNA，在10μg/ml时效果最大。APN（3、10、30μg/mlP（P）< 0.01). APN还以时间依赖的方式降低LPS增加的iNOS mRNA表达。与对照组相比，iNOS mRNA水平在第1/2、1、2、6和12小时显著降低（所有P（P）<0.01），在2小时时出现峰值效应（图2A). LPS增加的iNOS蛋白水平在2小时显著降低，在6小时达到峰值(P（P）< 0.001). 与iNOS的表达一致，在APN处理的AF中，培养基中LPS增加的NO生成也以剂量和时间依赖性的方式降低（所有P（P）<0.01）（图2C).
AdipoR1的siRNA可以抑制AF中AdipoR1的表达
为了确定APN在AF中的功能，我们首先研究了APN受体AdipoR1是否在AFs中表达。RT-PCR和Western blot分析表明，AdipoR1mRNA和蛋白质在AFs表达，与骨骼肌细胞表达水平大致相同（图3、A和B）。此外，免疫荧光染色证实AdipoR1蛋白在小鼠AF中表达（图3C). 接下来我们检查AdipoR1 siRNA（siAdipoR2）是否可以抑制AdipoR1的表达。Western blot分析表明，用50 pmol/l的siAdipoR1处理可以阻止AdipoR2蛋白的表达，而作为对照，用siβ-actin处理可以阻止β-acton蛋白的表达。这表明siAdipo R1的敲除作用是特异性的（图3、D和E）。siAdipoR1的敲除作用随着剂量的增加而逐渐增加，并在250pmol/L时显示出最大作用（图3D).
处理AdipoR1和AMPK抑制剂化合物C的siRNA可逆转APN降低的iNOS和硝基酪氨酸的表达以及NO和ONOO的产生−LPS诱导
阐明所涉及的信号通路，iNOS和硝基酪氨酸以及NO和ONOO的调节−对APN的生产进行了检查。用si-AdipoR1和指示的激酶抑制剂预处理AF 48 h，然后用10μg/ml APN再培养2 h和10μg/ml LPS再培养24 h。用siAdipoR1（100 pmol/L）和AMPK抑制剂化合物C（20μmol/L）处理AF有效逆转LPS表达诱导的APN降低iNOS 47.7%(P（P）<0.01）和41.7%以及（全部P（P）<0.001），硝基酪氨酸表达分别增加60.2%和55.5%（均P（P）<0.01）（图4、A和B）。用siAdipoR1（100 pmol/L）和AMPK抑制剂化合物C（20μmol/L）处理也能增强APN-还原的NO和ONOO−APN刺激条件下的生产（图4、C和D）。
APN、AdipoR1 siRNA和AMPK抑制剂化合物C对AMPK信号通路的影响
为了确定APN调节的iNOS表达和NO生成的分子来源，测定了AMPK和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的蛋白磷酸化（图5). APN和LPS处理的AF中AMPK和ACC蛋白磷酸化增加（所有P（P）< 0.01). 然而，siAdipoR1（100 pmol/L）和AMPK抑制剂化合物C（20μmol/L）抑制了这种作用（所有P（P）< 0.01).
AMPK的siRNA治疗逆转了APN降低的iNOS和硝基酪氨酸的表达以及NO和ONOO的产生−LPS诱导
为了再次阐明所涉及的信号通路，iNOS和硝基酪氨酸以及NO和ONOO的调节−对siAMPK的生产进行了检查。AFs用siAMPK（10μ米)48小时，然后用10μg/ml APN再培养2小时，用10μg/ml LPS再培养24小时。用siAMPK（10μ米)有效逆转分别由LPS和硝基酪氨酸表达诱导的APN降低的iNOSP（P）<0.01）（图6、A和B）。用siAMPK（10μ米)还增强了APN，减少了NO和ONOO−APN刺激条件下的产量（图6、D和E），这与化合物C的作用类似。
AdipoR1、siAMPK和AMPK抑制剂化合物C的siRNA对AFs增殖、迁移和转化的影响
我们还确定了siAdipoR1、siAMPK和AMPK抑制剂化合物C是否影响APN刺激条件下AF向MF的增殖、迁移和转化。用siAdipoR1（100 pmol/l）、siAMPK（10μ米)在MTT分析中，AMPK抑制剂化合物C（20μmol/升）的增殖和迁移比APN+LPS处理组的增殖和转移更多（图7D)和划痕试验（图7A). 此外，siAdipoR1（100 pmol/l）、siAMPK（10μ米)AMPK抑制剂化合物C（20μmol/L）显著增加了APN刺激条件下迁移AF的数量（所有P（P）<0.01）（图7B)，并增加了对MF的转换（图7C).
APN基因转染对ApoE中iNOS和硝基酪氨酸表达的影响−/−老鼠
因为我们在培养的AF中发现了NO的产生以及iNOS和硝基酪氨酸的表达，所以我们研究了APN通过外膜处理是否会降低这种产生的动物模型。ApoE的免疫组织化学染色−/−颈动脉显示iNOS和硝基酪氨酸增加，通过外膜用Ad-APN治疗可显著减弱iNOS及硝基酪氨酸的形成（图8).
讨论
在本研究中，我们旨在研究外膜炎症诱导的亚硝化应激、外膜给药APN的可能解救以及小鼠AFs和ApoE的机制−/−老鼠。首先，我们确定AFs可以在mRNA和蛋白质水平上表达AdipoR1。其次，利用重组小鼠APN，我们发现APN可以抑制LPS诱导的AFs增殖、迁移，并减少LPS介导的AFs向MFs在动脉粥样硬化中的转化。第三，我们发现APN在LPS介导的炎症中起作用，至少部分是通过激活AdipoR1-AMPK-iNOS信号通路。
动脉壁是一个高度可塑的三维结构，具有独特的适应能力，能够应对发育过程中和某些血管病理条件下发生的血压、流量和剪切应力的变化(13,14,15,16). 外膜在为细胞和分子提供影响新生内膜形成和血管重塑能力方面的作用最近受到了相当大的关注(17,18,19,20,21). 在对损伤的反应过程中，可以对常驻外膜细胞进行重新编程，使其具有不同的结构和功能行为。严重和轻度球囊损伤实验模型中的AF(17,18,19,20)可以表型转化为平滑的肌肉样细胞，即MFs。外膜细胞向内皮下间隙迁移的第一个证据是通过在增殖细胞中加入溴脱氧尿苷的脉冲标记实验获得的(17,18,19). 我们发现LPS作为一种感染性刺激物，可以增加AF的增殖和迁移，并促进AF向MF的转化。我们以前的研究表明，外膜APN治疗也可以减小动脉粥样硬化斑块的大小(12). 然而，APN能否逆转LPS诱导的AFs增殖、迁移和转化在体外未知。在研究中，我们发现APN可以通过LPS诱导的外膜炎症抑制AFs的增殖和迁移，并减少AFs向MFs的转化，这意味着APN在血管保护中发挥作用。
亚硝化应激引发炎症级联反应，包括急性期蛋白合成、炎症粘附分子上调和促炎细胞因子释放(22,23). iNOS与动脉粥样硬化等慢性代谢紊乱有关(24,25)与肥胖相关的糖尿病(26,27)炎症状态也被认为在其中起致病作用。外膜具有独立的iNOS系统，在炎症刺激下可产生大量NO。LPS刺激的AFs中APN和iNOS之间的关系尚不清楚。我们的结果表明，LPS刺激产生iNOS的显著上调，然后上调iNOS介导的NO生成和硝基酪氨酸表达。APN显著下调iNOS和硝基酪氨酸表达的增加以及NO的过度生成。这些数据表明，APN预处理能够有效抑制LPS激活的AF的炎症反应和亚硝化应激−/−老鼠吃高脂肪食物。我们还发现，外膜给予Ad-APN可逆转iNOS和硝基酪氨酸的表达。这些结果表明，APN是一种抑制动脉粥样硬化诱导的亚硝化应激的天然分子。
AMPK是一种异三聚体信号激酶，是一种关键的能量敏感途径，在刺激葡萄糖摄取方面具有重要功能。AMPK在几种细胞类型中具有血管保护作用(28,29,30). 我们目前的研究表明，在AFs中，AMPK活性被LPS下调，而被APN上调。5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β对AMPK的药理激活-d日-核糖呋喃糖苷（AICAR）和一种抗糖尿病药物抑制接触炎症介质的细胞和组织中iNOS的诱导(31). 基因实验证实，AMPK活化剂通过激活AMPK，至少部分阻断iNOS介导的NO生成(32). APN下调NAPDH氧化酶Nox4的表达(33)通过抑制iNOS和由此产生的氧化/硝化应激，保护心脏免受缺血再灌注损伤(34). 在本研究中，我们证明，在siAdipoR1转染和AMPK抑制剂化合物C处理下，iNOS和硝基酪氨酸的表达和NO的生成显著增加，但随着APN的增加而减少。这些结果首次直接证明APN通过AdipoR1-AMPK途径抑制LPS介导的AFs中iNOS的表达，从而减弱亚硝化应激诱导的AFs迁移和AFs向MFs的转化。
生理或药理学浓度的NO具有显著的心脏保护作用，而NO和•O之间的反应产物2−、ONOO−，具有极强的细胞毒性。我们的结果表明，APN抑制炎症诱导的iNOS表达并阻断ONOO−形成在体外和体内并部分通过AdipoR1-AMPK-iNOS途径减少LPS诱导的AF迁移和AF向MF的过渡。这些新发现表明，APN浓度降低，就像在2型糖尿病和冠心病中观察到的那样，可能在一定程度上加剧动脉粥样硬化的发展。血管外膜周围脂肪组织分泌的APN可能是治疗动脉粥样硬化疾病的新靶点。
材料和方法
材料
细胞培养基和补充剂购自GIBCO-BRL（Rockville，MD）。重组小鼠APN，产生于大肠杆菌LPS和AMPK抑制剂化合物C分别从Biofendor（德国海德堡）、Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）和Merck（德国达姆施塔特）购买。对于Western blot分析，兔抗磷酸化AMP激酶（AMPK）、兔抗AMPK、兔抗AMPKα1，兔抗AMPKα2从Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）购买兔抗磷酸化ACC、兔抗ACC和兔抗α-SM-肌动蛋白抗体。兔抗iNOS抗体和兔抗硝基酪氨酸抗体购自Upstate（伊利诺伊州芝加哥）。免疫印迹、MTT和4,6-二氨基-2-苯吲哚盐酸盐（DAPI）的二级抗体（山羊抗兔IgG）从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。用于Western blot分析的增强化学发光系统购自Pierce（Rockford，IL）。所有其他化学品都是商用的最高等级化学品。
细胞培养
雄性C57BL/6J小鼠，16～18周龄，取自山东大学。吸入异氟醚麻醉小鼠，然后通过椎体脱位杀死小鼠。在无菌条件下切除并清洁胸主动脉。从外膜分离培养基。外膜用培养基冲洗三次。然后将分离的外膜切成1-2mm2将其平放在0.1%涂有明胶的盘子上。新鲜培养基，由补充有10%胎牛血清的DMEM组成（FBS；GIBCO，纽约州格兰德岛），2 m米
我-将谷氨酰胺、50 UI/ml青霉素和50μg/ml链霉素（Sigma，Oakville，Ontario，Canada）添加到每个孔中。外植体在37℃的加湿培养箱中在95%空气-5%CO中培养2在空气中培养，直到AFs汇合，通常为7-12天。从第四天开始，每48小时取出培养基并用新鲜培养基替换。随后收集汇合细胞，用胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.02%）（西格玛）溶液传代。当第1代或第2代的细胞达到80%的融合时，将其冷冻并保持在-70℃，直到再次使用。
实验细胞分组
为了观察APN对AF增殖、迁移和向MF转化的影响，AFs被分为治疗组：AFs（未治疗）、AFs-APN、AFs-LPS、AFs-APN+LPS。在10μg/ml APN处理2h的实验中，AFs被分为治疗组：AFs（未处理）、AFs+sicontrol（无关siRNA）、AFs-APN、AFs-LPS、AFs-APN+LPS、AFs-APN+AdipoR1小干扰RNA（siAdipoR 1）+LPS，AFs-APN+compound C+LPS和AFs-APN/AMPK小干扰RNA+LPS组。在培养基中，APN、LPS、化合物C、sicontrol、siAdipoR1和siAMPK双工体的最终浓度分别为10μg/ml、10μg/ml和20μg/ml米、200 pmol/升、200 pmol/升和10μ米分别是。
siRNA的制备和转染
利用RNA干扰下调AFs中AdipoR1的表达。上海基因工程公司（中国）设计并合成了针对AdipoR1、β-actin和非特异性对照siRNA双链的SMARTpool siRNA和SMARTpool试剂。用于靶向沉默小鼠α1/α2 AMPK亚型（sc-45312）的小干扰RNA（siRNAs）序列由Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）提供。siRNA A（sc-37007）作为阴性对照，用于α1/α2 AMPK靶向siRNA转染的实验。对于基因敲除实验，将AF置于6厘米的培养皿中，并在含有10%FBS的DMEM中培养48小时。然后，在没有FBS和抗生素的培养基中培养24小时后，根据制造商的说明，使用转染试剂用特异性siRNA转染细胞。再培养48小时后，将细胞重新培养在含有10%FBS的DMEM中。
MTT分析
生长细胞密度调整为5×104细胞/ml。将细胞置于96周的培养皿中，在常规条件下培养24小时，然后将血清在0.5%DMEM中饥饿24小时，用试剂转染，并持续培养20小时。从微孔中丢弃上清液，然后分别向每个微孔中添加5 mg/ml MTT。细胞培养持续4h；添加150μl二甲基亚砜，将培养物搅拌10 min。用酶联免疫仪在490 nm处定量微孔中细胞的OD。
迁移分析
AFs在无FBS的DMEM中饥饿血清24小时，然后用胰蛋白酶-EDTA和3.0×104将细胞/ml接种到Transwell板（12-μm过滤孔，12mm直径，Costar）中。在Transwell室的基底外侧，添加含有2%FBS（阴性对照）或2%FBS和10μg/ml LPS的培养基。在37℃和5%CO下孵育4小时后2，将AF固定并用结晶紫罗兰染色。手动记录迁移到腔室基底外侧的细胞数量。
划伤试验
通过胰蛋白酶化收获的AF以5000个细胞/孔接种在12孔板中，并生长到汇合处。使用无菌200μl移液管尖端，在细胞单层的中心轻轻引入伤口。为了去除细胞碎片，用PBS清洗微孔两次，并分别用或不用siAdipoR1或化合物C培养细胞48小时和0.5小时。然后，在有或无APN孵育2小时后，用LPS孵育细胞24小时。在创面后立即和96小时结束时，使用倒置显微镜（Axiover；Carl Zeiss Meditec GmbH）获得沿创面标记区域的相控图像。
NO生成的测定
NO不稳定，但它形成稳定的最终产物，即亚硝酸盐和硝酸盐。因此，亚硝酸盐和硝酸盐含量是NO生成的合适指标。根据制造商的说明，采集AF培养基，并使用Griess试剂盒（一氧化氮检测试剂盒，中国上海Beyotime）测量亚硝酸盐水平。
ONOO的测量−
ONOO公司−-根据Kooy描述的方法估计二氢罗丹明123依赖性氧化为罗丹明23等。(35)将样品添加到含有6.25μ米二氢罗丹明123和125μ米二乙烯三胺五乙酸并在37℃下培养5分钟。在500 nm处测量吸光度，即罗丹明123的吸光度。
逆转录聚合酶链反应
在培养AFs刺激6小时后，使用Trizol（瑞士巴塞尔罗氏）和Moloney小鼠白血病病毒提取总RNA。通过定量实时PCR（qPCR）定量mRNA水平。iNOS的引物通过标准PCR反应化学设计，并添加荧光DNA结合染料SYBR Green I（瑞士巴塞尔罗氏）。使用具有预定义已知浓度的外标物的连续稀释来创建标准曲线。使用LightCycler 3.5（瑞士巴塞尔罗氏）对qPCR结果进行分析。未知样品浓度的测定涉及交叉点值的测定，交叉点值与初始模板浓度的对数成反比。对结果进行实时效率控制，并与内源性控制（β-actin）的结果进行标准化。
蛋白质印迹分析
处理后，AFs用冰镇PBS洗涤三次，然后在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中溶解，提取总蛋白并用Western blot分析检测(36). 细胞裂解液中的蛋白质浓度通过使用Bio-Rad DC蛋白质分析试剂盒（伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）进行测量。蛋白质（50μg）用10%聚丙烯酰胺凝胶处理，在120 V下分离2 h，用200 mA转移2 h。用5%牛奶在37 C下封闭膜60 min。蛋白质与一级抗体在4 C下培养过夜，二级抗体在室温下培养2 h。用TBS吐温洗涤（10分钟，三次）后，通过ECL Western印迹检测系统（Amersham Pharmacia，Deisenhofen，Germany）对膜进行检测。使用抗β-肌动蛋白多克隆抗体（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）通过Western blot分析标准化样本量。
免疫细胞化学
用间接免疫荧光染色法检测AFs中AdipoR1的表达和定位。在4%福尔马林缓冲液中培养的AF在4℃下固定30 min。用PBS连续洗涤并在PBS中用5%山羊血清封闭1 h后，将用于免疫荧光染色的相同脂肪R1一级抗体在PBS稀释并应用于载玻片，并在4℃孵育过夜。使用与荧光素异硫氰酸盐（FIFC）和DAPI结合的特定种类一级抗体的二级抗IgG抗体。用正常山羊IgG处理的AFs作为阴性对照。AFs的免疫荧光染色随后在荧光显微镜下进行检查（日本东京奥林巴斯）。
腺病毒载体与动物外科
如前所述，使用腺病毒表达载体试剂盒（TaKaRa，Kyoto，Japan）构建产生全长APN的腺病毒(37). 基于不同滴度的Ad-APN对ELISA法测定小鼠血清APN浓度的影响，我们使用的Ad-APN的最佳浓度为300倍感染。
男性ApoE−/−小鼠（10-12周龄；北京大学，中国北京）在恒温（24℃）下，在12小时的黑暗/12小时的光照循环下饲养，并接受高脂肪饮食（0.25%胆固醇和15%可可脂）12周。手术期间，在左颈总动脉上放置血管周围缩窄性硅胶环，可诱发颈动脉粥样硬化病变(12). 术后8周，将所有小鼠分为三组：Ad-APN组（n=30）、Ad-β-半乳糖组（n=30）和对照组（n=20）。分离左颈总动脉。仔细移除左侧颈总动脉上的硅胶环。在Ad-APN和Ad-βgal组中，分别将Ad-APN和Ad-αgal滴入小鼠颈总动脉的硅胶项圈部分。相反，生理盐水滴入对照小鼠的颈总动脉。该实验符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，1985年修订）。对小鼠实施安乐死，并切除颈动脉。
免疫组织化学
在10%福尔马林中固定过夜后，将嵌入最佳切割温度（OCT）复合物中的颈动脉冰冻横截面（3μm厚）安装在载玻片上。切片用兔iNOS和硝基酪氨酸抗体及IgG（阴性对照）进行免疫组织化学染色，以检测iNOS及硝基酪氨酸的存在，稀释度为1:100。山羊抗兔生物素（1:100，Sigma Diagnostics）用作二级抗体，ABC-辣根结合过氧化物酶用于可视化。
统计分析
结果显示为平均值±扫描电镜。比较结果由Student’st吨测试或单因素方差分析。A类P（P）<0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少重复三次。
APN（10μg/ml）对经LPS处理的AFs增殖、转化为MFs和迁移的影响。B、 细胞划伤96小时后AF沿伤口边缘迁移的代表性图形。C、 AF转化为MFs的免疫荧光染色。绿色FIFC染色；蓝色DAPI染色。D、 α-SM-肌动蛋白表达。β-微管蛋白带的表达作为负荷对照。APN、AFs与APN（10μg/ml）孵育24 h；LPS、AFs与LPS（10μg/ml）孵育24h；APN+LPS、AFs与APN（10μg/ml）孵育2h，LPS（10μ/ml）处理24h；con（对照组）、AF用PBS处理。**，P（P）< 0.01与。con；##，P（P）< 0.01与。液化石油气。
APN对培养液中LPS介导的AF iNOS mRNA和蛋白表达及NO生成的影响。A、 iNOS mRNA表达。B、 iNOS蛋白表达。β-肌动蛋白带的表达作为负荷控制。C、 培养基中NO的产生。**，P（P）< 0.01与。con；##，P（P）< 0.01与。液化石油气。数值为平均值±扫描电镜.con，控制组。
AdipoR1在正常AF和骨骼肌细胞中的表达及siAdipoR2的作用。A、 AdipoR1 mRNA表达水平归一化为β-actin mRNA表达。P（P）> 0.05与。骨骼肌细胞。B、 AdipoR1蛋白表达。β-微管蛋白带的表达作为负荷对照。P（P）> 0.05与。骨骼肌细胞。C、 用AdipoR1抗体对小鼠AF进行免疫荧光染色。阴性，阴性对照；绿色FIFC染色；蓝色DAPI染色。D、 siRNA仅抑制siAdipoR1，表明其敲除作用是特异性的，且siAdipo R1的敲除作用呈剂量依赖性增加。N、 无关siRNA转染；siβ-actin，转染β-acton的siRNA（100 p米)；siAdipoR1，以不同剂量转染AdipoR1的siRNA。**，P（P）< 0.01与。控制（续）。数值为平均值±扫描电镜.
AdipoR1和AMPK抑制剂化合物C的siRNA对APN减少iNOS和硝基酪氨酸表达以及NO和ONOO生成的影响−iNOS和硝基酪氨酸的表达。β-肌动蛋白的表达是一种负荷控制。B、 生产NO.C、生产ONOO−. **,P（P）< 0.01与。控制组（con）；##，P（P）< 0.01与。LPS；$，P（P）< 0.01与。APN+LPS。数值为平均值±扫描电镜.
APN、siAdipoR1和AMPK抑制剂化合物C对AMPK（p-AMPK）和ACC蛋白磷酸化（p-ACC）的影响。β-肌动蛋白的表达是一种负荷控制。**，P（P）< 0.01与。控制组（con）；##，P（P）< 0.01与。LPS；$，P（P）< 0.01与。APN+LPS。数值为平均值±扫描电镜.
AMPK siRNA对APN减少iNOS和硝基酪氨酸表达及NO和ONOO生成的影响−.A，iNOS的表达。B、 硝基酪氨酸的表达。C、 用siAMPK（10μm）治疗时AMPK的表达。D、 生产NO.E，生产ONOO−.**中，P（P）< 0.01与。控制组（con）；##，P（P）< 0.01与。LPS；$，P（P）< 0.01与。APN+LPS。数值为平均值±扫描电镜.
siAdipoR1、siAMPK和AMPK抑制剂化合物C对APN减少AFs增殖、迁移和转化的影响。B、 迁移分析结果。C、 α-SM-肌动蛋白的免疫荧光染色结果。LPS，用LPS（10μg/ml）处理细胞24小时；APN+LPS，APN（10μg/ml）预处理细胞2h，LPS（10μg/ml）预处理24h；siAdipoR1+APN+LPS，用siAdipo R1处理AFs，然后用APN（10μg/ml）处理2h，然后用LPS（10μg/ml）处理24h；siAMPK+APN+LPS，用siAMPK（10μm）处理细胞，然后用APN（10μg/ml）处理细胞2h，然后用LPS（10μg/ml）处理细胞24h；化合物C+APN+LPS，用化合物C（20μm）处理细胞30 min，然后用APN（10μg/ml）处理细胞2 h，然后用LPS（10μg/ml）处理细胞24 h，MTT分析结果。**，P（P）< 0.01与。控制组（con）；##，P（P）< 0.01与。LPS；$，P（P）< 0.01与。APN+LPS。数值为平均值±扫描电镜.
APN基因转染对ApoE中iNOS和硝基酪氨酸表达的影响−/−老鼠。A、 iNOS的表达。B、 硝基酪氨酸的表达。阴性，阴性对照；对照组；Ad-β-半乳糖组；Ad-APN组。阵列显示阳性细胞。
致谢
我们感谢王旭平、冯金波、蒋红、刘春喜和王荣博士的技术援助。
脚注
这项工作得到了国家基础研究计划（973计划，2006CB503803）、国家高技术技术与发展计划（863计划，2007AA02Z448）、国家自然科学基金（30728025）和山东省（1020）的支持。
X.-j.C.、L.C.和L.L.对本研究做出了同等贡献。
缩写：ACC，乙酰辅酶A羧化酶；AF，外膜成纤维细胞；AMPK，AMP-活化蛋白激酶；脂联素；载脂蛋白E−/−载脂蛋白E缺乏；DAPI，4,6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐；胎牛血清；iNOS诱导的NO合成酶；脂多糖；MF，肌成纤维细胞；MTT，甲基噻唑四氮唑；NO、一氧化氮；qPCR，定量实时PCR；si，小干扰；siAdipoR1，AdipoR2的siRNA；SM，平滑肌。
工具书类
1Muscoli C、Cuzzocrea S、Riley DP、Zweier JL、Thiemermann C、Wang ZQ、Salvemini D2003年。关于超氧化物歧化酶模拟物的选择性及其在药理学研究中的重要性。杂志 140:445–460[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Wilcox JN、Scott NA外膜在动脉炎和动脉粥样硬化中的潜在作用。国际心脏病杂志54（补充）：S21–S35[公共医学] 三。Piñeiro R、Iglesias MJ、Gallego R、Raghay K、Eiras S、Rubio J、Diéguez C、Gualillo O、González Juanatey JR、Lago F2005年。脂联素由人和小鼠心肌细胞合成和分泌。FEBS信函 579:5163–5169 [公共医学][谷歌学者] 4Tan KC、Xu A、Chow WS、Lam MC、Ai VH、Tam SC、Lam KS低脂联素血症与内皮依赖性血管舒张功能受损有关。临床内分泌与代谢杂志 89:765–769 [公共医学][谷歌学者] 5Zhang H、Du Y、Cohen RA、Chobanian AV、Brecher P1999.外膜是大鼠主动脉中诱导型一氧化氮合酶的来源。Am J高血压 12:467–475 [公共医学][谷歌学者] 6Kawai J、Ando K、Tojo A、Shimosawa T、Takahashi K、Onozato ML、Yamasaki M、Ogita T、Nakaoka T、Fujita T2004年。内源性肾上腺髓质素保护小鼠免受损伤的血管反应。循环 109：1147–1153[公共医学][谷歌学者] 7Maeda K、Okubo K、Shimomura I、Funahashi T、Matsuzawa Y、Matsubara K一种新型脂肪特异性胶原蛋白样因子apM1（脂肪最丰富基因转录本1）的cDNA克隆和表达。生物化学-生物物理研究委员会 221:286–289 [公共医学][谷歌学者] 8Kumada M、Kihara S、Sumitsuji S、Kawamoto T、Matsumoto S、Ouchi N、Arita Y、Okamoto Y、Shimomura I、Hiraoka H、Nakamura T、Funahashi T、Matsuzawa Y、大阪CAD研究小组2003.冠状动脉疾病。男性低脂联素血症与冠状动脉疾病的相关性。动脉硬化血栓血管生物 23:85–89 [公共医学][谷歌学者] 9Ouchi N、Kihara S、Arita Y、Maeda K、Kuriyama H、Okamoto Y、Hotta K、Nishida M、Takahashi M、Nakamura T、Yamashita S、Funahashi T、Matsuzawa Y内皮粘附分子的新型调节剂：脂肪酶衍生血浆蛋白脂联素。循环 100:2473–2476 [公共医学][谷歌学者] 10Okamoto Y、Kihara S、Ouchi N、Nishida M、Arita Y、Kumada M、Ohashi K、Sakai N、Shimomura I、Kobayashi H、Terasaka N、Inaba T、Funahashi T、Matsuzawa Y脂联素减少载脂蛋白E缺乏小鼠的动脉粥样硬化。循环 106:2767–2770 [公共医学][谷歌学者] 11Pischon T、Girman CJ、Hotamisligil GS、Rifai N、Hu FB、Rimm EB男性血浆脂联素水平与心肌梗死风险。日本汽车制造商协会 291:1730–1737 [公共医学][谷歌学者] 12Li CJ、Sun HW、Zhu FL、Chen L、Rong YY、Zhang Y、Zharg M2007.局部脂联素治疗可降低家兔动脉粥样硬化斑块的大小。内分泌杂志 193:137–145 [公共医学][谷歌学者] 13欧文斯GK血管平滑肌细胞的调节和分化。生理学评论 75:487–517 [公共医学][谷歌学者] 14Stenmark KR，Mecham RP公司肺血管重塑的细胞和分子机制。生理学年度回顾 59:89–144 [公共医学][谷歌学者] 15亨格福德JE，小CD血管平滑肌细胞的发育生物学：构建多层血管壁。血管研究杂志 36:2–27 [公共医学][谷歌学者] 16Sartore S、Franch R、Roelofs M、Chiavegato A平滑肌的分子和细胞表型及其调控。生理生化药理学评论 134:235–320 [公共医学][谷歌学者] 17Wilcox JN、Scott NA外膜在动脉炎和动脉粥样硬化中的潜在作用。国际心脏病杂志54（补充）：S21–S35[公共医学] 18Zalewski A、Shi Y血管肌成纤维细胞：从冠状动脉修复和重塑中吸取的教训。动脉硬化血栓血管生物 17:41 [公共医学][谷歌学者] 19Faggin E、Puato M、Zardo L、Franch R、Millino C、Sarinella F、Pauletto P、Sartore、Chiavegato A1999.平滑肌特异性SM22蛋白在气球损伤的兔颈动脉外膜细胞中表达。动脉硬化血栓血管生物 19:1393–1404 [公共医学][谷歌学者] 20Li G、Chen SJ、Oparil S、Chen YF、Thompson JA2000.直接体内证据表明大鼠颈动脉球囊损伤后外膜成纤维细胞新生内膜迁移。循环 101：1362–1365[公共医学][谷歌学者] 21古特曼DD1999.血管外膜依赖性对血管功能的影响。美国生理学杂志277:H1265–H1272[公共医学] 22SzabóC，道森VL聚ADP-核糖合成酶在炎症和缺血再灌注中的作用。药物科学趋势 19:287–298 [公共医学][谷歌学者] 23Willy C、Dahouk S、Starck C、Kaffenberger W、Gerngross H、Plappert UG2000.缺血/再灌注损伤后人类白细胞的DNA损伤。自由基生物医学 28:1–12 [公共医学][谷歌学者] 24Cromheeke KM、Kockx MM、De Meyer GR、Bosmans JM、Bult H、Beelaerts WJ、Vrints CJ、Herman AG1999.诱导型一氧化氮合酶与人类动脉粥样硬化斑块中的脂质氧化/过氧化迹象共存。心血管研究 43:744–754 [公共医学][谷歌学者] 25Behr-Roussel D、Rupin A、Simonet S、Bonhome E、Coumailleau S、Cordi A、Serkiz B、Fabiani JN、Verbeuren T2000.诱导型一氧化氮合酶抑制剂的慢性治疗效果N个-亚氨基乙基左旋赖氨酸或与左旋精氨酸合用对高胆固醇血症兔冠状动脉粥样硬化和主动脉粥样硬化进展的影响。循环 102:1033–1038 [公共医学][谷歌学者] 26佩雷奥·M，马雷特·A2001.定向破坏诱导型一氧化氮合酶可保护肌肉免受肥胖相关胰岛素抵抗。自然·医学 7:1138–1143 [公共医学][谷歌学者] 27Shimabukuro M、Ohneda M、Lee Y、Unger RH一氧化氮在肥胖诱导的β细胞疾病中的作用。临床研究杂志 100:290–295[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Ouedraogo R、Wu X、Xu SQ、Fuchsel L、Motoshima H、Mahadev K、Hough K、Scalia R、Goldstein BJ2006.脂联素抑制血管内皮细胞中高葡萄糖诱导的活性氧物种：cAMP信号通路参与的证据。糖尿病 55:1840–1846 [公共医学][谷歌学者] 29Ouchi N、Kobayashi H、Kihara S、Kumada M、Sato K、Inoue T、Funahashi T、Walsh K脂联素通过促进内皮细胞中AMP活化蛋白激酶和Akt信号之间的相互作用来刺激血管生成。生物化学杂志 279：1304–1309[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Wu X、Mahadev K、Fuchsel L、Ouedraogo R、Xu SQ、Goldstein BJ脂联素抑制肿瘤坏死因子-α或内皮细胞高糖诱导的IκB激酶激活：cAMP和AMP激酶信号的作用。美国生理内分泌代谢杂志293:E1836–E1844[公共医学] 31Kuo CL、Ho FM、Chang MY、Prakash E、Lin WW2008年2月15日，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷对脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2基因表达的抑制独立于AMP活化的蛋白激酶。J细胞生物化学 103:931–940 [公共医学][谷歌学者] 32Pilon G、Dallaire P、Marette A2004.AMP活化蛋白激酶激活剂对诱导型一氧化氮合酶的抑制：胰岛素增敏药物的新作用机制。生物化学杂志 279:20767–20774 [公共医学][谷歌学者] 33Sharma K、Ramachandrarao S、Qiu G、Usui HK、Zhu Y、Dunn SR、Ouedraogo R、Hough K、McCue P、Chan L、Falkner B、Goldstein BJ2008。脂联素调节小鼠的蛋白尿和足细胞功能。临床研究杂志 118:1645–1656[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Tao L、Gao E、Jiao X、Yuan Y、Li S、Christopher TA、Lopez BL、Koch W、Chan L、Goldstein BJ、Ma XL2007.心肌缺血/再灌注后脂联素的心脏保护包括减少氧化/硝化应激。循环 115:1408–1416 [公共医学][谷歌学者] 35Kooy NW、Royall JA、Ischiropoulos H、Beckman JS二氢罗丹明123的过氧亚硝酸盐介导氧化。游离放射性生物医药 16:149–156 [公共医学][谷歌学者] 36Khalil N、Xu YD、O’Connor R、Duronio V肺间质成纤维细胞的增殖是通过转化生长因子-β1诱导细胞外成纤维细胞生长因子-2的释放以及p38MAPK和JNK的磷酸化介导的。生物化学杂志 280:43000–43009 [公共医学][谷歌学者] 37前田N、下村一世、岸田K、西泽H、松田M、长垣H、芙蓉N、近藤H、高桥M、有田Y、高村R、大池N、原原慎S、Tochino Y、Okutomi K、Horie M、武田S、Aoyama T、Funahashi T、松泽Y2002.缺乏脂联素/ACRP30的小鼠的饮食诱导胰岛素抵抗。自然·医学 8:731–737 [公共医学][谷歌学者] 
