美国国家科学院院刊。2017年5月2日；114（18）：E3709–E3718。
以长篇论文形式
成人肠道神经系统的健康是由神经元凋亡和神经发生之间的动态平衡维持的
,一 ,b条 ,一 ,c（c） ,d日 ,一 ,一 ,一 ,一 ,一 ,e中，（f） ,克 ,小时，我 ,j、，k的情况下，我，米 ,小时，我 ,j、，k的情况下，我，米 ,n个 ,j、，o（o） ,第页 ,q个 ,c（c）和a、，1
Subhash Kulkarni公司
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
玛丽亚·阿德莱德·米奇
b条德克萨斯大学医学分院麻醉学系，德克萨斯州加尔维斯顿，77555；
詹娜·莱斯尔
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
Changsik Shin公司
c（c）宾夕法尼亚州立大学医学院微生物学和免疫学系，宾夕法尼亚州赫尔希，17033；
雅园福
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
刘连胜
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
钱丽
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
莫纳利·萨哈
一约翰斯·霍普金斯大学医学院医学系神经胃肠病中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
李翠萍
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
格里戈里·埃尼科洛波夫
e（电子）纽约州冷泉港冷泉港实验室，11724；
（f）发育遗传学中心，麻醉系，石溪大学，石溪，纽约州，11794；
拉伦·贝克尔
克斯坦福大学医学院消化科，加利福尼亚州斯坦福，94305；
尼古拉·拉赫林
小时北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系，27708；
我康奈尔大学电气与计算机工程学院，纽约州伊萨卡，14853；
米歇尔·安德尔森
j个所罗门·H·斯奈德，约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
k个约翰霍普金斯大学医学院神经外科，马里兰州巴尔的摩，21205；
我约翰霍普金斯大学医学院感觉生物学中心皮肤科，马里兰州巴尔的摩，21205；
米霍华德·休斯医学院，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，21205；
西岭沈
小时北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系，27708；
我康奈尔大学电气与计算机工程学院，纽约州伊萨卡，14853；
董新忠
j个所罗门·H·斯奈德，约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
k个约翰霍普金斯大学医学院神经外科，马里兰州巴尔的摩，21205；
我约翰霍普金斯大学医学院感觉生物学中心皮肤科，马里兰州巴尔的摩，21205；
米霍华德·休斯医学院，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，21205；
曼尼什·J·巴特
n个加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院儿科，90095；
宋红军
j个所罗门·H·斯奈德，约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
o（o）约翰霍普金斯大学医学院神经病学系细胞工程研究所，马里兰州巴尔的摩，21205；
E.米歇尔·索思密斯
第页田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心遗传医学部，37232；
拉杰·卡普尔
q个西雅图儿童医院实验室部，西雅图，华盛顿州，98105
米莲娜·博古诺维奇
c（c）宾夕法尼亚州立大学医学院微生物学和免疫学系，宾夕法尼亚州赫尔希，17033；
潘卡杰·J·帕斯里察
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
一约翰霍普金斯大学医学院内科神经胃肠病学中心，马里兰州巴尔的摩，21205；
b条德克萨斯大学医学分院麻醉学系，德克萨斯州加尔维斯顿，77555；
c（c）宾夕法尼亚州立大学医学院微生物与免疫学系，宾夕法尼亚州赫尔希，17033；
d日国立清华大学，台湾新竹300；
e（电子）纽约州冷泉港冷泉港实验室，11724；
（f）发育遗传学中心，麻醉系，石溪大学，石溪，纽约州，11794；
克斯坦福大学医学院消化科，加利福尼亚州斯坦福，94305；
小时北卡罗来纳州达勒姆杜克大学生物医学工程系，27708；
我康奈尔大学电气与计算机工程学院，纽约州伊萨卡，14853；
j个所罗门·H·斯奈德，约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，马里兰州巴尔的摩，21205；
k个约翰霍普金斯大学医学院神经外科，马里兰州巴尔的摩，21205；
我约翰霍普金斯大学医学院感觉生物学中心皮肤科，马里兰州巴尔的摩，21205；
米霍华德·休斯医学院，约翰霍普金斯大学医学院，马里兰州巴尔的摩，21205；
n个加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院儿科，加利福尼亚州洛杉矶，90095；
o（o）约翰霍普金斯大学医学院神经病学系细胞工程研究所，马里兰州巴尔的摩，21205；
第页田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心遗传医学部，37232；
q个西雅图儿童医院实验室部，西雅图，华盛顿州，98105
由马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院Solomon H.Snyder编辑，2017年3月24日批准（2016年11月28日收到供审查）
作者贡献：S.K.、M.-A.M.、H.S.、M.B.和P.J.P.设计的研究；S.K.、J.L.、C.S.、S.-C.T.、Y.-Y.F.、L.L.、Q.L.、M.S.、C.L.、L.B.、N.R.、M.A.、M.B.和P.J.P.进行了研究；S.K.、C.S.、S.-C.T.、M.S.、G.E.、N.R.、M.A.、X.S.、X.D.、M.J.B.、E.M.S.-S和P.J.P.贡献了新的试剂/分析工具；S.K.、M.-A.M.、J.L.、C.S.、R.P.K.、M.B.和P.J.P.分析数据；S.K.、M.-A.M.和P.J.P.撰写了这篇论文。
肠神经系统（ENS）控制或调节重要的胃肠功能，包括运动、分泌、局部免疫和炎症，是脑外最大的自主神经元集合(1). 涉及ENS的疾病是全世界常见的健康负担的主要原因(2). 尽管ENS经常受到机械应力的影响(三)以及灯具内容物的潜在环境威胁(4)，目前尚不清楚健康成人小肠中肠神经元的数量在成人生活的大部分时间里是如何保持显著不变的(5). 虽然肠道内新神经元的持续生成似乎需要抵消观察到的凋亡介导的神经元丢失(6)，这种神经发生非常难以证明，成人体内肠神经发生仍存在很大争议(7–10). 该领域的第二个相关难题是无法自信地确定肠道中是否存在真正的肠道神经前体细胞（ENPC），尽管使用多种标记物在体外充分证明了胚胎和成人肠道分离的细胞的干细胞样行为（自我更新和多能性）(7–9,11–23). 在这项研究中，我们成功地鉴定了ENPC，该ENPC能够在体内快速神经发生，以跟上我们所显示的成人小肠中持续神经元凋亡的高比率，从而解决了这些争议。此外，这些前体细胞的不受抑制的增殖会导致类似于人类神经节细胞增多症的肠道表型，这是一种在患者中出现的肠道运动障碍(24). 我们的结果表明，小肠中成年神经元的周转速度显著，为理解健康和疾病中的ENS提供了独特的范例。
结果
健康成人肠道中的ENS出现显著的神经元丢失。
我们确定了健康成人的肠道神经元是否正在以显著的速度死亡，从而确定了通过神经发生来替代的必要性。首先，我们用一种裂解的caspase-3特异性抗体对成年小鼠肌间神经节进行染色，该抗体以前被证明可以标记来自中枢和ENS的注定要凋亡的神经元(25,26). 我们发现裂解半胱天冬酶-3百分比的显著数字（平均值±SE+每个神经节的神经元数=11.49±0.50，计算出的神经节总数=48，来自3只成年小鼠）肌间神经细胞表达酶裂解的caspase-3(). 最近，一份独立出版物证实，通过这种方法在年轻成人肌间神经丛中存在显著水平的凋亡神经元(27). 然后使用荧光标记的caspase-3/7底物获得caspase-3酶活性的生化证据() (28)同时用碘化丙啶（PI）在体内标记肌间神经细胞，这表明细胞正在死亡(和) (29–31).
成人肌间神经细胞经历凋亡介导的细胞死亡。(A类,我)肌间神经节内表达凋亡标记的细胞裂解caspase-3（红色）(ii（ii）)也表达HuC/D（绿色）代表凋亡神经元（黄色箭头），而其他肌间神经细胞不表达裂解caspase-3（蓝色箭头）。Nuclei标有DAPI（蓝色）。(B类)ChAT-cre：YFP成年小鼠肌间神经节内用PI（红色）标记的活体细胞核，胆碱能神经元用YFP（黄色）标记，代表细胞膜漏出的神经元，指示凋亡细胞（深蓝色箭头）。(C)成年C57BL/6小鼠的肌间神经节图像，凋亡细胞被标记为(我)CellEvent caspase-3/7检测染料（红色），然后用(ii（ii）)HuC/D（绿色）显示存在阳性的肌间神经元群体（红色箭头），以及凋亡标记物阴性的肌间神经元群体（绿色箭头）。(三)DAPI标记的细胞核（浅灰色）。（比例尺，10µm）
成年肌间神经细胞群经历神经元丢失，并被肌层巨噬细胞主动吞噬。(A类)的正交截面z（z）-ChAT-cre：YFP成年小鼠的肌间神经节堆叠图像，其中YFP（黄色）由肌间胆碱能神经元表达，因此，标记了在杀死前在体内给予PI的肌间神经节，并显示了YFP的存在+带PI染色细胞核的成年肌间神经元（黄色）（红色；XY平面上的白色箭头和YZ平面上的红色箭头）。(B类)组织固定后ChAT-cre：YFP动物的肌间神经丛层图像（体内用PI标记如上）（这导致YFP信号丢失，同时PI染色强度预期显著降低）(31)，并用泛神经标记物HuC/D抗血清染色，显示(我,ii（ii）)两个HuC/D标记的神经元（绿色），其中一个神经元的细胞核标记有PI（红色；白色箭头），另一个则没有PI（绿色箭头）。(三)细胞核后染色也用DAPI（蓝色）进行复染。(iv（四）)合并图像，显示标记为PI（白色箭头）的单元格和未标记PI的单元格中HuC/D（绿色）和DAPI（蓝色）的共定位（绿色箭头）。（比例尺，10µm）(C,我)ChAT-cre：td番茄小鼠结肠肌间神经丛的双光子显微镜显示，td番茄表达（红色）胆碱能神经元以及MHC-II标记的肌层巨噬细胞（绿色）显示，大量巨噬细胞与肌间神经网相关。（比例尺，50μm）插入来自(我)放大并显示(ii（ii）)在MHC-II标记的巨噬细胞（绿色；青色箭头）中吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）。(三和iv（四）)MHC-II染色（绿色）和ChAT-cre:td番茄荧光分别位于不同面板中。(天,我)小肠肌间神经节内神经元共焦显微镜图像z叠加的2D投影图像显示ChAT-cre：tdTomato（红色）信号与CD11b染色的（绿色）肌层巨噬细胞信号的共定位。插入(我)在进一步的面板和显示中被放大(ii（ii）)CD11b染色的巨噬细胞吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）（绿色；青色箭头），表明巨噬细胞吞噬了肌间神经细胞。(三和iv（四）)CD11b染色（绿色）和ChAT:tdTomato（红色）荧光分别显示在单独的面板中。（比例尺，10μm）(E类)DAPI流式细胞术−CD45型−WT（对照）和ChAT-cre:tdTomato小鼠LM-MP层的细胞显示在ChAT-cre：tdTomato-小鼠的非造血细胞中存在强烈的神经相关tdTomata信号(左侧)，被大量DAPI占用−CD45型+CD11c公司+CD11b型+MHCII公司你好与肌间神经丛相关的肌层巨噬细胞(居中)，但不与DAPI一起使用−CD45型+CD11c公司你好CD11b型+MHCII公司你好与大量肠神经元无关的粘膜和粘膜下巨噬细胞(赖特). (F类)与WT对照组相比，含有td番茄红素内含物的小肠（SB）和大肠（LB）巨噬细胞百分比的平均值±SE，表明神经碎片在肠道长度上的强烈吞噬作用相似。
使用一氧化氮合酶1（NOS1）creER进一步证明了成人肠神经元寿命有限T2段我们之前报道过的老鼠(32). 这只小鼠是由一只含有漂浮tdTomato基因的小鼠和产生的NOS1-creER培育而成的T2段：td番茄子代在成年时服用三苯氧胺（连续4天）。在诱导后立即处死的小鼠（第0天）中，几乎所有表达NOS1的神经元都标记有tdTomato表达(). 然而，在接受三苯氧胺治疗7天后被处死的小鼠中，我们观察到一群NOS1表达神经元的出现，这些神经元没有标记tdTomato()表明这些表达NOS1的神经元是新生的。观察到td番茄标记的氮能（NOS1）的损失+)使用我们先前描述的体内成像技术对神经元进行了证实(32). 对活NOS1-creER的同一肌间区进行成像T2段：td与之前一样用三苯氧胺诱导的番茄小鼠，我们观察到标记神经元在24小时内丢失，伴随着神经网络的强大重塑(). 然而，即使在7天的过程中观察到氮能神经元的丢失，肌间神经节内的神经元总数仍然保持不变()（平均数±HuC/D的SE+每个肌间神经节的神经元数：第0天和第7天分别为20.52±1.58和19.33±2.36）。另一方面，在第7天，近三分之一（～31%）标记有tdTomato的先前存在的NOS1神经元丢失()（tdTomato的平均数±SE+第7天，每个肌间神经节的神经元减少了～31%：3.70±0.38；与第0天的小鼠相比：5.31±0.42，P（P）= 0.003).
细胞凋亡导致的肌间神经细胞丢失可以量化，并且可以使用抗凋亡药物来阻止。(A类和B类)成人NOS1-creER的肌间神经节图像T2段：td停止三苯氧胺诱导后第二天处死的番茄小鼠（第0天），并用NOS1抗血清染色（绿色）(A类)另一例在他莫昔芬诱导停止7天后死亡(B类). 第0天(A类)，所有表达NOS1的神经元都表达tdTomato（黄色箭头），而在第7天(B类)，一群不表达tdTomato的NOS1表达神经元出现（蓝色箭头）。细胞核标记在B类带DAPI（蓝色）。（比例尺，10µm）(C)活体动物双光子显微镜捕获的3D图像的二维投影[(我)时间0和(ii（ii）)时间24h]从NOS1-creER肌间神经丛的同一区域T2段：td成像前用三苯氧胺诱导的番茄小鼠显示td番茄消失+24小时内的氮能神经元（绿色箭头）。图像还显示（白色箭头）tdTomato新突起的出现+神经元在24h内迅速延伸形成新的网络连接，显示了肌间神经节神经元网络的强大可塑性。（比例尺，10µm）(天和E类)用抗HuC/D抗血清（绿色）和抗裂解caspase-3抗体（红色）染色的肌间神经节代表性图像显示，在给予泛酶抑制剂zVAD-FMK的小鼠中，裂解caspase-3免疫反应缺乏(E类)，而未服用该药物的小鼠显示存在裂解的caspase-3标记的肌间神经细胞（黄色箭头E类). （比例尺，10µm）(F类)td番茄数量的量化+在第7天被杀的三组不同小鼠的肌间神经节内的HuC/D表达神经元显示显著减少(*P（P）<0.05）在td番茄数量上+与第0天或给予zVAD-FMK的小鼠相比，不含zVAD-FMK的鼠每节神经元数。数据还显示，HuC/D的总数+肌间神经节内的神经元在第0天至第7天之间保持保守（没有zVAD-FMK），尽管tdTomato的数量+神经元萎缩。此外，zVAD-FMK给药引起的细胞凋亡减弱导致每个神经节肌间神经细胞总数显著增加(#P（P）<0.05）。
确定是否观察到成熟番茄的损失+神经元是因为凋亡，我们在另一组NOS1-creER中重复了上述实验T2段：td番茄小鼠，这次用泛酶抑制剂zVAD-FMK治疗7天，它抑制了成年肌间神经节内裂解caspase-3的形成(). 此外，在NOS1-creER中T2段：td和以前一样，用三苯氧胺诱导的番茄小鼠，这种治疗显著减弱了之前所观察到的td番茄标记的氮能神经元的丢失()（tdTomato的平均数±SE+三苯氧胺（tamoxifen）后第7天，泛酸蛋白酶抑制剂处理小鼠的肌间神经节神经元数：5.20±0.50）。正如预测的那样，这种氮能神经元死亡的停滞也导致了全球神经元数量的显著增加（根据HuC/D测量+表达式）()（平均数±HuC/D的SE+神经节中的神经元：分别在服用和不服用zVAD-FMK的他莫昔芬后第7天为31.39±1.57和19.33±2.36；P（P）= 0.004).
健康肠道中的肌细胞巨噬细胞持续吞噬肠神经细胞。
我们询问了这种高神经元死亡率导致的死亡神经元或神经元碎片是如何从肌间神经节清除的。如此高的神经元死亡率需要一种同样有效的吞噬细胞清除方法。肠巨噬细胞的一个特殊亚群，称为肌层巨噬细胞，在解剖和功能上与肌间神经丛有关(33,34). 因为巨噬细胞不表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）基因(35,36)由大量肌间神经细胞表达(35)，我们使用ChAT cre:tdTtomato小鼠观察巨噬细胞对肌间神经元的吞噬作用。当用巨噬细胞抗体染色对这些小鼠的肌间神经丛进行成像时，我们观察到表达td番茄红素的胆碱能神经元的胞体被小肠和结肠的肌层巨噬细胞吞噬(,、和电影S1). 虽然我们能够通过显微镜观察到这些巨噬细胞吞噬神经元，但我们也使用流式细胞术研究了肠巨噬细胞中tdTomato内含物的存在，并发现尽管粘膜和粘膜下巨噬细胞与肠神经元关系不大(33)显示含有tdTomato的巨噬细胞数量很少，小肠和大肠中有大量（～7.5%）肌间神经丛相关肌层巨噬细胞含有tdTomaso，进一步支持了我们的成像数据(). 综合这些数据，我们观察到ENS相关肌层巨噬细胞参与死亡神经元的吞噬作用和神经元碎片的主动清除，这一过程在小肠和大肠中都很常见。
肌肉巨噬细胞吞噬健康肠道中的肌间神经细胞。(A类,我)ChAT cre结肠肌间丛的双光子显微镜检查：tdTomato小鼠显示tdTomato表达（红色）胆碱能神经元以及MHC II类标记的肌层巨噬细胞（绿色）显示大量与肌间丛相关的巨噬细胞。插入(我)放大并显示(ii（ii）)在MHC II标记的巨噬细胞（绿色；青色箭头）中吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）。（比例尺，50µm）(B类,我)的二维投影图像z（z）-小肠肌间神经节内神经元的共焦显微镜图像堆栈显示ChAT-cre：tdTomato（红色）信号与CD11b染色的（绿色）肌层巨噬细胞信号共定位。插入(我)放大并显示(ii（ii）)CD11b染色的巨噬细胞吞噬td番茄表达的神经元胞体（红色）（绿色；青色箭头），表明巨噬细胞吞噬了肌间神经细胞。（比例尺，10µm）
Nestin Marks假定ENPC。
综上所述，尽管存在大量持续的神经元丢失，但上述关于神经元总数保持的结果提供了健康组织中神经元显著更替的有力证据，从而表明ENPC的活跃池。接下来，我们使用细胞骨架蛋白Nestin鉴定了这些细胞(37)由多种神经干细胞表达(38–42). td番茄+三苯氧胺诱导的巢蛋白乳剂小肠纵肌间神经丛（LM-MP）层衍生的神经球T2段：td番茄小鼠（其中td番茄在肌间神经丛中的表达与Nestin的表达相关，)体外分化为神经元并表达神经元NOS1，这是一种由抑制性肠神经元表达的酶(). 此外，这些td番茄的细胞+将神经球移植到成年小鼠的细胞壁中，成功植入并分化为宿主小鼠肌间神经节中HuC/D标记的神经元(和).
Nestin标记成人肠壁中可能存在的肠神经前体细胞。(A类)体外培养的Nestin-creER神经球衍生神经元T2段：td番茄鼠标(我)被NOS1（绿色）和(ii（ii）)在Nestin-creER下快递tdTomato（红色）T2段诱导(三)显示共定位，证明表达Nestin的细胞在培养基中生成神经球，可分化为氮能神经元；(iv（四）)细胞核用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，10µm）(B类)Nestin-creER所在成年小鼠的肌间神经节T2段：td将番茄衍生的神经球衍生细胞移植到(我)td番茄+移植物来源的细胞（红色；白色箭头）(ii（ii）)形成表达HuC/D（洋红色；白色箭头）的成熟神经元，表明移植物衍生细胞产生神经元。可以注意到其他tdTomato表达式（红色箭头），它没有显示相应的HuC/D同位化。HuC/D和tdTomato通道在.细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10µm）
(A类)Nestin creER肌间神经节的图像T2段：td给予克隆剂量他莫昔芬并在他莫昔酚诱导后12小时死亡的番茄小鼠显示(我)一个td番茄+肌间神经节中的细胞（红色、黄色箭头）(ii（ii）)通过免疫染色（灰色、黄色箭头）也可将巢蛋白染色为阳性，从而验证三苯氧胺诱导后td番茄表达细胞为巢蛋白表达细胞。户口C/D+（绿色）神经元不表达tdTomato（红色）。细胞核用DAPI染色呈阳性（蓝色）。（比例尺，10µm）(B类)用巢蛋白抗体标记并与Alexa 647抗体共染的Nestin-GFP转基因报告小鼠LM-MP层中巢蛋白-GFP表达和非表达细胞的FACS分析表明，巢蛋白免疫反应仅在Nestin-GFP中发现+细胞，而不在Nestin-GFP中−细胞，从而验证在成体LM-MP层中，Nestin-GFP+细胞是表达Nestin的细胞。
(A类,我)HuC/D免疫染色（品红色，黄色箭头）(ii（ii）)tdTomto公司+移植Nestin-cre:td番茄的WT动物的细胞（红色、黄色箭头）+单元格(三)细胞核标记有DAPI（蓝色），表明一些巢蛋白衍生细胞在移植后分化为神经元，而其他td番茄+细胞（红色箭头）不表达HuC/D，因此不能分化为神经元。（比例尺，10µm）(B类)优化组织变性，以便使用来自WT小鼠回肠的LM-MP组织对卤化核苷酸（CldU和IdU）进行有效的免疫染色，该组织用CldU给药7天并立即处死。图像(i–iii)在用2 N HCl在50°C下变性5、10和15分钟的组织上显示CldU和HuC/D免疫染色。虽然5分钟变性后未显示任何标记阳性细胞，但很少有标记阳性神经节外细胞（红色箭头），但10分钟变性后无神经元标记。然而，变性15分钟后，可以标记神经节外（红色箭头）和神经节内的标记细胞，其中一些是HuC/D表达神经元（黄色箭头）。（比例尺，10μm）(C)与我们的上述观察结果相比，未接触CldU的动物组织中，使用对CldU反应的抗体，在50°C下用2N HCl进行类似变性后，未显示假阳性免疫染色细胞的存在(我) 5, (ii（ii）)10，和(三)15分钟（比例尺，10μm）(天,我,ii（ii）,三)用HuC/D（灰色）染色的肌间神经节被定义为一组凝聚力不间断的神经元，其界限如这三张显微照片所示。这些神经节的神经元被计数并用于量化。神经节外的一两个神经元没有被列举出来，因为它们被认为是神经节外的。
ENPC在成人肠道的解剖位置。
在证明Nestin是ENPC的合适标记物之后，我们使用我们的一个实验室之前描述过的Nestin-GFP转基因报告小鼠，继续确定假定ENPC在体内的位置(39). 使用前面描述的技术进行肠道组织的光学澄清辅助显微镜检查(43)、雀巢GFP+这些小鼠的细胞形成了广泛的细胞网络(和电影S2)横跨整个小肠壁的大部分。它们在粘膜下层和肌肉层特别突出，但在上皮衬里中不存在。虽然，这个网络的大部分本质上是血管周围的()，肌间神经丛中有少量细胞(和电影S2和第3章). 因为肠神经细胞及其前体来源于神经嵴(44,45)，我们使用三重转基因小鼠（Wnt1-cre:tdTomato）-（Nestin-GFP）建立Nestin-GFP的来源+细胞。血管周围巢蛋白-GFP+细胞未标记tdTomato(; 未融合图像)，因此不符合神经峰衍生前体的资格。相反，它们表达NG2()，来源于浆膜间皮的肠周细胞的特征性标志物(46). 相比之下，Nestin-GFP+肌间神经丛中的细胞被Wnt1-cre:tdTomato标记，表明其来源于神经嵴。神经节内Nestin-GFP+细胞不表达泛神经标记物PGP9.5()而是围绕着神经元细胞体(和电影S3). 然而，它们表达低亲和力神经生长因子受体p75NTR(; 未融合图像)，CD49b(; 未融合图像)和胶质标记物S100β()它们都是已知的标记细胞，在体外产生肠神经元和神经胶质或神经球(7,8,13). 相反，血管周围Nestin-GFP+细胞不表达p75NTR。最后，Nestin+细胞在稳定状态下表达有丝分裂标记Ki67(; 未融合图像)（Nestin-GFP的肌间神经节平均±SE数+Ki67共存的细胞：0.44±0.14），表明这些细胞正在积极增殖。
肠壁中增殖性神经嵴衍生的假定肠神经前体细胞的分布。(A类)Nestin-GFP报告小鼠肠道壁的3D投影图像，血管用DiD（青色）灌注，细胞核用PI（浅灰色）复染，显示表达Nestin-GFP（绿色）的细胞形成广泛的网络，存在于肠道的许多层，从纵向和平滑肌层（分别标记为LM和SM）到粘膜（标记为M）。(B类)Nestin-GFP细胞网络在成人回肠肠壁内的三维投影，无血管和核染色（纵向和平滑肌层分别标记为LM和SM，粘膜标记为M）。白色箭头A类和B类两者都指向肌间神经节的位置。图像A类和B类使用10倍物镜拍摄。(C)来自Wnt1-cre:td含有Nestin-GFP转基因的番茄小鼠的肌间神经丛的图像显示，只有肌间神经节中表达Nestin-GFP的细胞（红色箭头），而不是血管周围细胞（绿色箭头），是神经嵴来源。(天)神经节内巢蛋白-GFP+在血管系统被DiD（红色）标记的小鼠中，细胞（绿色、绿色箭头）不表达泛神经标记物PGP9.5（洋红色、黄色箭头），这表明神经节内Nestin-GFP的表达没有标记神经元。(E类)只有Nestin-GFP的一个亚群+肌间神经节内而非血管外周的细胞（绿色细胞）表达低亲和力神经生长因子受体p75NTR（品红色），此处用黄色箭头标记一些双阳性细胞。肌间神经节内一些表达p75NTR的细胞不表达Nestin-GFP（*），而其他一些细胞既不表达Nessin-GFP也不表达p75NT（#）。(F类)类似地，神经节内Nestin-GFP群体+细胞（绿色细胞）表达CD49b（品红色），此处用黄色箭头标记一些双阳性细胞。(G公司,我)Nestin-GFP转基因报告小鼠回肠的肌间神经节中，Nestin-表达细胞表达GFP（绿色），显示Ki67+也表达Nestin-GFP的细胞（红色；黄色箭头）；(ii（ii）)细胞核的DAPI（蓝色）标记显示Ki67+与其他细胞相比，巢蛋白GFP细胞（黄色箭头）显示出不同的染色图谱。（比例尺英寸C–G类，10微米）
神经节内表达Nestin的细胞是神经嵴衍生的细胞，可同时表达p75NTR和CD49b，并与一些表达胶质标记的细胞一起增殖生成神经元。的代表性图像(A类)Nestin-GFP X Wnt1-cre:td番茄小鼠的肌间神经节(我)Nestin-GFP–（绿色）表达和(ii（ii）)Wnt1-cre:td番茄–（红色）表达细胞，其中神经节内Nestin-GFP+单元格（黄色箭头）也是tdTomato+表明它们来源于神经嵴，而血管周围的Nestin-GFP+（蓝色箭头）单元格不是。（比例尺，50µm）(B类)一只成年Nestin-GFP转基因报告鼠的肌间神经丛层投影图像，其血管系统已被DiD（青色）标记，其中(我)只有血管系统中作为周细胞出现的巢蛋白表达细胞（红色箭头），而不是神经节内表达巢蛋白的细胞（绿色箭头）(ii（ii）)当用周细胞标记物NG2特异性抗血清染色时，标记为（红色）。（比例尺，10µm）(C)用CD49b抗体免疫染色的Nestin-GFP小鼠的肌间神经节，其中(我)神经节内（红色箭头）而非血管周围（绿色箭头）Nestin-GFP的人群+（绿色）单元格(ii（ii）)表达CD49b（洋红色）(三)细胞核用DAPI（浅灰色）染色。(iv（四）)合并图像显示GFP、CD49b和DAPI在神经节内细胞中的共定位（红色箭头）。（比例尺，25µm）(天)用p75NTR特异性抗体免疫染色的成年Nestin-GFP小鼠的肌间神经节，其中(我)神经节内p75NTR亚群+（洋红色）单元格（黄色箭头）(ii（ii）)雀巢GFP+（绿色），而另一组神经节内p75NTR+单元格（*）不是Nestin-GFP+（比例尺，10µm）Nestin-creER的两个肌间神经节的图像T2段-td番茄小鼠给予克隆剂量的三苯氧胺，并在诱导后6天死亡，表明巢蛋白衍生的td番茄+单元格（红色）(E类)may（黄色箭头）或(F类)可能不会（红色箭头）产生S100β表达细胞（绿色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。（比例尺，10µm）(G公司)Nestin的人口+单元格（绿色、黄色箭头）(我)在Nestin-GFP成年小鼠的肌间神经节内(ii（ii）)将有丝分裂标记Ki67（红色）表达到(三)显示GFP和Ki67表达的共定位，并具有(iv（四）)DAPI（蓝色）核染色更强，表明DNA复制和DNA含量增加。（比例尺，10µm）(H（H）)Nestin-creER的肌间神经节图像T2段：td番茄小鼠在三苯氧胺诱导6天后显示(我)tdTomato（红色）在神经节内细胞中的表达（白色和黄色箭头表示其中两个细胞），其中(ii（ii）)tdTomato在一个标记有泛神经标记物HuC/D（绿色，黄色箭头）抗血清的细胞中表达，而另一个表达tdTomato-的细胞没有标记HuC/D的细胞（白色箭头）。(三)用DAPI（蓝色）和(iv（四）)合并后的图像显示了表达tdTomato（红色）并用DAPI（蓝色）标记的HuC/D表达（绿色）细胞（黄色箭头），而另一个tdTomato-表达细胞（白色箭头）标记的是DAPI，但没有标记HuC/D。（比例尺，10µm）(我和J)面板显示了一只成年C57BL/6小鼠回肠14-µm厚的横截面，该小鼠用IdU给药7天，不久后被杀死，用100 mM柠檬酸缓冲液变性，显示出(我)PGP9.5免疫反应神经元（绿色，箭头）(ii（ii）)也标记有识别IdU的抗体（红色，箭头）(三)其中用DAPI（蓝色，箭头）对细胞核进行反染色(iv（四）; 合并图像）出现由IdU脉冲期间循环的前体细胞产生的新生神经元。（比例尺，10µm）(K（K）)Nestin75NTR双阳性ENPC克隆繁殖获得的体外分化神经球单色图像(我)GFAP免疫染色(ii（ii）)Nestin-GFP的表达。(三)PGP9.5免疫染色（黄色箭头）和(iv（四）)DAPI核标记显示克隆衍生的神经圈分化为不与Nestin-GFP共存的神经元。GFAP的表达模式与Nestin-GFP相似，但并不完全相同。（比例尺，10µm）
两个Nestin-creER肌间神经节的图像T2段-在两个不同时间点给予克隆剂量他莫昔芬的td番茄小鼠显示(A类)24小时大多数肌间神经节含有一个tdTomato+（红色）单元格，但位于(B类)三苯氧胺诱导后6天，大多数肌间神经节含有>1 td番茄+表明体内巢蛋白衍生细胞增殖的细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10µm）(C)成人小肠肌间神经节抗体染色(我)S100β（蓝色）(ii（ii）)PGP9.5（红色），含(三)Nestin-GFP报告转基因（绿色）显示(iv（四）; 融合图像），而Nestin和PGP9.5表达细胞形成两个不同的亚群，肌间Nestin-GFP表达细胞共存S100β。（比例尺，100μm）
骨髓细胞巢蛋白+/第75页NTR+体外表达干细胞行为。
在确定了这些推测ENPC的位置后，我们接下来在确定的培养基中使用体外克隆分析获得了其干细胞样行为的明确证据(12,40). 通过建立p75NTR表达细胞的流动门()，我们证实p75NTR在Nestin-GFP的一个子集中同时表达+使用FACS分析的单元格(和). 对所有分离的肌间质细胞群的体外克隆分析表明，只有Nestin-GFP+细胞增殖()神经球形成Nestin-GFP百分比的平均值±SE+细胞：3.6±0.4）。Nestin-GFP的相似克隆分析+p75NTR染色的细胞，我们发现只有同时标记Nestin-GFP的细胞+和p75NTR+形成的神经球(). 与所有Nestin-GFP亲本群体相比，该群体的神经球形成细胞数量显著增加+细胞（Nestin-GFP和p75NTR分类时，神经球形成增殖细胞百分比的平均±SE：10.1±0.5；P（P）< 0.01). 此外，这些单细胞衍生的神经球在分化条件下产生神经元和胶质细胞(; 非融合单色图像)（分化为神经元和胶质细胞的神经球百分比的平均值±SE：78.26±4.35；仅神经元：0±0；仅胶质细胞：2.22±1.96）。
体外增殖和神经原性分化的能力仅限于同时表达Nestin-GFP和p75NTR的肌间细胞。(A类)p75NTR免疫染色标记大多数细胞呈不同强度的阳性（蓝色曲线），与此处显示的未染色细胞相比呈红色阴影曲线，但只有高度标记的细胞（10.2%的细胞）被视为阳性。这些数据用于设置p75NTR的流量分拣门+人口。(B类)细胞根据四个象限中设置的门进行巢蛋白-GFP和p75NTR染色。(C)在Nestin-GFP报告小鼠LM-MP层的完全确定的流式分选单细胞培养基中进行的体外克隆分析表明，只有表达Nestin-GFP的细胞具有增殖潜能。(天)在完全确定的培养基中进行的体外克隆分析显示，单独的Nestin-GFP和p75NTR共表达细胞具有增殖潜力。(E类)克隆衍生的神经球在含有神经基础培养基、B27、BSA和β-巯基乙醇但不含生长因子的特定培养基中分化，产生分化细胞，其中一些细胞显示(我)Nestin-GFP（绿色）的持续表达，而其他表达导致(ii（ii）)未显示Nestin-GFP共表达的PGP9.5表达神经元（红色，红色箭头），或(三)GFAP表达细胞（蓝色）可能显示Nestin-GFP的共定位（绿色箭头）。Nuclei标有DAPI(iv（四）)，此处显示为浅灰色。（比例尺，10µm）
肠肌巢蛋白+细胞在体内负责神经发生。
在体外显示了其作为前体物的潜力后，我们利用可诱导Cre转基因小鼠进行命运定位实验，在健康成人肠道中测试了肌间巢蛋白表达细胞是否能够在体内神经发生。他莫昔芬诱导12小时后，成年Nestin-creERT2段：tdTomato小鼠在现有的HuC/D中没有表现出任何tdTomato的表达+神经元(). 然而，在三苯氧胺诱导6天后，用tdTomato标记成年肌间神经细胞，证明其来源于巢蛋白表达细胞(; 未融合图像). 为了进一步量化这种现象，我们在注射三苯氧胺后12小时、24小时、6天和14天杀死了一组小鼠，发现td番茄的比例增加+肌间神经节神经元随时间的变化()（td番茄平均百分比的平均值±SE+神经元/神经节：12h:0.0±0.0；24小时：0.20±0.20；6天：3.62±2.54；和14天：6.87±1.89，P（P）< 0.05). 肌间神经节中的一些巢蛋白衍生细胞也表达S100β，表明这些前体可以产生不对称的后代().
成年肌间神经节内增殖表达Nestin的细胞的体内神经发生。在Nestin-creER中T2段：td克隆剂量的他莫昔芬诱导的番茄小鼠，我们观察到(A类)三苯氧胺诱导后12小时，td番茄+肌间神经节中的细胞（红色；红色箭头）与泛神经标记物HuC/D（绿色；绿色箭头）不重叠，而(B类)诱导6天后，我们观察到HuC/d的种群+肌间神经节中的（绿色）细胞出现，表达tdTomato（红色）和荧光黄（此处用白色箭头标记）。同一神经节还包含HuC/D标记的（绿色）神经元，这些神经元不是从tdTomato表达细胞衍生而来的（绿色箭头）。td番茄+不表达HuC/D的细胞也存在于肌间神经节中（红色箭头）。使用DAPI（蓝色）对两幅图像中的细胞核进行反染色。（比例尺，10μm）此外(C)与三苯氧胺诱导后12小时和24小时相比，我们观察到表达HuC/D的td番茄数量增加+第6天和第14天的神经元(*P（P）<0.05），表明神经元继续从表达Nestin的细胞衍生而来。(天)td番茄+肌间神经节内的细胞在体内增殖，如在克隆剂量下标记后第6天其数量显著增加所示(**P（P）< 0.001).
新神经元产生于增殖和细胞分裂的前体。
鉴于Nestin+细胞在体内增殖(和、和)，我们假设它们可以在经典的干细胞范式中产生新的神经元，在这种范式中，前体细胞分裂形成子细胞，然后分化为神经元，而不是通过无中间细胞分裂的直接转分化。因此，我们确定成熟神经元是否来源于增殖细胞，这将表明前一个过程。在静止状态下，干细胞不对称分裂，产生一个前体细胞和另一个干细胞。前者继续分化为成熟细胞，而后者在一段时间后重新进入细胞周期。因此，通过使用时间间隔的增殖标记物，可以标记原始干细胞及其子干细胞，并跟踪其在体内的命运。
我们首先通过使用各种变性方案优化了检测胸苷类似物的实验方案(47)然后调整它们以获得切片和完整的肠道组织。我们通过饮用水连续7天给一只成年C57/Bl6小鼠注射IdU，并在治疗第7天结束时将其杀死。在对组织进行严格变性（100 mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0，煮沸2.5分钟）后，在回肠横切面内发现肌间神经丛内IdU标记的细胞，这些细胞表达泛神经标记物PGP9.5，因此是神经元(和). 肠隐窝内的细胞也被发现标记有IdU()验证我们的方法。
标签染色实验表明，通过增殖表达Nestin的前体细胞，可以快速有力地生成肌间神经。(A类,我)对一只成年C57BL/6 WT小鼠的回肠横截面（14-µm厚）进行100 mM柠檬酸缓冲液变性后，IdU染色显示肠隐窝中预期的阳性染色（绿色箭头）以及LM-MP层中的染色（红色箭头，在随后的面板中放大的虚线矩形）。(ii（ii）)PGP9.5免疫反应神经元（绿色、红色箭头），其中细胞核用DAPI（蓝色）复染(三)还标记有针对IdU的特异性抗体（红色），表明存在来自IdU脉冲期间循环的前体细胞的新生神经元。（比例尺，10μm）(B类,我)CldU标记（绿色）和(ii（ii）)IdU标记的（红色）细胞表达(三)HuC/D（蓝色）和(iv（四）)tdTomato（青色）是由tdTomata衍生而来的神经元（黄色箭头）+在IdU和CldU脉冲期间，表达巢蛋白的细胞至少循环两次以产生神经元。由于三苯氧胺以克隆剂量给药，只有前体细胞及其衍生神经元的亚群表达tdTomato。相同的图和面板显示了来自前体细胞的神经元（红色箭头），该前体细胞仅在IdU脉冲期间循环，其中可以检测到IdU（红色）的存在，但不能检测到CldU（绿色）。（比例尺，10µm）(C)出生时带有单个标记的神经元的百分比（IdU+或CldU+)因此，与生下来就具有两种标记的神经元相比，源于在两种条件下都只循环一次的前体细胞，因此源于在这两种条件中循环生成神经元的前体电池。这一发现表明前体细胞的循环速率很高。我们还看到一小部分神经元是从实验期间没有循环的前体细胞中出生的，因此它们要么是在实验期间出生的，要么是在试验前循环的细胞，要么是实验前出生的细胞。(天)在健康成年小鼠中，我们观察到，在取样的21天内，同窝成年鼠肌间神经节中的平均神经元数量高度保守。
雀巢creERT2段：td然后给番茄小鼠单剂量的他莫昔芬，一天后再给小鼠一周的IdU脉冲，然后再给小鼠一周的不同胸苷类似物CldU脉冲，然后立即杀死小鼠。IdU和CldU均由抗BrdU抗体检测，该抗体可选择性地与IdU或CldU交叉反应(48). 如果我们的假设是正确的，那么在第一周，干细胞应该吸收IdU，如果它们经历不对称分裂，那么分化的干细胞和子干细胞都将被标记为IdU。随后暴露于另一个标签（CldU）将导致只有增殖的子干细胞携带（IdU和CldU的）标签，而这两个标签反过来将由其分化的子代细胞表达。显示了雀巢衍生（tdTomato+)对IdU和CldU进行染色的神经元，表明该特定神经元来源于表达Nestin的ENPC，该ENPC在三苯氧胺诱导产生神经元后2周内至少循环两次。
如所示所有HuC/D+神经元，平均11.5%的神经元没有标记，因此在2wk实验前出生；平均17%的人只标记了IdU，因此出生于第一周循环的细胞；66%的人同时标记有IdU和CldU，因此出生于在2周内至少循环两次的细胞，4.75%的人仅标记有CldU。这表明他们出生于第二周循环的细胞，或者已经稀释了他们的IdU标签，或者从未开始过。因此，标记有HuC/D的所有肌间神经节神经元中，约88%仅2周龄，表明神经发生率很高。尽管有大量神经发生的证据，我们还是像以前一样发现了()肌间神经节的神经元数量在这段时间内保持不变()与之前显示的细胞凋亡持续损耗相一致。
成人ENPC中磷酸酶和张力蛋白同源基因的靶向缺失再现了某些形式的慢性肠假梗阻的表型。
如果肠神经元来源于增殖的Nestin+细胞周期行为的改变会破坏ENS的形态和功能。我们之前已经证明，在体外模型中，假定成年ENPC中10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）信号的变化导致ENPC增殖增加(40). 因此，我们使用Nestin-PTEN cKO小鼠删除了成年Nestin表达细胞中的PTEN基因。三苯氧胺诱导后，Nestin-PTEN cKO小鼠的小肠肌间神经节大于Nestin-PTEN WT小鼠()每个神经节的平均神经元数量都显著增加(n个=每组3只小鼠，每个神经节的平均±SE神经元数：PTEN WT和PTEN cKO分别为17.79±1.3和41.25±3.4，P（P）= 0.003) ()神经元胞体的大小[n个=每组3只小鼠，平均±SE体大小（以Feret直径测量）：PTEN WT和PTEN cKO分别为15.4±0.44µm和20.00±0.41µm，P（P）= 0.001] (). 此外，我们发现PTEN cKO小鼠的全程转运时间显著高于PTEN WT小鼠(n个=每个PTEN cKO组8只小鼠n个=每PTEN WT组3，染料的平均±SE胃肠转运时间：PTEN WT和PTEN cKO分别为158.8±20.17 min和231.7±14.33 min；曼惠特尼试验：P（P）= 0.04) ().
在成年ENPC中敲除PTEN显著增加神经元的数量和大小，并显著增加整个肠道的转运时间。(A类和B类)用三苯氧胺诱导30天后，显微照片显示Nestin-PTEN WT和Nestin-PTEN cKO小鼠肌间神经节中HuC/D染色（绿色）神经元。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（比例尺，10μm）我们观察到(C)HuC/D显著增加+Nestin-PTEN cKO小鼠肌间神经丛中的神经元与其WT对照Nestin-PTEN WT小鼠相比(天)Nestin-PTEN cKO小鼠的神经元平均大小（用Feret直径表示：神经元细胞体的直径）显著高于其WT对照组(P（P）< 0.05). (E类)与同样用三苯氧胺诱导的年龄匹配的Nestin PTEN WT小鼠相比，用三苯氧胺诱导30天后的Nestin PTEN cKO小鼠显示胭脂红染料的整个肠道转运时间显著增加(P（P）= 0.04).
ENPC与Glia的关系。
考虑到S100β的表达，可以想象ENPC是胶质细胞。为了验证这个假设，我们研究了Nestin和Sox10的共表达。Sox10在胚胎发生和发育过程中由神经原性迁移性ENPC表达，但在成人中仅标志成熟的肠神经胶质细胞(8,44). 在本实验中，我们使用成年Sox10-H2BVenus小鼠，其中所有表达肌间Sox10的细胞都用荧光报告蛋白Venus标记(44). 当Nestin染色时，这些小鼠的肌间神经节没有发现Sox10和Nestin重叠(). 我们进一步测试了Nestin-GFP中传统胶质标记物GFAP和S100β的表达+/第75页NTR+使用FACS分析成年小鼠的ENPC种群。尽管巢蛋白GFP+第75页NTR+细胞表达GFAP和S100β，并非所有的GFAP+或S100β+细胞表达Nestin-GFP或高水平p75NTR(). 因此，GFAP或S100β自身的表达不足以识别成人ENPC。我们的结果以及其他研究的数据(49,50)表明真正的胶质细胞表达Sox10，而ENPC不表达。因此，成人ENPC不是肠神经胶质，尽管它们表达某些与肠神经胶质相关的基因。
成年肌间神经节内的巢蛋白表达细胞不表达泛更年期胶质标记物Sox10，但表达与胶质细胞相关的其他基因。(A类)雀巢（红色）未标记Sox10+与与DAPI（蓝色）共染的Sox10-H2BVenus小鼠肌间神经节中的Sox10表达细胞（黄色箭头）相比，表达Nestin的细胞（绿色）和Nestin细胞（红色箭头）形成单独的成年肌间细胞群。不表达Nestin或Sox10的细胞也出现在肌间神经节中。（比例尺，10µm）对Nestin-GFP转基因报告鼠LM-MP衍生细胞中GFAP和S100表达细胞的FACS分析显示(B类)同时表达GFAP和S100（GFAP）的细胞群+S100标准+)以及未标记细胞（阴性）、GFAP单表达细胞（GFAP+)和S100单表达细胞（S100+). (C)GFAP和S100共表达细胞根据其荧光强度的任意细分（通过GFAP和S100的增加共表达标记为群体1到5），揭示出(天)GFAP和S100的较高荧光强度（从而表达）与神经嵴干细胞标记物p75NTR和(E类)增加Nestin-GFP细胞的存在。仅表达GFAP的细胞(F类)Nestin-GFP和(G公司)也不表达高水平的p75NTR。S100单表达细胞(F类)确实表达了Nestin-GFP，但(G公司)不要表达高水平的p75NTR。红色阴影的种群D–G型表示阴性人群。
讨论
虽然神经原细胞已被证明存在于成年小鼠和人类肠道中，但其干细胞样行为的证明主要局限于体外实验(7,12,13,22,40,51–53). 迄今为止，大多数研究表明，在健康肠道中，体内没有成人肠道神经发生(7–9,54). 然而，正如最近的一份报告所示，在神经元持续丢失和退化的情况下(27)，我们不知道成年肌间神经细胞数量在成年生活的大部分时间里是如何维持的。鉴于文献中关于这一主题的报道相互矛盾(5,6,26,55–58)首先重要的是严格建立和量化成人肠道神经元的凋亡。通过使用多种方案检测凋亡神经元的存在，我们有信心证明健康肠道中肌间神经细胞的凋亡率很高。在任何时候，大约11%的肌间神经细胞都被裂解的caspase-3标记，这表明它们注定会导致程序性细胞死亡。我们还发现，在7天的时间里，标记神经元的数量显著增加（约31%），转化为每天损失4-5%。事实上，大约一半的细胞凋亡数字（通过裂解caspase-3标记）每天都会死亡，这意味着一个神经元在凋亡开始后大约需要2天才能死亡，这与之前报道的其他类型神经元的死亡情况一致(59). 通过使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂，细胞凋亡的生理作用得到了强调，这导致了肌间神经细胞计数的增加。最后，我们还显示了大量的肌层巨噬细胞驱动的强大吞噬细胞反应，已知这些巨噬细胞与肌间神经细胞有关(33)清除大量死亡神经元留下的碎片。
综上所述，这些结果表明，成人肠道中肠道神经元的高更新率，这只能通过调用持续的神经发生来调节，而这反过来又需要ENPC的存在。以前定义成人ENPC的尝试依赖于表达各种标记物的细胞的干细胞样行为的体外演示，如Sox10、GFAP、p75NTR和CD49b以及Nestin(7–9,11–18,20–23). 在这些标记物中，我们重点关注Nestin，因为存在在Nestin启动子下表达Cre重组酶的转基因动物，使我们能够可视化和分离这些细胞，跟踪它们在体内的命运，并对其中其他蛋白质的表达进行基因操纵(38,39,41,42). 使用Nestin-GFP转基因报告小鼠，我们发现Nestin与神经嵴干细胞标记物p75NTR共存的细胞不表达神经元标记物，并且位于肌间神经节内。这是唯一能够在规定培养条件下在体外增殖和神经发生的细胞群。通过跟踪这些细胞在成年诱导型Nestin-creER中的命运T2段：td番茄小鼠，我们发现表达Nestin的细胞在健康肠道中产生成体肌间神经细胞，表明这些细胞是真正的ENPC。先前的一项研究描述了成年小鼠结肠中可能存在的ENPC，并建议在使用5HT4激动剂治疗后从节外区增殖和迁移到肌间神经丛(9). 最近，我们观察到神经节外雪旺细胞前体在结肠中生成肌间神经细胞，但在小肠中没有(45). 与这两项研究相比，我们发现成年Nestin+小肠肌间神经细胞的前体存在于肌间神经节内，表明肠神经发生的区域差异。
我们的结果还表明，真正的ENPC并不像之前所说的那样是成熟的肠神经胶质(60). 虽然成年肌间神经丛层中表达Sox10的细胞在体外保留了神经原性(44)，这种在体内处于稳定状态的能力仍然局限于胚胎期和出生后早期(8). 在胚胎ENS“发育”和成年ENS“维持”的两个阶段之间，ENPC标记谱从Sox10切换到Nestin。事实上，最近对斑马鱼ENS发育的研究表明，发育中的肠道中的神经前体的Sox10表达也是异质的，具有神经源性的Sox10−Sox10迁移波前后的细胞+多能肠神经嵴前体(61). 结合我们的发现，这些报告提出了一个似是而非的假设，即Sox10+成人肠道中成熟的胶质细胞在体内生成神经元的能力有限，而且只能在特定的损伤条件下生成(8)，而Nestin+/Sox10型−前驱体是健康成人神经发生的原因。
这些细胞的前体性质的确凿证据是，在促进不受抑制的增殖的条件下，它们能够繁殖某些人类疾病的表型。肠神经细胞数量的变化与慢性肠假性梗阻有关，这是一种伴有肠运动缓慢和相关并发症的慢性衰弱状态。肌间神经细胞的减少（神经节功能减退）和增加（神经节增生）都与慢性肠假性梗阻有关。后者包括一些人类疾病，如肠神经发育不良（IND）或神经节神经瘤病，这些疾病可能是异质性疾病，患者亚群PTEN表达显著降低(24). 结合我们之前的体外实验结果，成年ENPC以PTEN依赖的方式循环和生成神经元(40)目前的研究表明，体内成人神经发生也可能由涉及PTEN表达的分子途径控制。
我们认识到，我们的发现与该领域当前的教条相矛盾，该教条假定，成年肠道神经元一旦出生，在疾病或衰老导致死亡之前保持静止。事实上，之前的报告显然未能通过追踪成年表达Sox10的细胞（被认为是成年ENPC）的命运，找到神经发生的证据(8). 这种差异现在可以通过我们的证明来解释，即ENPC不表达Sox10。另一方面，ENPC确实表达胶质标记物，如GFAP，其他人试图将GFAP用于成年神经元的命运绘图实验，结果也明显与我们的结果相冲突(7). 这些研究人员使用了一种成人诱导型转基因hGFAP-creERT2段用一只B6背景的YFP报告转基因小鼠繁殖的小鼠，长期接触三苯氧胺（6-8个月）。然而，只有3-5%的GFAP+细胞实际上接受了他莫昔芬诱导cre公司重组成为YFP+考虑到转基因表达率降低以及与报告人表达相关的其他问题(62)毫不奇怪，这些研究人员发现了一小部分似乎来自成年GFAP-YFP的神经元+细胞。此外，因为所有他莫昔芬诱导的hGFAP-creERT2段在三苯氧胺治疗后的同一时间处死小鼠，Joseph等人无法观察GFAP衍生的神经元群是否随时间而扩大(7). 然而，如此低数量的重组YFP+细胞仍然能够在稳定状态下产生大量神经元，这与我们的结果一致。
在本报告中，我们还讨论了文献中的另一个差异，即Joseph等人的无能(7)使用BrdU标记证明体内神经发生。接下来，我们将讨论为什么以前的报告使用BrdU脉冲相技术未能证明循环前体的神经发生(7,8,54). 我们推断，如果ENPC人群真的有很高的更替率，那么标签保持标记下降到检测水平以下可能是一个重要的混杂因素(63). 因此，我们设计了一种标记和检测方案，用于更短的链和更严格的DNA变性。使用这些技术暂时分散给药不同的胸苷类似物，我们发现成人肠道神经发生是由表达Nestin的循环神经前体产生的。用胸苷类似物治疗2周后，标记有HuC/D的所有神经元中约88%显示出标记抑制，因此为新生神经元。虽然这个数字很高，但它有助于解释尽管神经元凋亡率很高，肌间神经细胞的数量是如何保持的。当细胞凋亡被阻止时，我们发现每个神经节的神经元数量在一周内增加了约50%，这与2周内约88%的新生神经元相一致。
令人惊讶的高神经元转换率提出了几个问题，这些问题在未来的研究中仍有待回答。我们的结果仅限于小肠，我们不知道肠道的其他区域是否表达相同的神经发生模式。我们的体内成像结果显示，神经元网络变化迅速，表明神经系统具有高度动态性，不断失去旧的连接而产生新的连接。目前，我们还不完全了解ENS中的功能电路是如何构建或维护的，但对这种转换缺乏生理干扰的一个可能解释是，它在时间和空间上错开了，并且在肠道的特定区域内，这种电路存在大量冗余(64–67).
ENS中的这种转换速度要么是由于成熟神经元的固有寿命较短，要么是由于肌间神经丛夹在纵肌和环肌之间而受到持续机械应力（拉伸、压缩和剪切）的损伤(三). 此外，由于其接近肠道内容物，ENS特别容易受到外部威胁(4,68). 然而，肌间神经节中相对较小数量的ENPC似乎能够替换大量死亡或濒临死亡的神经元。正如我们之前的计算所示，成年肌间神经元的死亡速度为每天每个神经节一个神经元，这并不超过快速循环细胞的能力。另一种机制涉及一个中间“传递放大”细胞池，这些细胞由命运决定并循环产生大量终末分化细胞，就像肠干细胞一样(69). 目前尚不清楚成年肌间神经节中是否存在这种神经原性传递放大细胞，了解ENPC形成成年神经元的分化模式将是了解成年ENS复杂生物学的下一步工作的一部分。
总之，我们的研究表明，成人肠道神经元从可识别的非成熟胶质细胞的神经元前体中快速而有力地更新(). 这些发现具有相当的科学和临床意义。在持续凋亡的情况下，依靠这种机制来维持神经元数量，可能会使ENS在这一过程中受到干扰。例如，最近的一项研究表明，抗癌化学治疗剂5-FU（一种以循环细胞为靶点的胸腺嘧啶合成阻滞剂）会导致成年肌间神经细胞数量减少(70). 同样，高脂饮食诱导肥胖成年小鼠肌间神经细胞凋亡增加的报告(58)并不总是与相应的肌间神经细胞缺失相关，提示主动替代(71). 在另一个与临床和生理相关的案例中，衰老与患病率降低有关(72)ENPC的增殖潜能以及神经元凋亡增加(27)，这可以解释观察到的神经元数量随着年龄的增长而减少的原因(64). 这些报告现在可以在一个结构中更好地理解，在这个结构中，ENS通过细胞凋亡和神经发生之间的平衡而动态维持。此外，如我们所示，靶向已鉴定ENPC中的基因突变有潜力开发人类疾病的新模型。因此，通过鉴定参与细胞及其分子特征，我们的研究为研究运动障碍的发病机制以及运动障碍的治疗靶点提供了科学依据。
小鼠早期发育和成年前体细胞神经胶质生成潜能差异的示意图。肠迷走神经嵴干细胞（EV-NCSC）为Sox10+细胞，来源于胚胎神经嵴（Wnt1+Sox10型+)迁移到发育肠道并生成Sox10−神经元和Sox10+ENS发育过程中的胶质细胞。这些Sox10+EV-NCSC还导致成人ENPC不表达Sox10型但一定要快递内斯汀成人ENPC不仅用成人（Sox10）替换早期发育期间出生的神经元−)神经元，也可以通过产生稳态神经元来维持成年神经元的种群，以取代因凋亡而丢失的成年神经元。Sox10+胶质细胞和胶质前体细胞也存在于成人肠道中，在那里产生Sox10+成熟的成年胶质细胞，在某些损伤状态下，可能生成成年神经元。
SI方法
动物。
C57/Bl6背景下成年雄性Nestin-GFP小鼠(38)用于Nestin-GFP网络成像，以及分离ENPC用于体外分析和作为移植宿主。FACS分析发现Nestin-GFP表达与Nestin表达一致(). Wnt1-cre:td番茄小鼠(12,40)用Nestin-GFP小鼠繁殖，用Nestin-GFP和Wnt1-cre:tdTomato创建三重转基因小鼠，以观察肠道中Nestin衍生网络和神经嵴衍生细胞（标记ENS的所有细胞）之间的重叠。雀巢creERT2段用漂浮的tdTomato（Ai14小鼠；Jaxmice#007908）小鼠繁殖小鼠（Jaxmice#016261），以产生Nestin-creERT2段：td番茄老鼠。用于Nestin creER的体内实验T2段，只使用td番茄纯合子小鼠。同样，Nestin-creERT2段小鼠也用漂浮的PTEN繁殖Δ/Δ（Jaxmice#004597）两代动物创建Nestin-creER系列T2段：PTEN公司Δ/Δ（以下简称Nestin-PTEN cKO）和Nestin-creERT2段：PTEN公司重量/重量（以下简称Nestin-PTEN WT）小鼠。在三苯氧胺诱导下，Nestin-PTEN cKO动物将完全敲除Nestin中的PTEN+经历cre-lox公司重组。Sox10-H2BMenus鼠标(44)采用免疫组织化学方法研究Sox10和Nestin之间的重叠。此外，NOS1 creERT2小鼠（Jaxmice#014541），用于成年肠道氮能神经元和肠道功能的基因控制(32)用漂浮的tdTomato（Ai14）小鼠繁殖，以产生NOS1-cereRT2：td番茄小鼠，用td番茄标记NOS1表达的氮能神经元，用于研究肠道氮能神经元数量的减少以及肌间神经节的活体成像。此外，用漂浮的YFP动物（YFP在细胞膜上表达；Jaxmice Ai32#012569）繁殖ChAT-cre小鼠（Jaxmice#018957），以生成ChAT-cre:YFP小鼠。类似地，该ChAT-cre小鼠系也与上述Ai14小鼠系杂交，生成ChAT-cre:tdTomato小鼠系，其ChAT-cer:tdTomaso在肌间神经细胞中表达，但在巨噬细胞中不表达(35)用于研究组织-巨噬细胞对标记神经元的吞噬作用。用C57/Bl6野生型小鼠进行7天的IdU脉冲，研究回肠内的标记。
他莫昔芬诱导方案。
将他莫昔芬（Sigma-Aldrich，Cat.#10540-29-1）在室温下在铝箔包装管中摇晃过夜，以20 mg/mL的浓度溶解在玉米油中，并在注射期间在4°C下保存。用于标记Nestin+Nestin-creER中含有td番茄的细胞T2段：td番茄小鼠体内命运定位实验中，给予单剂量他莫昔芬（100µL，腹腔注射）。用于标记Nestin+Nestin-creER中含有td番茄的细胞T2段：td用于体外细胞培养和后续移植实验的番茄小鼠，连续4天给药四剂他莫昔芬（100µL，腹腔注射）。用于诱导巢蛋白中PTEN的条件性缺失实验+将小鼠细胞中用于神经元数量量化和全转运分析的100µL玉米油三苯氧胺连续4天腹腔注射到Nestin-PTEN cKO和Nestin-PTEN WT成年小鼠体内。用于标记NOS1+NOS1-creER中的神经元T2段：td番茄小鼠，每天将100µL类似浓度的三苯氧胺溶液灌胃给三只同龄小鼠进行体内成像实验，并灌胃给六只同龄小鼠进行衰变和zVAD FMK实验，其中一组小鼠(n个=3）在三苯氧胺诱导停止后第二天（第0天）处死两组小鼠(n个=每组3人；在停止三苯氧胺诱导7天后（第7天），将未使用zVAD-FMK和使用zVAD-FMK治疗的两组动物处死。
IdU和CldU标记、检测和量化协议。
在三苯氧胺诱导后，小鼠通过饮用水给予1 mg/mL IdU 7 d，然后将含有IdU的饮用水与含有1 mg/mL CldU的饮用水中交换7 d以上。然后处死小鼠，将LM-MP制剂（见下文）固定在新鲜制作的冰镇4%多聚甲醛溶液中。对于整个染色，我们用10%EDTA测试变性(47)在室温和高温（50°C）下放置15分钟，发现该组织对使用BrdU抗体或抗HuC/D血清的任何免疫组织化学反应均无反应。用EDTA进行实验后，用对照组织（来自未接触CldU的动物）和试验组织（来自接触CldU的动物，为期1周）测试CldU和HuC/D免疫染色，这些组织在50°C下暴露于2 N HCl不同的时间（5、10和15分钟），然后立即用1×PBS冲洗三次（每次15分钟）。对照组织对CldU抗体没有任何反应，而试验组织在暴露于变性剂后，肌间神经节周围和内部的细胞数量增加(). 在超过15分钟的高温下暴露于2 N HCl会阻碍组织的完整性，并阻碍免疫染色和可视化。该标准化方案用于IdU/CldU染色组织的免疫染色。然后用选择性交叉标记IdU或CldU的抗BrdU抗体标记IdU/CldU[B44抗体与IdU选择性交叉反应（BD Biosciences），Bu1/75与CldU选择性交叉作用（Novus Biologicals）](48)并用抗鼠546抗体（抗B44 IdU抗体）和抗鼠488抗体（抗Bu1/75 CldU抗体）（Invitrogen）进行复染。酸处理会破坏所有天然荧光并改变细胞结构，因此需要通过免疫荧光来揭示td番茄的表达。因此，除了使用HuC/D抗血清（ANNA1）外，还使用抗RFP抗体（Rockland）对组织进行染色。抗RFP抗体用抗兔647抗体（Invitrogen）复染，HuC/D抗血清用抗人Brilliant Violet 421抗体（Biolegend）复染。用不含DAPI（Vector Labs）的安装介质安装组织。未使用IdU/CldU的LM-MP对照组织同样变性和染色。核仁中的轻微染色被认为是基于变性的自体荧光，而HuC/D标记细胞中整个细胞核中的大量染色被视为阳性标记神经元。作为进行酸处理的技术限制（标记保持染色的先决条件），在整个肠道上对肠神经元进行可视化和计数，细胞的大小和形状发生改变，并非所有神经元都标记有HuC/D。因此，为了量化，只有用HuC/D抗血清标记的神经元被计数，因此代表了所有肌间神经细胞的一个亚群。
组织制备和细胞分离。
小鼠用异氟醚麻醉，并因颈椎脱位而死亡。进行剖腹手术，取出小肠，用含有青霉素-链霉素（PS；Invitrogen）的PBS进行灌洗，然后切成2厘米长的片段，放在无菌塑料棒上。沿着浆膜表面做一个浅层纵向切口，用湿的无菌棉签从下面的组织上剥下LM-MP(40)并置于含有PenStrep（Invitrogen）的Opti-MEM培养基（Invit罗gen）中。LM-MP在由含有0.1%BSA、1 mM CaCl的M199培养基（Invitrogen）组成的消化缓冲液中分解2、20 mM Hepes、150μM P188、50 U/mL DNase I（Worthington）和1.1 mg/mL胶原酶（Sigma），在37°C和5%CO下维持40分钟2。用1%BSA在PBS中清洗组织，然后首先通过100µm，然后通过40µm尼龙网滤器，得到单个细胞。
全肠道转运时间和速度分析。
通过使用胭脂红方案的方法分析每只小鼠的全肠道转运时间(75). 将小鼠放置在单独的笼子中，禁食1小时，然后通过口服方式将0.3 mL 6%（wt/vol）胭脂红溶液（含0.5%甲基纤维素）灌入小鼠胃中。每只小鼠在服用胭脂红染料后产生红色粪便颗粒所需的时间以分钟为单位进行记录。采用Mann-Whitney非参数检验对Nestin-PTEN WT组和Nestin-PTEN cKO组之间的平均时间差异（分钟）进行统计分析。
ENPC移植实验。
Nestin creER的LM-MP片段T2段：td给予他莫西芬4天的番茄小鼠被消化成单细胞[使用前面描述的消化缓冲液(40)]细胞在干细胞培养基（SCM）中培养，该培养基由含有1×B27，1.75%BSA，2 mM我-谷氨酰胺、100 U/mL PS、20 ng/mL成纤维细胞生长因子、20 ng/mL表皮生长因子和20 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子（Invitrogen）。在两次传代持续5d后，将所得球体分裂为两种培养物。在含有1×B27、1.75%BSA、2 mM的神经基础培养基的分化培养基中，一批细胞在纤维连接蛋白涂层板（Becton Dickinson）上分化7 d我-谷氨酰胺和100 U/mL PS。体外分化后的这些细胞被固定并用NOS1抗体染色(). 第二批细胞在10cm纤连蛋白包被的组织培养板（Becton Dickinson）上的粘附单层中培养，直到融合，然后移植到三只成年小鼠的幽门中（细胞密度为100000个细胞/2.5µL/每个注射部位，每只小鼠两个注射部位）。术后第二天，一只小鼠因手术并发症死亡，其余两只移植小鼠在移植后7周处死，取出肠道，固定在冰镇新鲜制备的4%PFA溶液中，并切片。切片用抗HuC/D抗血清和适当的二级抗体进行染色，细胞核用DAPI标记，盖玻片，并在共焦显微镜上观察tdTomato的存在。
增殖和分化分析。
为了进行克隆分析，将分选好的细胞轻轻地分层放在装有微孔芯片的玻璃底皿上(40)将培养皿置于37°C、5%CO的组织培养箱中，使其在微孔中沉淀2孵育30分钟后，用新鲜SCM轻轻清洗表面两次，以去除未处理的细胞，并用3 mL SCM填充培养皿并孵育。以这种方式，只有沉淀的细胞留在表面，不同数量的细胞被随机放置在不同的微孔中，这些微孔在SCM中培养。再培养30分钟后，通过配备荧光灯和GFP滤光片（尼康C1）的相控显微镜，通过4倍物镜对培养皿进行成像，并在预热至37°C的台上进行环境控制。通过4倍物镜，用CCD摄像机记录每个小网格。在每个小网格上对整个表面进行成像后，将培养皿返回到培养箱中，在37°C和5%CO的条件下进行进一步培养2并且每隔一天更换一次培养基。培养6天后，与之前一样对整个芯片进行成像，以便记录每个微孔的两个时间点——T0（立即接种后）和T6（培养接种后6天），并记录第0天出现在单孔中的单个细胞数量，这些细胞后来成为神经球。
T6成像后，将芯片中的SCM培养基轻轻排空，并立即轻轻地将200µL生长因子降低的Matrigel（Becton Dickinson）分层在芯片顶部，然后在37°C下用5%CO培养皿2培养12小时，然后将培养皿装满DCM，培养5天，每隔一天更换培养基。
细胞分化5天后，将培养基从培养皿中排出。细胞在室温下原位固定在4%PFA溶液中1h，然后在4°C的50%甘油溶液中浸泡过夜。然后用冷PBS轻轻清洗表面两次，并在室温下将其浸泡在10%的正常山羊血清中1小时。再次用冷PBS轻轻清洗表面一次，并在4°C下用适当的泛神经（PGP9.5）抗体孵育2 d。与一级抗体孵育后，用冷PBS轻轻清洗盘子三次，并使用抗兔Alexa Fluor-594抗体（Invitrogen）在4°C下过夜对芯片进行复染，然后使用冷PBS清洗三次。然后用针对胶质标记物GFAP的抗体对相同的培养皿进行染色，该标记物使用APEX抗体标记试剂盒（Invitrogen）和DAPI（Vector）与Alexa 647直接偶联，并在4°C下培养2 d。孵育后，用冷PBS轻轻清洗培养皿三次，用共焦显微镜研究含有神经球的孔，观察分化成表达神经元和胶质标记的细胞的神经球，以及Nestin启动子和核标记DAPI下GFP的表达。
LM-MP组织的免疫组织化学，无需光学澄清。
使用解剖显微镜从肠道中取出固定的LM-MP组织后，在16°C的低温PBS中在黑暗中清洗两次。然后将组织在封闭渗透缓冲液（BPB；5%正常山羊血清和0.3%Triton-X）中培养1小时。然后将组织从BPB中取出，并在列出的浓度下与适当的一级抗体培养()在16°C的温度下黑暗放置48小时，以55 rpm的速度摇晃。与一级抗体孵育后，将组织在PBS中在室温和黑暗中清洗三次（每次清洗15分钟）。然后将组织在适当的二级抗体中在室温下孵育1小时，同时在旋转摇床上（65 rpm）。组织在室温下再次在PBS中清洗三次，用DAPI复染以染色细胞核，覆盖Vectashide贴装介质，盖玻片，并使用Leica 510共焦显微镜成像。
使用Nestin-GFP小鼠进行成像和3D渲染。
采用上述技术对Nestin-GFP小鼠的肠肌间神经丛进行深度成像(43). 用冷冻PBS灌注固定小鼠，然后新鲜制备4%PFA溶液，获得肠段。在某些情况下，通过用亲脂性染料（DiD）进一步灌注小鼠来标记脉管系统。一旦采集肠道，用0.4 mol/L的冷HBSS冲洗回肠N个-乙酰基-我-半胱氨酸和PBS去除管腔内容物。之后，将组织固定在4%PFA中过夜。然后将固定组织浸入2%Triton-X 100溶液中，在15°C下浸泡2 d，以进行渗透。使用不同的一级和二级抗体对组织进行特异性标记(). 最后，将标记样本浸入FocusClear溶液（CelExplorer）中进行光学清理，然后使用蔡司LSM 510 META通过激光共焦显微镜成像。LSM 510软件和Avizo 6.2图像重建软件（VSG）用于共焦显微照片的2D和3D投影。Avizo软件在戴尔T7500工作站下运行，Avizo的“高斯滤波器”功能用于降低显微照片的噪声。
活体动物成像。
将慢性腹窗和肠支架手术植入NOS1-creER的腹部T2段：td根据上述方法，用三苯氧胺诱导的番茄动物(32). 使用双光子激光扫描显微镜（Scientifica）和变色龙Ultra II激光器（相干）对小鼠的小肠进行成像，调谐至920 nm（25–65 mW输出功率）。使用20×水浸物镜（1.0 NA；奥林巴斯）或16×水浸镜头（0.80 NA；尼康）以512×512像素的分辨率采集实时图像。用3-4%的异氟醚麻醉小鼠，并将Purelube兽医软膏涂抹在眼睛上。在1.5-3%异氟醚的作用下，将小鼠置于加热的立体定向平台上，暴露腹部窗口。在钛窗边缘涂上疏水凡士林，并在窗玻璃顶部加水作为物镜。小鼠血管系统被用作肠道位置的参考点。使用BFWCAMXM相机（Scientifica）识别相同的位置，并用z（z）-手术后连续2天使用5–10µm的轴。结果图像被转换为2D投影图像（使用斐济），以完全代表z（z）-二维图像中的平面。
肌间神经细胞和肌层巨噬细胞的双光子成像。
从大肠其余部分（粘膜和粘膜下层）取出外肌层，用4%PFA固定5小时，浸入PBS中30%蔗糖中24小时，用1%Triton（Sigma-Aldrich）和2%BSA（Sigma Aldrich单克隆抗体（mAb）（eBioscience）24小时，然后在4°C下再加上链霉亲和素Alexa Fluor-488 24小时。每1µm扫描一次整个组织z（z）-多光子共焦显微镜轴（尼康，A1R MP）。图像通过Volocity软件（PerkinElmer）进行分析。
分析每个神经节的神经元数量。
HuC/D数量+对每只动物至少10个随机神经节中的细胞进行计数。神经节中的神经元密度（由每个神经节中神经元的数量定义）按照之前在啮齿类动物小肠和结肠中的描述进行测定(27,74). 肌间神经节被定义为HuC/D的一个内聚的未断裂群+细胞。肌间神经节界限定义的表示如所示计算每组每个神经节的平均神经元数，并分析组间差异的统计意义。
流量分类和流量分析。
对单个细胞进行流式分选，以便在基于微流体的分选机（Celula mvs360；Celula）上进行初始实验，然后在BD（Becton Dickinson）流入上进行附加实验（使用120微米喷嘴），以进行克隆分析。在BD-LSR II上进行流式分析，以研究从Nestin-GFP小鼠LM-MP分离的细胞中S100和GFAP的表达以及p75NTR的表达。紫外线。对来自ChAT-cre:tdTomato和WT（性别匹配）小鼠小肠肌层和固有层的细胞进行流式分析，以确定吞噬细胞中是否存在tdTomato-荧光，其中巨噬细胞被染色为DAPI−CD45型+CD11c公司+CD11b型+MHCII公司你好使用FlowJo 7.6.1（FlowJo）对FACS数据进行所有分析。
用于免疫细胞和免疫组织化学的抗体和浓度。
所有抗体及其浓度列于.
数据生成。
计数的动物和神经节数量的样本量如所示–在所有实验中，都使用了同窝鼠，在需要更多老鼠的情况下，我们使用了相同基因型的同龄老鼠。然后将来自不同窝的小鼠平均分配到不同组。对于显微镜计数，对随机区域进行成像，并由盲法观察者从图像中计算每组神经节的细胞数。
在移植实验中，将细胞移植到三只相同年龄的小鼠体内。一只老鼠在手术后第二天死亡，并被从实验中取出，而这只老鼠的组织没有被分析并包含在这份手稿中。对于活体动物体内成像实验，三个NOS1-creERT2段：td使用番茄小鼠，在第1天对20个肌间区进行成像，其中8个区域被发现，并在第2天再次成像。
在体外克隆分析中，只统计在细胞沉降到微孔后排序后完好无损的细胞。在只对细胞进行GFP表达分类的实验中，共有978个Nestin-GFP−和450 Nestin-GFP+对细胞进行计数。总计372内斯汀+单分类单元格，182个单元格内斯汀+
第75页NTR+，156个单元格内斯汀+
第75页NTR−，163个单元格内斯汀−第75页NTR+，和201个单元格内斯汀−第75页NTR−沉降后计数为完整细胞，并进行6d培养。为了进行分化，分析了15个被认为来自单个细胞的神经球的分化潜能。对于FACS分析，检测了10000个细胞。所有体外实验均进行了三次。所有体内实验均采用生物三倍体（三只小鼠）进行，数据采用上述每只小鼠的技术复制品生成。
重组效率。
在NOS1-creERT2:td连续四天给番茄动物服用三苯氧胺。
在所有观察到的神经节中(n个=10），用NOS1抗体免疫染色的所有神经元也表达tdTomato。
在给予克隆剂量他莫昔芬的Nestin-creERT2-td番茄动物中。
使用克隆剂量，我们观察到在12小时时，15%的肌间神经节发生重组(n个= 3; tdTomato神经节百分比的平均值±SE+细胞=15±5）。
