招募到紫外线损伤位点的错配修复蛋白导致G1期许可因子Cdt1降解

摘要

引言

为了保持基因组的完整性，细胞在每个细胞周期中正确复制一次DNA，并通过触发DNA损伤反应来应对基因毒性损伤。^1,2泛素连接酶参与DNA代谢途径以保持基因组完整性。中铁四局^抄送2是Cullin4-RING泛素连接酶（CRL4）家族的成员，在S期和DNA损伤后都被激活。^三CRL4由DNA损伤结合蛋白1（DDB1）、Cul4和Rbx1组成，DDB1作为连接Cul4-Rbx1和底物受体家族的适配器蛋白D类DB1和C类ul4型一有关联的（f）参与者（DCAF）。^4-6Cdc10-依赖性转录物2（Cdt2）是形成CRL4的DCAF蛋白^抄送2.

中铁四局^抄送2最初被鉴定为泛素连接酶，在DNA复制许可因子Cdc10-依赖性转录物1（Cdt1）的S期起作用。^4-6在启动DNA复制之前，Cdt1与Cdc6一起作用，在来源识别复合物结合的来源上加载MCM2-7 DNA解旋酶，复制来源被许可进行复制。^2,7-9当DNA复制开始时，CRL4^抄送2被激活以泛素化Cdt1蛋白进行降解，从而阻止DNA在同一细胞周期中的重新复制。这个过程依赖于染色质结合的增殖细胞核抗原（PCNA）。PCNA被确定为DNA聚合酶的辅助因子，在复制分叉处装载，并支持各种分子的染色质复制功能。¹⁰Cdt1也与PCNA相关，但被CRL4识别^抄送2用于泛素化和蛋白质分解。^11月13日p21、Set8和胸腺嘧啶DNA糖基化酶蛋白通过与Cdt1相同的途径降解。^14-21对靶蛋白的分析导致识别出一个共同的序列，称为PIP-degron，它由一个典型的PIP盒和PIP盒内及其下游的保守氨基酸组成；问-x-x-【I/L/M/V】-T-D公司-[年/月]-[前/后]-高等真核细胞中的x-x-[K/R]-[K/R]（PIP框下划线）。^22-24

当细胞暴露于辐射或其他DNA损伤试剂时，Cdt1通过相同的PCNA-和CRL4降解^抄送2-依赖性途径。^25-30细胞暴露在紫外线（UV）照射下会导致螺旋扭曲的DNA损伤，例如环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和6–4嘧啶-嘧啶酮光产物。紫外线照射后，Cdt1在几分钟内迅速降解，主要依赖于核苷酸切除修复（NER）过程，^31,32根据这一发现，当着色性干皮病（XP）相关蛋白失活或耗尽时，Cdt1降解减弱。NER是一种多功能系统，用于修复紫外线诱导的DNA损伤。^33-35许多XP相关蛋白都参与了这一过程。DCAF蛋白DDB2最初被鉴定为紫外线损伤DNA结合蛋白（UV-DDB）复合体的一部分，包括DDB1和DDB2。中铁四局^DDB2型与CPD和（6–4）-光产物结合，泛素化XPC，并启动NER。^36,37含有UV光产物的链被NER因子（例如XPA、XPG和XPF-ERCC1）切除。³⁵PCNA通过复制因子C和大亚基RFC1（RFC1-RFC）的辅助作用加载到产生的间隙3'-OH末端包含中间体上，以促进DNA聚合酶的招募。^38,39加载的PCNA将Cdt1连接到CRL4^抄送2用于降解。^31,32

MMR在S期DNA复制过程中发挥作用，首先识别主要由Msh2/Msh6介导的新合成链中的错配，然后通过PCNA、RFC1-RFC、Mlh1/Pmas2和EXO1外切酶的功能切除并降解错配以外的链，然后再合成切除的束。^40,41最近的报告显示，一些MMR蛋白，称为非经典MMR，也在S期以外发挥作用。^42,43当缺乏血清的细胞或融合细胞，即G0/G1期的细胞，暴露于各种氧化剂或烷基化剂时，MMR蛋白作用于单-泛素PCNA并招募跨损伤合成（TLS）聚合酶。^42,43因此，MMR不仅在S期发挥作用，而且在S期之外也独立于DNA复制。

当细胞在S期外启动NER或非经典MMR反应时，复制DNA聚合酶和TLS聚合酶被招募到受损的染色质位点。^42至45一些数据表明，含有PIP-片段的蛋白质的降解对于向受损部位募集聚合酶很重要。^46,47

在本研究中，我们进一步研究了紫外线诱导的Cdt1降解。如前所述，XP-A细胞中Cdt1的快速降解减弱，但我们观察到Cdt1降解较晚（约60分钟内）。我们证明，即使在XP-A细胞中没有NER功能的情况下，MMR因子也会被募集到紫外线损伤的位点来降解Cdt1。MMR蛋白的NER-非依赖性招募揭示了MMR对S期以外G1期紫外线照射的另一方面反应。

结果

与正常细胞相比，XP-A细胞中紫外线诱导的Cdt1降解延迟

以前的报告表明，紫外线照射会导致Cdt1快速降解，这取决于NER活性。^31,32然而，在这些研究中，紫外线照射后仅在15分钟或30分钟内检测Cdt1蛋白水平。在这里，我们在稍后的时间点检测了NER缺陷细胞系XPA缺陷XP2OSSV（XP-A）中的Cdt1水平。如前所述，虽然Cdt1在正常成纤维细胞（NF）中主要在～15分钟内降解，但在XP-A细胞中30分钟时稳定检测到Cdt1(图1A). 然而，我们一致观察到，紫外线照射XP-A细胞后约60分钟，Cdt1降解(图1A). 免疫荧光分析显示同样的结果。当用Cdt1和Cyclin A抗体对异步生长的细胞进行染色时，在G1期细胞核中检测到Cdt1，而在S至G2期则降解，因此在Cyclin-A阳性细胞中不存在。¹²当细胞暴露于紫外线时，Cdt1信号在NF中在30分钟时消失。相反，在XP-A细胞中，Cdt1在30分钟时保持稳定，然后在60分钟时降解(图1B). 紫外线照射后，CyclinA水平没有变化。为了证实上述观察结果是由于XPA突变引起的，我们在将野生型XPA基因添加回XP-A细胞（XP-A[wtXPA]）后，检测了Cdt1降解。在这种类似NF的细胞系中，Cdt1在15分钟内降解，表明野生型XPA基因挽救了XP-A细胞的突变(图1C). XP-A细胞中Cdt1的延迟降解也通过CRL4介导的泛素蛋白酶体途径发生^抄送2因为蛋白酶体抑制剂MG132的处理或PCNA或Cdt2的敲除抑制了Cdt1的降解(图1D).

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图1。

紫外线照射后XP-A细胞中Cdt1的降解被延迟，并且它还依赖于PCNA和CRL4^抄送2（A）以5 J/m的紫外线照射正常成纤维细胞（NF）和XP-A细胞²并在指定的时间点收集进行Western blotting。RCC1被用作负荷控制。（B） 将盖玻片上生长的细胞照如（A）所示进行照射，并用Cdt1和Cyclin A（CyA）抗体进行染色。在指定的时间点对Cdt1（+）或Cyclin A（+）阳性的细胞进行计数，并绘制NF和XP-A细胞的频率（%）。（C） 对XP-A细胞和补充野生型XPA基因（wtXPA）的XP-A电池进行紫外线照射（5 J/m²)并在指定的时间点收集进行Western blotting（左侧面板）。紫外线照射后XP-A、XP-A（wtXOA）和NF中Cdt1降解的时间过程比较（右面板；显示了3个独立实验的平均值和标准偏差）。（D）XP-A细胞中延迟的Cdt1的降解也依赖于CRL4介导的泛素蛋白酶体途径^抄送2NF或XP-A细胞与MG132孵育，10分钟后用5 J/m的紫外线照射²并在指定的时间点（min）收集进行Western blotting（左上面板）。用指示的siRNA转染细胞培养物两次，并孵育总计3天。用5J/m的UV照射细胞²并在指定的时间点（min）收集进行Western blotting。测量了Cdt1蛋白水平，并显示了其相对量（归一化为RCC1）。荧光素酶的siRNA用作对照（siLuc）。星号表示非特定带。

PCNA、Cdt2和Cdt1在XP-A细胞的紫外线损伤部位积累，但与NF相比动力学延迟

为了研究Cdt1是否也在XP-A细胞的紫外线损伤位点降解，我们进行了微孔紫外线照射测定。在本试验中，使用紫外线通过微孔膜局部照射细胞核。用CPD抗体染色后，观察辐照部位。通过与每个蛋白和CPD的抗体共同染色，检查紫外线照射部位PCNA、Cdt2和Cdt1的积累。我们首先监测PCNA的积累。当非同步生长的未辐照细胞用洗涤剂预处理并用PCNA抗体染色时，只有S期细胞被鉴定为染色严重的细胞(图2A-三角形），而大多数PCNA阴性细胞被鉴定为G1期细胞。⁴⁸局部紫外线照射后，无论细胞类型如何，在所有细胞期均观察到CPD病灶(图2A). 在NF中，照射30分钟后检测到PCNA病灶细胞，主要代表G1期细胞。如前所述，PCNA病灶与CPD抗体共定位，表明PCNA被招募到紫外线照射部位。²⁹在NF中，病灶处的PCNA染色水平在90分钟内几乎保持不变(图2A、B、NF). 相反，XP-A细胞在30分钟时PCNA水平很低。PCNA染色水平随后逐渐增加，当Cdt1降解60分钟时，PCNA的积累更明显，但仍低于NF中的水平(图2A、B、XP-A). 将XPA基因导入XP-A细胞可以恢复Cdt1的快速降解，与此一致，XP-A（wtXPA）细胞CPD位点的PCNA染色水平恢复到NF中的水平(图2C、D). 然后，我们检查了CPD部位Cdt1的积累。在该分析中，蛋白酶体抑制剂MG132用于防止Cdt1降解。Cdt1染色在30分钟时被清楚地检测到，其水平随后在NF中增加(图2E). 与XP-A细胞中紫外线照射部位PCNA的积累平行，Cdt1的积累增加(图2E和补充图S1）。然而，与PCNA类似，XP-A细胞中的Cdt1募集延迟，信号弱于NF细胞(图2E). Cdt2也被招募到CPD位点，但像XP-A细胞中的Cdt1一样延迟（补充图S2）。

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图2。

PCNA、Cdt2和Cdt1在XP-A细胞的紫外线照射部位积聚，但在正常成纤维细胞中积聚较晚。（A） 用具有5μm孔隙的膜覆盖异步生长的正常成纤维细胞（NF）和XP-A细胞，用UV（100 J/m²; 微孔分析），并培养指定时间。细胞固定并用CPD和PCNA抗体染色。棒材，10μm。UV（-）中的白色三角形表示S相细胞（见正文）。（B） 使用ImageJ在CPD点测量PCNA强度，如（A）所示（每个时间点>25个点），并绘制平均值（任意）。（C） 将异步生长的NF、XP-A和XP-A（wtXPA）细胞如（A）中那样处理，孵育30分钟，并用CPD和PCNA抗体染色。（D） 使用ImageJ（30个点/细胞株）测量（C）中CPD部位的PCNA强度，并显示平均值（任意）。（E） 异步生长的细胞按（A）中的方法处理，并用CPD和Cdt1抗体染色。为了可视化Cdt1蛋白，在紫外线照射前10分钟将MG132添加到培养基中。棒材，5μm。在CPD部位检测细胞的Cdt1染色（每个时间点>100个位点），Cdt1阳性位点的频率显示为（%）（左侧面板）。还测量了细胞的Cdt1强度，并显示了平均值（任意）（右侧面板）。

因为XPA需要切除受损的DNA并在装载PCNA的3’OH末端产生，我们预测XP-A细胞中的PCNA装载是有缺陷的。然而，我们的发现表明，即使在XP-A细胞中，PCNA也在G1期被征募到紫外线损伤的部位，在那里Cdt1被CRL4征募和降解^抄送2事实上，XP-A细胞中PCNA的积累水平低于NF，这与观察到的XP-A电池中Cdt1在稍后的时间点降解一致。

MMR蛋白参与XP-A细胞中Cdt1的降解

因为PCNA被招募到紫外线照射的部位，甚至在XP-A细胞中，我们检查了其他DNA损伤修复途径是否能够招募PCNA并降解Cdt1。基底切除修复（BER）和MMR是其他主要修复途径。在BER途径中，受损的碱基被DNA糖基化酶清除，释放出一个由无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶Ape1识别的碱基位点。⁴⁹Msh2和Msh6相互形成异二聚体，并通过识别错配在S期MMR中发挥基础作用。^40,41此外，最近的报告显示，Msh2和Msh6也在S相之外发挥作用，对各种DNA损伤试剂作出反应。^42,43因此，我们检测了紫外线照射60分钟后CPD部位几种修复蛋白的招募情况，Ape1为BER蛋白，Msh2和Msh6为MMR蛋白。由于紫外线照射后Cdt1降解是G1期事件，我们同步了G1期细胞，并用紫外线局部照射。在NF中，Msh2和Msh6均被招募到紫外线照射部位(图3A). 同样，紫外线照射60分钟后，在XP-A细胞的CPD位点以与NF相似的频率检测到Msh2和Msh6蛋白(图3B). 在局部照射的XP-A细胞中，Msh2以大于90%的频率在PCNA病灶处共定位(图3C). 相反，XP-A细胞或HeLa细胞中的正常或共焦显微镜分析均未检测到Ape1向CPD位点的募集（补充图S3B和S3C），这表明BER途径可能不参与紫外线诱导的DNA损伤修复。我们比较了NF和XP-A细胞在CPD部位Msh2积累的动力学。在NF中，紫外线照射后15分钟，70%以上的细胞中检测到Msh2。然而，在XP-A细胞中，Msh2的募集频率及其信号强度在15分钟时较低，然后在60分钟时逐渐增加到几乎在NF中观察到的水平(图3D).

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图3。

Msh2和Msh6蛋白被招募到XP-A细胞中的紫外线照射位点。（A） 同步于G1期的细胞通过具有5-μm孔的膜局部照射（+）或不照射（-）。细胞孵育1 h，预提取，并用CPD和Msh2或Msh6抗体固定。（B） 在CPD部位检测细胞Msh2或Msh6染色。显示了Msh2或Msh6阳性的CPD位点的频率（%）（检查了>100个CPD位点）。（C） 如在（A）中处理的XP-A细胞与Msh2和PCNA共染色。92.5%的CPD位点Msh2阳性（62/67个CPD位点）。（D） 同步于G1期的细胞用紫外线（+）局部照射，并在指定的时间点用CPD和Msh2抗体染色。（−）：未经紫外线照射。检测细胞CPD和Msh2，绘制细胞与CPD和Msh2共染的频率。棒材，5μm。

因为Msh2和Msh6蛋白被招募到紫外线照射部位，甚至在XP-A细胞中，我们认为MMR蛋白参与了延迟的Cdt1降解。为了研究这种可能性，我们敲除了XP-A细胞中的每一种蛋白质，并检测了其对Cdt1降解的影响。根据免疫印迹分析，与对照细胞相似，Ape1在60分钟时在缺失Ape1的细胞中降解，这与Ape1未被招募到CPD位点的事实一致(图4A). 相反，Msh6缺失导致XP-A细胞照射后60分钟Cdt1稳定(图4A). Msh2耗竭具有相同的效果，但效果小于Msh6耗竭。免疫荧光分析证实，Msh2或Msh6（而非Ape1）的缺失阻止了XP-A细胞中Cdt1的降解(图4B). 我们对Msh2（_#2）和Msh6（_#2中）的不同小干扰RNA（siRNAs）获得了相同的结果（补充图S4）。这些发现表明MMR介导了XP-A细胞中Cdt1的降解。

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图4。

MMR参与XP-A细胞中Cdt1的降解。（A） XP-A细胞转染两次Ape1、Msh2、Msh6或荧光素酶（siLuc）的siRNA作为对照。三天后，一半的细胞培养物用5 J/m的紫外线照射²并在指定的时间段内孵化。在指定的时间点收集细胞，用Cdt1、Msh2、Msh6、Ape1和RCC1抗体进行Western印迹。测量Cdt1蛋白水平并显示其相对量。（B） XP-A细胞按（A）处理，并用Cdt1和Cyclin A（CyA）抗体固定和染色。检测细胞进行Cdt1染色，显示Cdt1阳性细胞的频率（%）。棒材，10μm。

MMR途径也有助于降解正常细胞系中的Cdt1

为了研究当XPA不存在时MMR是否会降解Cdt1，或者MMR是否独立于XPA参与Cdt1降解，我们研究了敲除XPA和/或Msh6后NF中Cdt1的降解。正如预期的那样，NF中XPA的耗尽延迟了Cdt1的降解。当Msh6在XP-A细胞中耗尽时，Msh6与Msh6共完成导致Cdt1进一步稳定(图5A). 我们使用另一种细胞系U2OS细胞获得了相同的结果(图5B). 在该细胞系中，XPA和Msh6的共同缺失导致Cdt1高度稳定。此外，仅Msh6的缺失就能将NF和U2OS细胞中的Cdt1稳定到与XPA缺失细胞中观察到的类似水平(图5A、B). 这些发现表明，MMR介导的Cdt1降解在XP-a细胞中不是一个特定的发现，而是MMR途径独立于NER途径参与了紫外线照射后正常细胞中Cdt1的降解，这发生在细胞周期的G1期。

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图5。

MMR参与正常细胞中Cdt1的降解。（A） 正常成纤维细胞（NF）转染所示的siRNA，3天后，紫外线照射（25 J/m²)并在指定的时间点收集。用Mcm6蛋白对Cdt1蛋白水平进行标准化，并显示了3个独立实验的平均值和标准偏差。（B） U2OS细胞按（A）处理并进行分析。（显示了3个独立实验的平均值和标准偏差）。（C） Cdt2–3xFLAG与MMR蛋白的相互作用。分离出Cdt2–3xFLAG–表达稳定的U2OS细胞，并用Cdt2抗体进行Western blotting检测Cdt2-3xFLAG（3xFLAG-）和内源性Cdt2（end.）的表达水平。用MG132处理U2OS细胞和表达Cdt2–3xFLAG的U2OS电池10分钟，并用紫外线照射（25 J/m²)（+）或不（−）。培养30分钟后，收集细胞，用多聚甲醛固定，并用材料和方法中描述的抗FLAG免疫沉淀。对沉淀中的指示蛋白质进行了检测。测量Msh2、Mas6和PCNA的带强度，并将其归一化为UV（−）。显示了Mas2和Mas6的3个独立实验的平均值和标准偏差。对于PCNA，显示了两次独立分析的平均值。星号表示用抗Cdt2抗体重新绘制后，Msh2条带仍然存在。

为了研究MMR如何促进Cdt1降解，我们检查了CRL4之间的相互作用^抄送2和MMR蛋白。由于我们的Cdt2抗体不能有效免疫沉淀Cdt2蛋白，我们过度表达了Cdt2–3×FLAG，并在交联处理后进行下拉分析，以稳定染色质上的蛋白复合物。在Cdt2–3×FLAG免疫沉淀物中，检测到PCNA和Msh6蛋白（补充图S5）。然后，我们分离出稳定表达Cdt2–3×FLAG的U2OS细胞，其水平与内源性Cdt2相当，并检测了有无紫外线照射的相互作用。无论紫外线照射如何，Cdt2–3×FLAG都能有效沉淀。在Cdt2–3×FLAG沉淀中，不仅检测到PCNA，而且还检测到Msh2和Msh6蛋白。紫外线照射后其水平略有增加(图5C)表明MMR蛋白和CRL4^抄送2在紫外线损伤部位相互作用，导致Cdt1降解。对照蛋白RCC1没有共沉淀。

Cdt1降解对DNA修复合成很重要

由于Cdt1迅速降解，DNA聚合酶被招募到DNA损伤部位，⁴⁴Cdt1降解对于修复受损DNA应该很重要。为了解决这个问题，我们过度表达了Cdt1，并检测了它是否抑制了局部紫外线照射位点的修复DNA合成。基于5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）的掺入，对DNA合成进行30分钟的监测。当未经辐照的HeLa细胞与EdU孵育时，仅鉴定和检测到S期细胞，因为它们的细胞核标记严重（补充图S6）。局部紫外线照射后，检测到EdU阳性斑点信号，并与CPD共定位，表明细胞中紫外线照射位点的DNA修复合成处于S期以外的阶段。然后，我们检测了过度表达Cdt1（1–101）-Cy-9myc或仅9myc作为对照后的EdU标记。为了防止SCF-Skp2介导的Cdt1降解，包括Cy突变，该突变抑制CyclinA-CDK结合和SCF-Skp2相互作用所需的后续磷酸化。¹²两个克隆的转染频率均为～40%。与仅表达9my的细胞相比，我们观察到Cdt1（1–101）-Cy-9myc转染培养物中的细胞减少或无EdU掺入(图6A; 开放箭头表示EdU掺入量低的Cdt1（1–101）-Cy-9myc表达细胞，表明Cdt1的高表达（1–101-Cy-9myc）抑制修复。为了证实这一观点，我们选择EdU点阳性的细胞，然后检查每个细胞是否表达转染的基因。计算每个基因表达转染基因的细胞频率。在仅转染9myc的细胞培养中，约40%带有EdU阳性斑点的细胞也呈myc信号阳性，与转染频率类似。另一方面，在Cdt1（1–101）-Cy-9myc转染细胞培养中，表达Cdt1(图6B). 在另一项分析中，我们检测了具有CPD斑点的细胞在Cdt1（1–101）-Cy-9myc或仅转染9myc的细胞培养物中EdU掺入是阳性还是阴性。我们发现细胞有CPD斑点，但没有或减少EdU掺入(图6C，打开箭头). Cdt1（1–101）-Cy-9myc转染细胞中此类细胞的频率高于仅转染9myc的细胞(图6D). 这些发现表明Cdt1-Cy-9myc的高表达抑制修复合成。

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图6。

Cdt1降解对DNA修复合成非常重要。（A） HeLa细胞仅转染Cdt1（1–101）-Cy-9myc或9myc。第二天，用紫外线局部照射细胞，在EdU存在下孵育30分钟，并用myc和Alexa Fluor 488叠氮化物抗体固定以检测制造商提供的EdU。开放箭头表示EdU染色较低的Cdt1（1–101）-Cy-9myc表达细胞，而填充箭头表示只有9myc的表达细胞带有EdU斑点信号。（B） 检测（A）中EdU斑点阳性细胞是否表达Cdt1（1–101）-Cy-9myc（Cdt1-Cy）或仅9myc，并显示每个转染细胞培养物中不表达（蓝色）或不表达（红色）细胞的频率（%）。显示了两次独立分析的平均值。（C） 按照A所述处理HeLa细胞，并对其进行EdU和CPD染色。开放箭头表示具有低或负EdU信号的CPD站点。（D） 检测（C）中CPD斑点阳性细胞的EdU掺入情况，并显示每个转染细胞培养物中EdU阳性（+；绿色）或阴性或低（-；白色）细胞的频率（%）。显示了两次独立分析的平均值。

讨论

当基因组DNA受到紫外线照射时，Cdt1会迅速降解。先前的研究报道，NER参与了紫外线照射后Cdt1的降解。在这里，我们证明了MMR因子也有助于G1期紫外线照射后Cdt1的降解。

细胞以细胞周期特有的方式对各种类型的DNA损伤作出反应。¹由于Cdt1仅存在于G1期，因此DNA损伤后Cdt1降解的分析为研究G1期DNA损伤反应提供了有用的手段。如本文所述，对NER-缺陷XP-A细胞的检测表明，MMR途径也在紫外线照射后降解Cdt1中起作用。尽管在之前的报告中，在XP-A细胞照射后没有立即检测到Msh2募集，⁵⁰我们注意到，大约在照射后60分钟左右，即Cdt1降解的时候，在XP-A细胞的照射部位招募并检测到Msh2和Msh6以及PCNA。XP-A细胞中MMR蛋白的缺失阻止了Cdt1的降解。我们证明MMR蛋白介导的降解对本研究中使用的XP-A细胞系没有特异性。使用正常成纤维细胞（NFs）和U2OS细胞也显示出MMR因子对紫外线照射后Cdt1降解的贡献。与XP-A细胞一样，这些细胞中XPA的耗尽延迟了Cdt1的降解。Msh6共耗尽后，Cdt1进一步稳定。值得注意的是，在NF和U2OS细胞中，仅Msh6缺失就可以像在XPA缺失的细胞中一样延迟Cdt1降解。这些发现表明，与NER途径一样，MMR途径也在G1期紫外线照射后介导Cdt1降解。

在G1期紫外线照射后，MMR对Cdt1降解有何贡献？MMR通常通过修复S期新生DNA链上形成的复制错误参与复制过程。^40,41照射后不久，Msh2蛋白以NER依赖性方式被招募到紫外线照射部位，⁵⁰这意味着MMR蛋白也可以在NER修复合成过程中纠正错配。另一方面，在G1期也观察到MMR蛋白向紫外线损伤位点的募集，这发生在缺乏XP-A的情况下(图3). 最近的报告表明，MMR蛋白也在S期外起作用，即非经典MMR。⁴³Msh2-Msh6异二聚体不仅识别错配，还识别许多DNA加合物，如顺铂、O6-甲基鸟嘌呤、2-羟基腺嘌呤和8-氧鸟嘌呤的损伤在体外.^42,51-53通过氧化或烷基化，将缺乏血清或融合细胞（即G0/G1期细胞）暴露于DNA损伤剂下，可促进PCNA依赖MMR蛋白对染色质的单泛素化。^42,43甲基硝基亚硝基胍处理导致另一种CRL4 p21降解的观察^抄送2底物，取决于G1期MMR蛋白⁵⁴表明p21降解依赖于MMR的非经典函数。因此，我们推测非经典MMR对导致Cdt1降解的紫外线诱导的DNA损伤有反应。紫外线照射除了产生主要的联嘧啶光产物外，还会引发氧化反应，从而产生8-羟基脱氧鸟苷，⁵⁵尽管本研究中使用的UV-C产生的活性氧种类少于UV-A或UV-B。MMR蛋白可能对CPD或（6–4）-光产物产生反应，如在体外使用裸DNA的实验表明，MMR蛋白与含胸腺嘧啶二元的DNA相互作用。^56,57虽然相互作用很弱，但当以核小体形式存在时，MMR蛋白可以识别这种损伤。我们预测，非经典MMR对G1期紫外线诱导的损伤有反应，导致G0/G1期细胞中形成单链间隙以加载PCNA，或者PCNA首先通过与Msh2-Msh6的直接相互作用被招募到损伤部位，因为Msh6具有PIP-box，因此CRL4^抄送2因Cdt1降解而激活。紫外线照射后，检测到Cdt2–3×FLAG与Msh2和Msh6蛋白的共同免疫沉淀。

虽然DNA复制开始后Cdt1的破坏对于防止再复制很重要，但DNA损伤后Cdt1降解的生理作用尚不清楚。我们之前证明，M期细胞对紫外线照射介导的Cdt1降解具有抵抗力，但当释放到G1期时，Cdt1被降解，且未确定来源许可。⁵⁸这些细胞比照射到G1期的细胞更有可能停滞在G1期并存活下来。⁵⁸另一方面，在G1阶段，原产地许可已经建立，因此Cdt1退化不会影响许可。Cdt1被招募到PCNA并与之相关；因此，高表达的Cdt1蛋白将掩盖PCNA以抑制修复过程。在这项研究中，我们发现Cdt1的高表达阻止了紫外线照射后的修复合成(图6). 这种作用类似于p21表达对DNA复制的抑制。^59,60复制DNA聚合酶（pol）delta和pol epsilon以及TLS pol kappa都通过NER被招募到紫外线损伤位点，⁴⁴pol-eta被招募到S期以外的紫外线损伤位点，并独立于NER。⁴⁵一贯地，Cdt1或PIP-degron Cdt1突变体的高表达阻止TLS DNA聚合酶pol-kappa和pol-eta向紫外线损伤位点募集。⁴⁶类似地，另一个CRL4的表达^Cdt2型靶点解旋酶FBH1损害DNA poleta的募集。⁴⁷这些结果与我们的观察结果一致。尽管这些发现可能代表了PIP-段肽蛋白异位表达的主要负作用，但CRL4可能^抄送2-介导的Cdt1和其他靶点的快速降解有助于DNA修复。此外，Cdt1在G1期的降解可能有助于防止再复制。一些在G1期接受紫外线照射的细胞群进入S期，⁵⁸由于修复合成或DNA损伤的持续进行，这些细胞预计会经历复制停滞。在这些情况下，Cdt1降解可能会受到影响，而刚刚发射的源代码可能会重新获得许可。因此，在G1阶段去除Cdt1有助于避免这种情况。

我们的数据表明，紫外线照射后，Cdt1降解涉及多种途径。除NER外，MMR至少在G1期对紫外线诱导的损伤有反应。这两种途径都可能起到修复损伤或相互竞争的作用。在紫外线照射的小鼠中，NER和MMR的缺陷也会导致皮肤肿瘤的发生。^61,62由于非经典MMR似乎具有诱变性，预计这种反应会增强XP患者在紫外线照射后的基因组不稳定性。因此，了解紫外线照射后S相外MMR是如何被激活的很重要。

材料和方法

补充材料

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