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神经炎杂志。2004; 1: 24.
2004年12月8日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1742-2094-1-24
PMCID公司：第53992页
PMID：15588287

尽管血管淀粉样蛋白和微出血增加，但老龄APP-转基因小鼠对Aβ的被动免疫治疗可逆转认知缺陷并消耗实质淀粉样蛋白沉积

唐娜·M·威尔科克,1 阿米恩·罗贾尼,2 阿诺·罗森塔尔,三 桑吉塔·苏巴拉奥,三 梅丽莎·弗里曼,1 马西娅·戈登,1和大卫·摩根通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

转基因小鼠中的抗-Aβ免疫治疗可减少弥漫性和致密性淀粉样沉积，改善记忆功能并清除早期磷-金聚集物。由于大多数阿尔茨海默病病例都发生在中年以后，目前的研究检查了将抗Aβ抗体过继转移到19个月和23个月大的APP-转基因小鼠。

方法

我们研究了每周抗Aβ抗体治疗对放射臂水迷宫性能、脑实质和血管淀粉样蛋白负荷以及脑内微出血的影响。19月龄小鼠接受1个月、2个月或3个月的治疗，而23月龄小鼠则接受5个月的处理。只有23个月大的小鼠接受了放射状臂水迷宫测试。

结果

每周注射3个月后，这种被动免疫方案彻底扭转了这些小鼠的学习和记忆缺陷，在5个月的治疗后，这种益处并未减弱。五个月后，弥漫性Aβ免疫染色和实质性嗜厚淀粉样蛋白沉积显著减少，这表明即使已经形成的淀粉样蛋白沉积物也容易接受免疫治疗。然而，脑淀粉样血管病在免疫治疗后显著增加，一些沉积物与微出血有关。对早期时间进程研究结果的重新分析表明，血管沉积物的增加取决于免疫治疗的持续时间。

结论

尽管存在血管淀粉样蛋白和小出血，被动免疫治疗的认知益处仍然存在。这些数据表明，评估此类治疗的临床试验需要采取预防措施，以尽量减少与微出血相关的潜在不良事件。

背景

阿尔茨海默病的特征不仅是实质淀粉样沉积和细胞内缠结，还包括血管系统中淀粉样沉积，这种情况称为脑淀粉样血管病（CAA）。在两名阿尔茨海默病患者中观察到的CAA[1]和一些转基因小鼠模型[2]主要由较短形式的淀粉样β（Aβ）、Aβ组成1–40而实质中的淀粉样沉积物主要由Aβ组成1–42虽然致密淀粉样沉积物也含有Aβ1–40.

一段时间以来，抗-Aβ免疫治疗被认为是阿尔茨海默病的潜在治疗方法[三,4]. 用aβ疫苗进行主动免疫1–42纤维蛋白发展到了人类临床试验阶段，在部分患者中，由于脑膜脑炎，纤维蛋白暂停给药[5]. 迄今为止，已有两名参与试验的患者的病理报告，他们随后死亡[6,7]. 两份报告都指出，虽然在这些病例中，实质淀粉样蛋白沉积的数量似乎低于预期，但这些患者的CAA并没有超出阿尔茨海默病的正常范围。此外，一份报告提到了多处皮质出血和CAA血管周围含铁血黄素的存在[7].

考虑到主动免疫的不良反应、这种程序的不可逆性以及老年人对疫苗的可变抗体反应[8]被动免疫Aβ肽成为一种替代性免疫治疗策略。对年轻和中年APP-转基因小鼠的研究表明，被动免疫可显著降低淀粉样蛋白[9-11]. 这些治疗也证明了APP-转基因小鼠的记忆功能快速改善，有时淀粉样蛋白没有明显减少[12-14]. 最近，颅内给予抗Aβ抗体不仅可以去除Aβ，还可以清除早期过度磷酸化的tau聚集体[15]. 重要的是，在之前唯一一项评估老年APP-转基因小鼠过继抗体转移的研究中，Pfeifer等. [16]据报道，服用N末端特异性抗aβ抗体后，脑微出血增加一倍，淀粉样蛋白负荷显著降低。

材料和方法

实验设计

来自APP Tg2576小鼠的小鼠是从我们1996年开始的南佛罗里达大学育种项目中获得的[17]. 在为期5个月的治疗研究中，将13只23个月大的APP-转基因小鼠分为两组。第一组每周腹腔注射抗Aβ抗体（抗体2286；小鼠单克隆抗人Aβ28–40IgG1；Rinat Neurosciences，加利福尼亚州帕洛阿尔托），为期5个月(n个= 6). 第二组每周腹腔注射抗AMN抗体（2906；小鼠单克隆抗体-果蝇属遗忘蛋白IgG1；Rinat Neurosciences，加利福尼亚州帕洛阿尔托）注射5个月(n个= 7). 七只非转基因小鼠也被分配到两组中的一组。第一组每周腹腔注射抗Aβ抗体，为期5个月(n个= 4). 第二组每周接受腹腔注射抗AMN抗体，为期5个月(n个= 3).

对于1个月、2个月或3个月治疗的时间进程研究，将22只19个月大的APP-转基因小鼠分为四个实验组之一，如前所述[14]. 前三组每周腹腔注射抗Aβ抗体，持续3个月、2个月或1个月，直到所有小鼠22个月大。第四组每周腹腔注射抗AMN抗体3个月。

行为分析

经过3个月和5个月的治疗，来自5个月研究的小鼠接受了为期两天的放射臂水迷宫实验。如前所述，该装置是一个6臂迷宫[18]. 在第一天，15个试验分为三个组，每组5个。每个区块按顺序运行4只小鼠的队列（即，4只小鼠中的每只获得试验一，然后相同的小鼠获得试验二，依此类推）。在每个5个试验组之后，运行第二组小鼠，允许在小鼠暴露于第二组5个试验前延长休息时间。队列中的每只老鼠的目标臂都不同，以尽量减少气味线索。每次试验的起始臂都不同，目标臂在两天内保持不变。在前11次试验中，平台交替可见，然后隐藏（在最后4次试验中隐藏）。第二天，小鼠以与第一天完全相同的方式奔跑，只是平台在所有试验中都是隐藏的。错误的数量（错误的手臂输入）是在一分钟内测量的。按照标准做法，在20秒内未能做出手臂选择的老鼠会被分配一个错误，但本研究中没有老鼠必须以这种方式分配错误。同一个人给予抗体治疗，并将小鼠置于放射臂水迷宫中。由于研究中小鼠的数量，研究人员不知道每只小鼠的治疗组身份。此外，辐射臂水迷宫任务中的依赖性测量是定量的，而不是评估性的，因此测试人员偏差的可能性降低了。为了最大限度地减少个体试验变异性的影响，对每只小鼠连续3次试验的误差进行平均，每天产生5个数据点，使用StatView（SAS Institute Inc.，NC）通过方差分析进行统计分析。

组织制备和组织学

在献祭当天，称量小鼠体重，过量服用100 mg/kg的戊巴比妥（伊利诺伊州北芝加哥的雅培实验室），然后用25 mL 0.9%氯化钠进行心内灌注。快速取出大脑，将大脑左半部浸入100 mM KPO中新制备的4%多聚甲醛中固定24小时4（pH 7.2）进行组织病理学检查。然后将半脑分别在10%、20%和30%蔗糖中培养24小时，以进行细胞保护。使用滑动切片机收集厚度为25μm的水平切片，并将其储存在4°C的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2）中，以防止微生物生长。如前所述，在整个大脑中随机选择间隔600μm的8个等距组织切片，并使用自由浮动免疫组织化学方法对总Aβ进行染色（兔多克隆抗泛Aβ；Biosource，Camarillo，CA，1:10000）[2,14]. 第二组间隔600μm的组织切片用0.2%刚果红在80%的NaCl饱和乙醇中染色。另一组切片也被安装，并用2%亚铁氰化钾在2%盐酸中染色15分钟，然后在1%中性红溶液中复染10分钟。使用Image-Pro Plus（Media-Conternetics，Silver Spring，MD）对刚果红染色和aβ免疫组化进行量化分析阳性染色所占面积百分比。对额叶皮层的一个区域和海马体的三个区域进行了分析（以确保海马体值没有区域偏差）。对刚果红进行初步分析，得出总值。在手动编辑掉所有实质淀粉样沉积物后，进行第二次分析，以获得限制血管刚果红染色的百分比区域。为了估计刚果红的实质面积，我们从总百分比中减去了血管淀粉样蛋白值。对于含铁血黄素染色，计算所有切片上普鲁士蓝阳性位点的数量，并计算每个切片的平均位点数量。在低倍镜下观察切片，我们能够观察到动物之间的质量差异；然而，面积百分比很低，以至于许多区域没有阳性染色。检查了八个等距截面，确定了阳性剖面的数量，并将其平均为每截面值。为了评估可能的治疗相关差异，通过单因素方差分析（ANOVA）和Fisher LSD平均值比较对每个治疗组的数值进行分析。

结果

被动淀粉样蛋白免疫治疗逆转认知功能障碍

辐射臂水迷宫任务检测转基因小鼠模型的空间学习和记忆缺陷[18,19]. 我们用抗Aβ抗体2286或对照抗体2906（针对果蝇属-特定蛋白），并在治疗3个月后，使用新的平台位置，在治疗5个月后再次在辐射臂水迷宫的两天版本中测试它们的空间导航学习。在这两次测试中，我们发现用对照抗体处理的APP-转基因小鼠在两天的测试中都无法学习平台位置，并且与用任何一种抗体处理的非转基因小鼠相比，它们受到了显著损害（图。​（图1）。1). 然而，服用抗Aβ抗体的APP-转基因小鼠证明了在对照治疗的APP-基因小鼠中观察到的损伤完全逆转，在第二天结束时，每次试验的平均表现接近0.5个错误（图。​（图1）。1). 尽管在小鼠28个月大时，所有组的学习速度可能稍慢，但抗Aβ抗体处理的APP没有受损。

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免疫3个月和5个月后，APP-转基因小鼠的空间学习缺陷得到了逆转。小鼠在两天的辐射臂水迷宫中进行测试。实线代表APP-转基因小鼠，虚线代表非转基因小鼠。开放符号表示抗AMN、对照抗体治疗（○：APP-转基因、对照抗体；△: 非转基因，对照抗体），而封闭符号表示抗Aβ抗体治疗（●：APP转基因，Aβ抗体；▲: 非转基因，Aβ抗体）。A组显示了免疫接种3个月后两天试验期间的平均错误数。每个数据点是3次试验的平均值。B组显示了5个月免疫接种后在2天试验期内发生的平均错误数。对于两张图，*表示第页<0.05，**表示第页当接受对照抗体的APP-转基因小鼠与其余组进行比较时，<0.001。

被动淀粉样蛋白免疫治疗清除实质Aβ沉积，但增加血管淀粉样蛋白

在之前的一项试验中，对21个月龄时死亡的APP-转基因小鼠进行1个月、2个月或3个月的被动抗aβ免疫治疗[14]我们发现弥漫性和纤维状沉积物的aβ免疫染色和纤维状淀粉样沉积物的刚果红染色均随时间而降低。在当前的研究中，我们发现aβ免疫染色也有类似的减少（表​（表1）1)和总刚果红染色（图。​（图2A，2安培，左侧面板；第页<0.001额叶皮层和第页<0.01海马）。我们注意到剩下的大部分是血管淀粉样蛋白。然后我们分别分析了血管和实质沉积物，发现实质沉积物减少了近90%(第页<0.001），但血管刚果红染色升高3-4倍(第页< 0.0001; 图。​图2A，2安培、中间和右侧面板）。我们还分别分析了我们早期研究中小鼠的血管和实质刚果红染色[14]用抗Aβ或对照抗体被动治疗1、2或3个月，结果相似。随着抗体暴露持续时间的增加，刚果红染色的整体程度逐渐降低，接近75%（如前所述；图。​图2B）。2B型). 然而，当分离成血管刚果红沉积和实质沉积时，海马和额叶皮层的血管沉积随抗体暴露时间的增加而增加（图。​（图2C；2摄氏度;第页<0.05额叶皮层和海马），相应的实质沉积减少近90%（图。​（图2D；二维;第页额叶皮层和海马区<0.001）。

表1

抗Aβ抗体治疗5个月后，总Aβ负荷显著降低。Aβ免疫组化染色阳性所占面积百分比显示为额叶皮层和海马平均值的±标准误差。还显示了抗Aβ抗体治疗后观察到的Aβ减少百分比

地区%Aβ阳性区域：对照治疗%Aβ阳性面积：抗Aβ治疗%抗Aβ抗体治疗后减少
额叶皮层34.855 ± 2.2659.681 ± 0.75472
海马23.994 ± 0.9858.212 ± 0.59666
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用抗Aβ抗体被动免疫可降低APP-转基因小鼠额叶皮质和海马的总淀粉样蛋白和实质淀粉样蛋白负荷，同时增加血管淀粉样蛋白。A组显示了5个月内注射对照IgG（C）或抗AβIgG的APP-转基因小鼠的刚果红总淀粉样蛋白负荷、血管淀粉样蛋白载量和实质淀粉样蛋白负载量。图B-D显示了给药3个月的对照IgG（Cont-IgG）或给药1个月、2个月或3个月（anti-AβIgG）的抗AβIg G转基因小鼠的总淀粉样蛋白负荷（图B）、血管淀粉样蛋白负载（图C）和实质淀粉样蛋白载量（图D）。对于所有面板，实线和实线表示来自额叶皮层的值，而开放线和虚线表示来自海马体的值**第页< 0.01.

通过检查这些小鼠切片的显微照片，可以很容易地观察到这些差异。用对照抗体治疗的小鼠偶尔出现皮层血管淀粉样沉积（22个月，图。​图3A，3A级，28个月，图。​图3C），3厘米)而注射抗Aβ抗体的小鼠血管淀粉样蛋白染色量增加（3个月的治疗，图​图3B；3B公司; 5个月治疗，图​图3D）。三维). 用抗Aβ抗体治疗后，那些含有淀粉样蛋白的血管也表现出明显的小胶质细胞活化增加，如CD45表达所测（图。​（图3F）第三层)与用对照抗体治疗的小鼠相比（图。​（图3E）。第三方). 不幸的是，抗体治疗引起的血管和实质沉积物的数量和大小的变化，使测量每个血管沉积物区域的小胶质细胞活化变得非常复杂，因此无法准确量化这种明显的染色强度增加。

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注射抗Aβ抗体后血管刚果红染色增加与激活的小胶质细胞有关。面板A和B来自22个月大的APP-转基因小鼠的额叶皮层，用对照抗体（3A）或抗Aβ抗体（3B）免疫3个月。面板C和D来自28个月大的APP-转基因小鼠的额叶皮层，用对照抗体（3C）或抗Aβ抗体（3D）免疫5个月。面板E和F显示了CD45免疫组织化学（黑色）的高倍图像，该图像用刚果红（红色）对来自28个月大的APP-转基因小鼠的CD45免疫组化（黑色）进行了复染，这些小鼠用对照抗体（面板E）或抗aβ抗体（面板F）免疫5个月。面板A-D，放大倍数=100X。面板B中的比例尺=50μ，用于面板A-D。面板E-F，放大倍数=200X。面板E中的比例尺=面板E-F中的25μm。

被动淀粉样蛋白免疫治疗导致微出血增加

我们使用普鲁士蓝组织学染色标记含铁血黄素，这是血红蛋白分解过程中产生的一种氧化铁物质。脑内的静脉外血导致红细胞的小胶质吞噬作用和红细胞内血红蛋白的分解。因此，这些含氧化铁的小胶质细胞是过去出血的标志。在未经治疗的老年APP-转基因小鼠中，我们观察到额叶皮层普鲁士蓝染色阳性的剖面很少（用中性红复染的部分；图。​图4A）。4A级). 然而，在抗Aβ抗体治疗5个月后，我们观察到额叶皮层普鲁士蓝轮廓的数量增加，在显微镜下低倍镜下很容易检测到（图。​（图4B）。4B类). 在没有抗Aβ治疗的情况下，甚至在用抗体治疗一个月时，大多数血管都没有用普鲁士蓝染色，只能使用红色复染物进行识别（图。​（图4C）。4摄氏度). 然而，即使经过3个月的抗Aβ抗体治疗，我们仍观察到血管频繁，并伴有普鲁士蓝染色（图​（图4D）。4D（四维）). 使用刚果红染色的相邻切片，我们确认所有显示微出血的血管都含有淀粉样蛋白（图。​（图4E第四版和​和4F；4楼; 我们无法用刚果红或硫黄素S对普鲁士蓝染部分进行双重标记。然而，只有少数含有淀粉样蛋白的血管显示出血。

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全身注射抗Aβ抗体后与CAA相关的微出血。面板A和B是5个月内接受对照抗体（面板A）或抗Aβ抗体（面板B）的APP-转基因小鼠额叶皮层的低倍图像。面板C和D显示了3个月内接受对照抗体（面板C）或抗Aβ抗体（面板D）的APP-转基因小鼠含有淀粉样蛋白的血管的代表性图像，这些血管被普鲁士蓝（蓝色）染色，并被中性红（红色）复染。面板E显示，一只APP转基因小鼠注射抗aβ抗体5个月后，额叶皮层的血管被普鲁士蓝（蓝色）染色，并被中性红复染。图F显示相邻切片上同样的血管被刚果红染色，表明血管实际上含有淀粉样蛋白。面板A-B的比例尺面板A=120μm。面板C-D的比例杆面板C=25μm。板F-的比例栏=25μm，面板E-F。

当我们计算那些接受对照抗体的动物的普鲁士蓝阳性谱的数量时，平均每两段有一个谱（图。​（图5）5)这一数字在两个对照组（22或28个月龄）中保持不变。在用抗Aβ抗体治疗两个月后，我们观察到普鲁士蓝染色显著增加，大约是对照组或免疫一个月的小鼠的五倍（图。​（图5，5,第页< 0.001). 在普鲁士蓝染色的初始增加后，我们观察到染色的线性增加与抗aβ抗体治疗持续时间的延长有关（图​（图5）。5). 与对照组相比，5个月的抗Aβ抗体治疗显示普鲁士蓝染色增加了6倍（图。​（图55).

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普鲁士蓝阳性谱的数量随着抗Aβ抗体暴露时间的延长而增加。该图显示了给予对照IgG 3或5个月（Cont）或抗AβIgG 1、2、3或5月（抗Aβ）的小鼠每个切片普鲁士蓝阳性谱平均数的量化**第页< 0.01.

讨论

早期针对Aβ肽的疫苗研究表明，在APP-转基因小鼠中，可以保护其免受与淀粉样蛋白积聚相关的学习和记忆缺陷的影响[14,19]. 使用抗Aβ抗体的被动免疫方案也产生了认知益处，在某些情况下，即使淀粉样蛋白负荷没有显著降低[12,13]. 我们最近的研究发现，对18个月大的APP-转基因小鼠进行3个月的抗Aβ治疗可以改善Y迷宫的自发交替性能[14]. 在本研究中，我们证实了被动抗淀粉样蛋白免疫治疗可以逆转APP-转基因小鼠的空间学习缺陷，并且免疫治疗的这种益处仍然存在，即使是在淀粉样蛋白病理学长期存在的老年小鼠（试验时为26个月和28个月大）中也是如此。

此外，我们描述了一种更快速的测试空间参考记忆的方法，以揭示APP-转基因小鼠的学习和记忆缺陷。这种为期两天的径向臂水迷宫包括更大的个体试验间隔（每次试验后，小鼠都会呆在家里的笼子里），以及更小的聚合试验间隔（每天15次试验，而不是4或5次），以便于学习非转基因小鼠的平台位置，年龄匹配的转基因小鼠明显缺乏学习能力。

在用抗Aβ抗体治疗2个月或更长时间的老年APP-转基因小鼠中，观察到总的嗜凝性淀粉样蛋白沉积显著减少。全刚果红染色的测量包括实质和血管淀粉样染色。当我们仅分析血管淀粉样蛋白（CAA）切片时，我们发现在抗Aβ抗体治疗2个月、3个月和5个月后，该指标显著增加。通过这种抗体方法，剩余的实质淀粉样蛋白负荷几乎完全消除。显然，由于总淀粉样蛋白负荷显著降低，并不是所有淀粉样蛋白都转移到血管中；但是，似乎至少有一部分亲缘物质被重新分配到了血管系统中。目前，这种再分配的机制尚不清楚。然而，有一种可能性是，小胶质细胞通过吞噬作用或表面结合与抗体蛋白化淀粉样蛋白相关，并将物质输送至血管系统，可能是为了将其排出。我们和其他人已经证明，在颅内注射抗Aβ抗体的情况下，小胶质细胞参与了淀粉样蛋白的去除[11,21]和全身注射抗Aβ抗体治疗[14]，以及体外研究[10,22]. 在这里，我们还报告了我们的印象，即免疫小鼠CAA血管周围的小胶质细胞比对照转基因小鼠表达更多的CD45。这种表达增加可能是由于相同数量的小胶质细胞表达增加或这些动物中小胶质细胞数量增加。这种小胶质细胞的激活可能只是对血管中淀粉样蛋白增加的反应。然而，同样可能的是，被调理物质激活的小胶质细胞迁移到血管以处理淀粉样蛋白。

脑淀粉样血管病（CAA）被定义为脑膜、脑动脉和小动脉（毛细血管和静脉也可显示CAA，但不太常见）中的嗜胶性物质沉积，几乎所有阿尔茨海默病患者都有一定程度的CAA[23]. 严重CAA影响约15%的病例，可能与梗死和出血性损伤有关[24,25]. 研究还表明，CAA的严重程度与阿尔茨海默病患者痴呆的严重程度直接相关[26].

在当前的研究中，我们发现普鲁士蓝染色法检测到的大脑微出血数量显著增加，这与被动免疫后CAA增加有关。另一种淀粉样蛋白沉积的转基因小鼠模型APP23小鼠已被证明在脑实质和血管中沉积淀粉样蛋白，并显示CAA相关的自发性脑出血增加[27]. 此外，Pfeifer等. [16]结果表明，使用带有N末端表位的抗Aβ抗体对21个月大的APP23小鼠进行被动免疫5个月后，这些自发性出血显著增加，这与疫苗主动免疫中的典型情况相似[4,28,29]. 按照相同的方案免疫幼鼠（6个月大）时，未观察到出血。最近，DeMattos等. [30]结果表明，用PDAPP转基因小鼠的N末端抗体（3D6：针对Aβ的1–5个氨基酸）被动免疫也导致微出血显著增加。他们无法用中区抗体（266：针对aβ的13-28氨基酸）检测到增加的微出血。值得注意的是，抗体266不能结合CAA血管或淀粉样斑块中沉积的Aβ[31]. 重要的是，费雷尔等. [7]注意到一名参与Aβ-疫苗试验的患者出现CAA和脑微出血，尽管实质淀粉样蛋白低于预期。还有，尼科尔等. [6]注意到另一名参与Aβ-疫苗试验的患者的大脑中CAA似乎未受影响。

关于转基因小鼠CAA增加和微出血的这些观察结果是否与人类被动免疫治疗试验有关，尚待确定。值得注意的是，尽管将免疫治疗期延长至5个月，但转基因小鼠的免疫治疗认知益处并未明显丧失，所有转基因小鼠的微出血都有所增加。虽然抗体266不会导致血管渗漏的观察结果鼓励了对这种独特型的测试，但苏黎世Aβ疫苗试验队列的数据表明，脑反应抗体可能对认知益处很重要[32].

结论

我们认为，这些结果表明，针对Aβ的被动免疫治疗应继续采取适当的预防措施，以最大限度地降低出血风险（例如，通过排除服用抗凝剂的患者），并制定措施，在出血确实发生时检测出血，无论抗体特异性或老年APP-转基因小鼠微出血倾向如何。

缩略语清单

Aβ：淀粉样β。

APP：淀粉样前体蛋白

CAA：脑淀粉样血管病。

IgG1：1型免疫球蛋白G。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

DMW对小鼠进行治疗，进行行为分析，处理组织并进行病理分析，并起草手稿。ARojiani评估了载玻片，并提供了关于CAA和微出血的专家意见。阿罗森塔尔和SS开发、生产和纯化了研究中使用的抗体。MJF对小鼠进行DNA提取和PCR基因分型。MNG负责监督繁殖群体产生小鼠的研究，从小鼠中采集样本，并协助编辑手稿。DM构思了研究设计，指导数据解释并协助编辑手稿。

致谢

这项工作得到了美国国立老龄研究院/NIH拨款AG15490（MNG）和AG18478（DM）的支持。DMW是阿尔茨海默病研究领域的本杰明学者。我们要感谢凯莎·西蒙兹（Keisha Symmonds），他协助组织学处理，以及内达·威尔逊（Nedda Wilson），他在研究期间负责畜牧业。我们还要感谢Lori Lutz协助编辑手稿。

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文章来自神经炎杂志由以下人员提供BMC公司