第21章：脯氨酸羟化酶-1（PHD-1）缺乏小鼠肺部神经上皮小体（NEB）增生

摘要

21.1.简介

人和动物肺的气道粘膜含有胺（5-羟色胺，5-HT）和肽产生细胞，这些细胞以孤立细胞的形式分布，称为肺神经内分泌细胞（PNEC）和神经上皮小体（NEB）。NEB广泛分布于肺内气道粘膜内，被认为是对多种腔内刺激（包括气体浓度（pO2、pCO2）和机械拉伸）作出响应的多模气道传感器(Cutz等人2007a). PNEC/NEB在胎儿/新生儿肺中数量较多，在成人肺中不太明显，表明发育调节和在围产期起关键作用。(Cutz等人，1985年,2007年a). NEB细胞是可兴奋的，并表现出缺氧感应特性，这是因为表达了一种由氧感应蛋白（NAPDH氧化酶/NOX2）与氧敏感钾离子通道耦合而成的膜分隔的氧感应复合物(Youngson等人，1993年;王德等.1996;Fu等人，2000年). 虽然NEB的确切功能目前尚不清楚，但它们被视为人体内稳态氧感应系统的一部分(Weir等人，2005年). NEB细胞的增生在慢性缺氧暴露的动物和人类肺部以及各种儿童和成人肺部疾病中均有描述(Cutz等人2007a;Cutz等人，2008年). NEB增生的机制和临床意义目前尚不清楚，需要进一步研究。目前已经证实，缺氧诱导因子-1（HIF-1α）是一种普遍存在的转录因子，调节许多参与缺氧适应性反应的基因的表达(Semenza 2009年). 脯氨酰羟化酶结构域酶（PHD 1–3）在调节缺氧反应中密切相关，它以O2依赖的方式调节HIF的稳定性，因此起到内在O2传感器的作用(Kaelin和Ratcliffe 2008). 通过免疫组织化学对PHD体内表达模式的分析表明，PHD1的表达主要局限于嗜铬粒蛋白A阳性的神经内分泌组织，如胰岛、颈动脉体和肾上腺髓质（未发表的观察结果）。此外，PHD-1在一系列神经内分泌肿瘤中强烈表达，例如肠和肺类癌、颈动脉副神经节瘤和嗜铬细胞瘤。因此，PHD1在神经内分泌组织中强烈表达，提示其在神经内分泌功能中起重要作用。为了确定PHD-1在NEB细胞中的可能作用，我们使用NEB细胞特异性免疫标记物和形态计量学方法检测了PHD-1缺陷小鼠肺部NEB的频率、数量和大小。我们的研究表明，PHD–1缺陷小鼠在围生期和成年期的肺部NEB显著增生，这表明PHD酶在NEB细胞生物学和病理生物学中具有重要作用。

21.2.方法

肺组织取自PHD-1缺陷小鼠（Egln2−/−）和野生型（WT）对照小鼠(Aragones等人2008). 将新生儿（P1-2，n=12）和成年（2个月，n=7）PHD-1缺陷和年龄匹配的WT对照小鼠的组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并使用标准程序进行免疫过氧化物酶（IP）标记法处理(Cutz等人2007b). 为了鉴定福尔马林固定石蜡切片中的NEB，我们使用Invitrogen Polymer检测系统(超级图片™聚合物检测试剂盒，Invitrogen Corp.Camarillo，CA）。作为主要抗体，我们使用了抗突触囊泡蛋白2的小鼠单克隆抗体（SV2，杂交瘤银行，爱荷华州爱荷华市；1:20稀释）、抗突触素的兔单克隆抗体和抗降钙素基因相关肽的单克隆抗体。作为二级抗体检测程序，我们使用了Invitrogen聚合物检测系统和辣根过氧化物酶（HRP）聚合物二级抗体偶联物。

对于免疫荧光（IF）染色和共焦显微镜，我们使用PHD缺乏和年龄匹配的WT对照组（分别为P1 n=4和P15 n=4）的肺组织冰冻切片（~100um），使用上述一级抗体的组织制备和免疫标记方案，如前所述(Pan等人，2006年). 使用徕卡共焦激光扫描显微镜（TCS-SPE型）和LAS-AF软件获得了双染色（德克萨斯红/FITC）整体支架中PNEC/NEB细胞、气道神经和平滑肌肌动蛋白-FITC（Sigma-Aldrich，St-Louis，MI）的荧光图像。

使用先前报告的方法进行NEB频率和大小的形态分析(Cutz等人2007b;Pan等人，2006年). 使用尼康简单PCI成像软件（IP方法）测量不同尺寸气道的综合表面积，以截面的平方毫米表示（5 um IP/100 um IF截面厚度）(Cutz等人2007b;Pan等人，2006年)和NIH-Image J程序（共焦IF图像），通过每个计数图像中的内部比例尺进行标准化(Pan等人，2006年). 为了进行统计分析，我们使用了Student’st吨-测试。

21.3.结果

21.3.1. 免疫过氧化物酶法

PHD–1缺陷小鼠的肺部整体形态与WT对照组相似，没有明显异常影响气道或肺泡腔。新生小鼠（P2）的肺切片（PHD-1缺陷组和年龄匹配的WT对照组）SV 2免疫染色显示，气道内有与NEB相对应的阳性细胞簇(图21.1a、b). 此外，支气管周围神经纤维和细神经末梢SV2也呈阳性(图21.1d，e). 高倍镜下，WT小鼠肺部的NEB通常由5到7个细胞组成(图21.1c，d)而在PHD-1缺陷小鼠中，由15–30个细胞组成的细胞体积要大得多(图21.1e，f). PHD–1缺陷小鼠的一些增生性NEB在伸入气道腔的气道分支点形成显著的细胞聚集(图21.1f). 形态计量学分析证实，与WT小鼠相比，PHD–1缺陷小鼠肺部NEB的频率和大小增加(图21.2a，b). 与WT对照组相比，PHD-1缺陷小鼠P2（2.24+/-0.4）的NEB平均频率（免疫染色面积百分比/mm2）显著增加（1.62+/-0.3；p<0.01）。同样，PHD-1缺陷小鼠的NEB大小（1494.6+/-175.3）接近WT对照小鼠的两倍（865.2+/-162.6；p<0.01）。CGRP是啮齿动物肺部NEB中的主要肽，免疫染色显示出类似于SV2的表达模式，与年龄匹配的WT对照组相比，PHD-1缺陷小鼠肺部NEB的数量和大小几乎增加了两倍(图21.2c，d). 在2个月大PHD-1缺陷小鼠的肺部，通过SV2或CGRP免疫染色评估的NEB数量和大小与WT对照组相比增加，但差异具有较低的统计学意义（p<0.05）(图21.2a、b、c、d).

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图21.1

用免疫过氧化物酶法和抗SV2抗体观察WT对照组和PHD-1缺陷小鼠肺中的NEB。(一)新生（P2）WT小鼠小气道NEB阳性肺切片低倍镜观察(带圆圈的). (b)新生儿（P2）PHD-1缺陷小鼠肺切片，放大倍数与(一)表现出更加突出的NEB(带圆圈的)分布相似。(c（c）)WT小鼠肺部小气道上皮中由免疫阳性细胞组成的两个NEB的特写。(d日)与中相同样本中的另一个小NEB(c（c）)带有免疫阳性神经纤维(箭头)粘膜下层。(e（电子）)样品的高倍视图(b)三个突出的NEB在粘膜下层形成致密的上皮内小体和免疫反应性神经纤维(箭头). (（f）)样本中大型增生性NEB的特写(b)位于气道分叉处并伸入气道管腔

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图21.2

用免疫过氧化物酶对PHD-1缺陷肺和WT对照肺NEB频率、数量和大小的形态计量学评估(一,b,c（c）,d日)和免疫荧光(e（电子）,（f）,克,小时)方法。(一)不同年龄（P2和2个月）PHD1缺陷组和WT对照组每mm2切片免疫染色（SV2抗体）面积（IMS）百分比平均值的比较。(b)与a）中相同样本的NEB大小平均值。(c（c）)CGRP免疫染色的NEB的%IMS平均值，如图所示(一)&(b). (d日)CGRP免疫染色样品中NEB大小的平均值，如(一) & (b). (e（电子）)在P2和P15，PHD-1缺陷小鼠和WT对照小鼠肺中突触素免疫反应NEB/cm2平均数的比较。(（f）)与中相同样本的NEB大小平均值(e（电子）). (克) & (小时)样品与中的相同(e（电子）) & (（f）)数值表示为NEB的IMS%(克)和NEB大小/集成区域(小时)

21.3.2. 多标签免疫荧光法

使用IF方法进行的研究证实了IP研究的结果，该研究表明，与WT年龄匹配的对照组相比，PHD-1缺陷小鼠肺中P2或P15处的NEB数量更多且更大，并且经常位于气道分支点(图21.3a).高倍镜下，PHD–1缺陷小鼠肺部的增生性NEB有时会形成一个由多达20个柱状细胞组成的上皮内排，细神经分支从底部进入(图21.3b). 相反，WT对照组肺中的NEB要小得多（约5-7个细胞），但显示出类似的神经支配模式(图21.3c). 对突触素免疫染色切片的形态计量分析证实，与年龄匹配的WT对照组相比，PHD-1缺陷小鼠的NEB数量（58.3+/-5.2 vs.34.2+/-4.3）和大小（15.3+/-3.2 vs 11.2+/-2.3）增加了两倍(图21.2e、f、g、h). 虽然与NEB和气道平滑肌相关的神经纤维更清晰可见，但PHD-1缺陷小鼠和WT小鼠的神经密度没有明显差异。

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图21.3

用多标记免疫荧光法和共焦显微镜观察PHD-1缺陷小鼠和WT对照小鼠肺切片中的NEB。(一)PHD–1缺陷小鼠（P2）突触素免疫染色肺大气道横截面的低倍镜观察(绿色)标记NEB和神经纤维，并使平滑肌肌动蛋白勾勒出气道平滑肌的轮廓(红色). 几个大型NEB(带圆圈的)存在，一些位于气道分支点(星号). (b)样品a）中的大NEB特写，免疫反应细胞紧密堆积，相邻平滑肌和NEB细胞簇底部有细小的串珠状神经纤维。(c（c）)相比之下，WT小鼠肺部的NEB明显较小；然而，粘膜下神经纤维似乎相似

21.4.讨论

我们报告了PHD-1缺陷小鼠肺部显著的NEB细胞增生。在新生儿肺部观察到NEB的数量和大小增加，并一直维持到成年，这表明NEB细胞在出生后的肺部生长和发育期间持续增生。虽然确切的机制尚不清楚，NEB细胞增生可能是前体细胞招募增加的结果，而不是由于细胞增殖增加，因为体内和体外标记研究表明，与邻近的气道上皮细胞相比，NEB细胞是一个更新缓慢的细胞群，细胞更新率低(索罗金等人，1997年). 在初步研究中，我们观察到PHD1缺陷小鼠的NEB细胞没有显示出增殖标记物MIB-1（Ki-67）的标记增加，这表明有丝分裂活性没有受到影响。在肺发育过程中，PNEC和NEB的分化均受前神经基因控制，例如ache-scute复合物的哺乳动物同源物（小鼠中为Mash-1，人类中为HASH-1）。缺乏Mash–1（Mash–1k/o）的小鼠同时缺乏PNEC和NEB(Borges等人，1997年).

最近我们发现，在小鼠肺发育的早期阶段，pO2浓度与Mash-1的表达一起调节神经内分泌细胞表型(McGovern等人，2010年). 缺氧（5%O2）条件下E12胎鼠肺的器官培养显示Mash-1表达缺失，从而显著减少PNEC的数量，而“常氧”（20%O2）培养显示Mash-1表达水平高，PNEC数量多。将低氧培养的培养物转换为常压培养会导致Mash-1表达突然增加，然后在培养物保持常压时PNEC分化。相反，缺氧对妊娠后期培养物（E16）中Mash-1的表达或PNEC的数量没有影响，表明存在锁定的发育程序。因此，缺氧促进前体细胞扩张，氧气通过Mash-1促进PNEC分化似乎是合理的。

虽然目前还不清楚调节NEB细胞中Mash-1表达的确切机制，但可能与缺氧诱导因子（HIFs 1-3）有关。脯氨酸羟化酶结构域酶（PHD1-3）通过调节HIF的表达发挥细胞O2传感器的作用，从而在健康和疾病中的氧稳态中发挥关键作用(Kaelin和Ratcliffe 2008;Appelhoff等人，2004年). 在缺氧反应方面，使用不同肿瘤细胞系的研究表明，PHD–1 mRNA水平在缺氧条件下保持不变或降低，而PHD–2和PHD–3的mRNA水平增加，尤其是PHD-3(Appelhoff等人，2004年). PHD酶的组织和细胞表达是可变的(Kaelin和Ratcliffe 2008;Appelhoff等人，2004年). 例如，心肌中PHD-3 mRNA高表达，而睾丸中PHD-1 mRNA水平升高。然而，在蛋白质水平上，PHD-2被发现在大多数被检查的小鼠器官中大量表达(Appelhoff等人，2004年). PHD同工酶在肺（或NEB细胞）中的表达和分布尚未详细研究。就生理重要性而言，PHD-2在基础条件下的氧感应中似乎至关重要，因为它在发育过程中的失活是胚胎致死性的(Kaelin和Ratcliffe 2008). 相比之下，PHD-1和PHD-3缺陷小鼠是活的，出生时看起来正常(Kaelin和Ratcliffe 2008).

PHD–1在NEB细胞增生中的确切作用以及它是否涉及氧感应机制目前尚不清楚。在氧化酶缺乏小鼠（gp91 phox，NOX2 k/o小鼠）中，一个参与急性氧感测的基因失活，即HIF非依赖性，NEB细胞对急性缺氧的反应被消除，而不会导致NEB细胞增生(Fu等人，2000年;Kazemian等人，2001年).我们假设，在PHD-1缺陷小鼠中，NEB细胞增生可通过HIF驱动的神经原基因Mash-1的上调调节介导，这反过来可能导致前体细胞的招募和分化增加（见上文）。在这种情况下，PHD–1的缺乏可以通过PHD的2和3的过度表达来补偿，特别是在缺氧条件下，因为肺是在相对缺氧的环境中发育的（胎儿pO2 20–30 mmHg）(Appelhoff等人，2004年). 这反过来可能导致HIF的产生增加和Mash-1基因下游的激活。另外，PHD功能的其他HIF-非依赖性机制也可能参与其中，因为乳腺癌细胞中的PHD–1是由雌激素诱导的，可以在体外刺激细胞增殖(Seth等人，2002年).

PNEC/NEB细胞的增生表明功能改变，已在包括支气管肺发育不良、囊性纤维化和哮喘在内的许多儿童肺部疾病中被描述(Cutz等人，2007年a).在成年人中，它与烟草引起的肺部疾病、肺纤维化和肺癌的发病机制有关(Cutz等人，2008年). 值得注意的是，PHD-1缺陷小鼠似乎是NEB细胞增生转基因动物模型的第一个例子。因此，利用PHD-1缺陷小鼠模型进行进一步研究，可能为正常条件下和各种肺部疾病中NEB细胞的功能提供机制上的见解。

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