小鼠早期酒精性肝炎肠道微生物组中酒精相关变化对中性粒细胞浸润、炎症和脂肪变性的影响

摘要

介绍

美国国家酒精滥用和酒精中毒研究所报告称，美国有1700万成年人患有酒精使用障碍，约140万成年人接受了这种障碍的治疗，每年有近8.8万人死于酒精相关原因[1]. 长期过度饮酒会导致肝硬化和酒精性肝炎，这是一种死亡率很高的疾病。急性酒精性肝炎的诱因尚未确定；然而，在酒精性肝病和其他慢性肝病的失代偿中，肠道-生命轴的重要性日益被认识到。

动物和人类的研究表明，饮酒会导致“肠漏”，细菌和微生物化合物通过肠道基底膜转移到门脉和全身循环中[1,2]. 最近，我们发现，即使在健康人中，急性酒精剂量也会增加细菌产物跨肠道屏障易位的循环标志物[三]. 此外，在人类和小鼠饮酒模型中，饮酒会导致肠道细菌失调和小肠细菌过度生长[4,5]. 肝脏是去除细菌和细菌产物的主要部位[6]通过肠屏障进入门脉循环[7]. 一旦进入肝脏，细菌产物如脂多糖（LPS）就会激活TLR-4信号通路并启动先天免疫反应，从而加剧酒精对肝细胞的主要损伤[8,9]. 急性酒精性肝炎炎症的特征性组织学特征是中性粒细胞的存在[10]. 虽然中性粒细胞在酒精性肝病中的确切作用尚未明确，但酒精性肝炎患者的临床结局与肝脏中中性粒细胞的存在相关[11].

各种动物模型在小鼠中复制了酒精性肝病的各个方面。其中，急慢性喂食模型采用含5%乙醇（按体积计）的液体饮食，持续10天，然后进行急性狂饮[12]. 该模型因其在肝脏中复制中性粒细胞浸润而受到重视，模拟了人类患者的急性脂肪性肝炎[13]但目前尚不清楚这种新模型是否复制了肠道中与酒精相关的变化，例如失调。

我们假设肠道细菌产物在急性酒精性肝炎中发挥重要作用，如小鼠脂肪性肝炎急慢性模型所示。对肠道细菌的测序显示，在这种短期喂养模式后，其组成发生了最小的变化，并确定了该属的变化阿克曼西亚作为酒精诱导的失调的早期指标。我们进一步假设肠-肝轴对中性粒细胞的浸润有特别的影响。我们发现，使用抗生素抑制肠道细菌负荷可以减少中性粒细胞浸润和肝脏的炎症反应。我们还报告说，不依赖于细菌产物的存在，肝损伤仍可能发生。总之，这些数据提供了有关肠道轴及其在酒精性肝病和常用酒精喂养模型中的作用的关键信息。

方法

结果

酒精诱导细菌群落的分类变化

虽然α-和β-多样性没有显著变化，但我们假设，在酒精喂养和配对喂养小鼠之间，急性或慢性酒精摄入后，可能存在特定的分类变化。与配对喂养的小鼠相比放线菌门显著富集(图1; d_细菌；p_放线菌，PF:0.29%vs EtOH:1.43%），而门特内里库特斯酒精喂养小鼠的相对丰度降低(图1; d_细菌；p_Tenericutes，PF:0.14%vs EtOH:0.00%）。最丰富的门，疣状克罗地亚(图1; d_细菌；p_Verrucomicrobia）在酒精喂养小鼠中表现出最大程度的降低（PF:39.54%vs EtOH:20.64%）。

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图1

酒精会引起各种细菌门的转移。

（a） 配对和酒精喂养小鼠中各种细菌门对整体肠道微生物组的比例贡献。（b） 每门细菌总数的平均百分比显示放线菌门（海军蓝）。门特内里库特斯（米色）在酒精喂养小鼠中相对丰度降低。门疣状克罗地亚（淡蓝色）是成对喂养小鼠中大多数细菌的代表，在急性-慢性乙醇模型中减少。前缀字母后跟下划线表示分类级别（例如，“d_”表示域，“p_”表示门，等等）。*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

对样本集中9个最丰富的家庭的调查(图2a)结果表明，盲肠内容物最丰富的科是疣状疣菌科，与双喂组相比，在饮酒动物中显著减少。其他在酒精喂养小鼠中丰度降低的家族包括Lachnospiraceae和Moraxellaceae（绿色星号），而优杆菌科在酒精喂养的小鼠中富集（红色星号）。对Verrucomicrobiaceae科的属组成的检查显示只有一个属，阿克曼西亚这解释了在酒精喂养的小鼠中观察到的从疣状瘤菌门（Verrucomicrobia）到属水平的减少(图2b). 该分析确定了阿克曼西亚作为酒精引起肠道微生物群变化的早期标志物。

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图2

在9个最丰富的细菌家族中，酒精会改变某些家族的社区代表性。

（a） 为了代表成对和酗酒小鼠盲肠内容物中细菌组成的子集，我们选择了9个最丰富的家族，每个家族占所有家族的0.5%以上。在配对喂养的小鼠中，那些差异富集的物质用绿色星号表示；红色星号表示家庭中富含酒精喂养小鼠。（b） 这个属阿克曼西亚代表家庭的100%疣状疣是在配对喂养的小鼠中发现的最丰富的家族，并且通过酒精摄入显著减少。前缀字母后跟下划线表示分类级别（例如，“p_”表示门，“c_”表示类，等等）。*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

抗生素治疗可降低血清内毒素和肠道细菌负荷

肠道微生物群和细菌产物参与酒精性肝病的发病机制[19,20]. 为了直接测试肠道细菌负荷对酒精诱导炎症的影响，我们首先使用抗生素鸡尾酒来减少肠道菌群。在一项初步研究中，我们发现小鼠对含有溶解抗生素鸡尾酒的饮用水产生了反感，其他人也观察到了这一点[21]. 因此，我们改为每天两次的口服灌胃方案，以确保足够的细菌清除。抗生素在液体饮食适应的第一天开始使用，并在整个酒精喂养过程中持续使用。抗生素治疗对每日酒精饮食摄入量没有影响（乙醇-饲料：9.1±0.6 mL/天/只小鼠；乙醇-饲料加抗生素：8.7±0.2 mL/日/只小鼠，p=0.14）。服用抗生素后喂食结束时，血清内毒素降低(图3a). 直接从肛门采集的粪便样本置于非选择性琼脂平板上。抗生素治疗小鼠中菌落形成单位（CFU）数量显著减少(图3b)确认肠道细菌净化。

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图3

抗生素成功地减少了肠道细菌负荷和循环内毒素。

（a） 抗生素治疗可降低体循环中检测到的内毒素水平，并消除与饮酒相关的任何增加。（b） 抗生素降低了肠道细菌负荷，肠道细菌负荷是通过牺牲前直接从肛门粪便中采集的菌落形成单位来测量的。*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

肠道细菌负荷减少的小鼠肝脏中性粒细胞浸润减弱

在确定细菌负荷和循环LPS减少后，我们假设这可能会减少肝脏炎症。为了验证这一点，我们测量了中性粒细胞相关基因的肝脏mRNA表达，包括E-选择素（与中性粒细胞吸引有关），赖氨酸6克（中性粒细胞特异性标记物）和髓过氧化物酶(Mpo公司; 中性粒细胞吞噬物质的酶）。E-选择素虽然抗生素降低了其表达，但与双喂加抗生素的小鼠相比，经酒精抗生素治疗的小鼠确实表现出增加，但酒精并没有显著增加。增长趋势赖氨酸6克酒精喂养小鼠经抗生素肠道净化后，酒精摄入后的表达（p=0.052）并未消失。肝脏Mpo公司抗生素降低了对照组和酒精喂养小鼠的mRNA表达(图4a-4c). MPO免疫组织化学染色证实，饮酒后肝脏中性粒细胞增多。用抗生素治疗的双喂小鼠基线时中性粒细胞数量较少（p=0.10），而用抗生素治疗后的小鼠可免受酒精诱导的肝内浸润性中性粒细胞增加的影响(图4d和4e).

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图4

肠道细菌负荷减少的小鼠中，中性粒细胞对肝脏的浸润减弱。

（a-c）中性粒细胞相关基因的肝脏表达E-选择素,赖氨酸6克和Mpo公司用qPCR检测并归一化为18S。（e） MPO免疫组化染色检测肝实质中的中性粒细胞，结果显示，与双喂组相比，酒精喂养组小鼠的中性粒淋巴细胞/面积增加，肠道细菌负荷减少导致浸润性中性粒细胞减少。有趣的是，在配对喂养的小鼠中，抗生素也会导致基线时肝中性粒细胞的减少趋势（在（d）中量化）。*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

肠道净化可减少酒精诱导的肝脏和循环中的炎症介质

肝脏炎症是人类和动物模型中酒精性肝炎发病机制的主要组成部分。为了测试肝脏炎症是否由细菌负荷介导，我们通过qPCR检测了肝组织中关键细胞因子和趋化因子的转录物。的表达式Tnfα,Cxcl1公司和Mcp-1型与配对喂养对照组相比，酒精喂养小鼠的mRNA水平升高（p<0.05）Tnfα,Mcp-1型; p<0.1适用于Cxcl1公司). 重要的是Tnfα和Cxcl1公司在酒精喂养的小鼠中通过抗生素治疗被消除(图5a-5c). 血清中循环MCP-1蛋白显示酒精诱导的增加，而肠道细菌的抗生素减少减轻了这种增加，这表明肠道净化对酒精性肝炎的肝脏炎症有重要影响(图5d). 总之，这些数据表明，抗生素治疗减少了MCP-1的循环和炎症标志物的表达。

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图5

抗生素治疗可减少肝脏和循环中炎症介质的表达。

（a-b）细胞因子的肝脏表达Tnfα和趋化因子Cxcl-1型酒精和抗生素可以消除这些增加。（c） 尽管mRNA水平Mcp-1型在抗生素治疗/未治疗的酒精喂养组之间没有差异，（d）在酒精喂养的抗生素治疗的小鼠中循环MCP-1蛋白减少。*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

抑制细菌负荷可降低酒精诱导的肝脂肪变性，但不能降低血清转氨酶

抗生素治疗导致促炎信号减少，这表明酒精性肝病的其他方面，如肝脂肪变性，也可能受到影响。为了验证这一点，我们使用油红-O染色法，观察到与配对喂养的小鼠相比，酒精喂养的小鼠肝脏脂肪变性增加。然而，抗生素治疗减少了酒精相关脂肪变性的增加(图6a和6b). 为了研究酒精和抗生素治疗对脂质调节和合成的影响，我们测量了脂质代谢中各种肝脏基因的mRNA水平(图6c). 酒精喂养降低脂肪酸合成酶的表达(Fasn公司)，解偶联蛋白-1(Ucp1单位)，PR域锌指蛋白16(项目16)，硬脂酰辅酶A去饱和酶2(Scd2号机组). 无论饮酒与否，抗生素治疗也会降低Fasn公司,Ucp1单位、和项目16而抗生素和乙醇的用量进一步减少Scd2号机组与抗生素加配对喂养相比。脂肪分化相关蛋白(阿德普)是一种包裹细胞内脂质和脂蛋白-2的分子(液化天然气2)参与细胞内脂质转运。Adrp公司无论抗生素治疗和液化天然气2在酒精喂养的动物中呈增加趋势（p=0.10），在酒精加抗生素小鼠中显著增加，反映了酒精喂养动物肝脏油Red-O的增加。血清丙氨酸（ALT；图6d)天冬氨酸（AST）；图6e)与对照组相比，饮酒组小鼠的转氨酶升高，表明肝细胞受损。有趣的是，在接受抗生素治疗的暴饮酒精的小鼠10天后，血清ALT水平仍然升高，这表明酒精诱导肝细胞损伤的微生物依赖性机制。

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图6

肠道消毒可以减少因饮酒而引起的脂肪增多，而不是血清转氨酶升高。

（a-b）肝脏切片上的油红O染色显示，酒精导致肝脂肪变性急剧增加。（c） 脂肪酸合成酶等脂质代谢相关基因的肝脏mRNA表达(Fasn公司)，解偶联蛋白-1(Ucp1单位)，PR域锌指蛋白16(项目16)，硬脂酰辅酶A去饱和酶2(Scd2号机组)，脂肪分化相关蛋白(阿德普)和脂蛋白-2(液化天然气2)用qPCR检测。（d） 血清丙氨酸（ALT）和（e）天门冬氨酸（AST）转氨酶在急性酒精和慢性酒精作用下升高，但抗生素治疗后无变化。对于（c），不共享一个字母的组有显著差异；*经Mann-Whitney检验，p<0.05。

讨论

这项研究首次揭示了早期急性酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中微生物组的变化。该模型不会导致酒精和双喂小鼠肠道细菌群落的α多样性或β多样性的差异。然而，特定的分类变化确实反映了酗酒小鼠细菌群落组成的重要变化，并代表了发展为酒精性肝病的早期指标。具体来说，我们确定阿克曼西亚酒精诱导的肠道失调的早期变化。我们的数据还揭示了肠道细菌负荷对肝脏中性粒细胞浸润、炎症信号和脂肪变性的影响。

我们的研究使用了持续十天的急性和慢性喂养。其他人研究了长期饮酒范式中微生物群的变化，并观察到了稍后时间点的α和β多样性变化。在一项这样的研究中[22]，在饮酒六周后，喂食酒精的小鼠的多样性测量值增加，而早期时间点未进行调查。同样的研究也显示了与我们的粪便样本相似的趋势，包括饮酒后放线菌门的适度增加。这些相似之处特别有趣，因为该研究分析了粪便中的细菌含量，同时我们检查了盲肠中的细菌。在一个使用7天胃内酒精灌注的短期酒精暴露模型中，Wang等人描述了酒精灌注小鼠和对照小鼠之间β多样性的增加[23]. 然而，胃内输注模型与我们研究中使用的口服Lieber-DeCarli液体饮食有显著差异，其中仅使用食用方法就可以解释差异性结果。

在盲肠内容物分析中，我们观察了酒精喂养和配对喂养小鼠之间的各种分类变化。在这些变化中，疣状瘤菌门主要由阿克曼西亚而它的丰度因饮酒而急剧下降。对其他研究的仔细调查证实了这一发现[23]并对该属在酒精破坏的肠道屏障维持中的潜在重要性进行了展望。的确，阿克曼西亚已经发现在肥胖和2型糖尿病的小鼠模型中可以减少，而补充细菌可以减轻代谢功能障碍的负担[24].

除了酒精对盲肠细菌群落变化的影响外，我们还研究了细菌总负荷对脂肪性肝炎标志物的作用，结果表明，肠道细菌负荷减少可减弱免疫细胞浸润、脂肪堆积和肝脏炎症。免疫细胞，尤其是中性粒细胞的浸润是酒精领域急慢性模型的关键组成部分[13,25]. 然而，中性粒细胞是否参与修复损伤，或其存在是否导致肝脏损伤，这一问题仍然很重要。在这里，我们通过使用抗生素来减少中性粒细胞在肝脏的浸润，而不保护肝脏免受损伤（血清ALT/AST转氨酶升高）。Bertola等人使用抗中性粒细胞（抗Ly6G）抗体部分证实了这一点，并显示中性粒细胞浸润到肝脏的现象几乎完全消除，但仅部分保护了转氨酶升高[13]. 尽管保护肝脏免受中性粒细胞等炎症细胞的浸润，但ALT和AST持续升高的一个可能解释来自喂养模型的性质。这种急性-慢性模型包括喂食10天后口服大剂量乙醇。无论是否存在其他损伤或病原体相关信号，这种大剂量酒精在短时间内的代谢都可能导致肝细胞损伤和转氨酶释放。对循环细菌成分（如内毒素/LPS）的抑制减少了肝脏中的炎症信号传导，而炎症信号传导通常会将中性粒细胞等免疫细胞吸引到肝损伤部位。

我们描述了抗生素介导的细菌负荷减少在酒精诱导的炎症信号、脂肪变性和肝脏中性粒细胞浸润中的保护作用。减少循环细菌产物，如内毒素(图3b)，可能通过TLR-4和随后的炎症信号减少信号[8,9]. 此外，抗生素治疗小鼠循环中MCP-1蛋白的减少可能有助于保护其免受酒精诱导的脂肪变性，正如我们之前所报道的，MCP-1在促进脂质积累方面的作用[26].

为了进一步研究酒精和细菌减少对脂肪变性的影响，我们测量了与脂肪代谢和脂质调节相关的肝脏转录物的mRNA水平。有趣的是，我们发现乙醇降低了脂肪酸合成酶的表达(Fasn公司)，解偶联蛋白-1(Ucp1单位)，PR域锌指蛋白16(项目16)，硬脂酰辅酶A去饱和酶2(Scd2号机组). 与不使用抗生素的配对喂养小鼠相比，抗生素治疗也降低了这些基因的表达。抗生素对基因的抑制与其他研究一致，这些研究表明，抗生素治疗会对肝脏脂肪堆积产生负面影响[27].

脂肪分化相关蛋白(阿德普)和脂蛋白-2(液化天然气2)两者都参与细胞内积累的脂质的储存和运输。他们增加了表情(液化天然气2p=0.10），与配对喂养的动物相比，无论抗生素治疗如何，都反映了组织学上观察到的细胞内脂质储存增加。因此，我们观察到，在这种喂养模型中，调节脂质生成的基因往往受到抗生素和酒精的抑制，而与调节脂质储存相关的基因(Adrp公司,液化天然气2)被升高以补偿乙醇诱导的脂肪积累。

许多有趣的发现与在无菌小鼠身上观察到的发现相矛盾[28]在急性酒精暴露模型中，与传统小鼠相比，其肝脏损伤、炎症和脂肪变性明显加重。在该研究中，无菌小鼠单次灌胃3g/kg乙醇，并在9小时后处死（相比之下，我们在液体饮食中治疗10天的5%乙醇，并于9小时后最终灌胃5g/kg）。这种较低的乙醇剂量仅诱导了酒精喂养的常规（细菌活性）小鼠血清ALT、脂肪变性和炎症细胞因子表达的轻微变化。此外，虽然我们使用抗生素治疗成功地减少了肠道细菌负荷，但一些肠道微生物仍然存在(图3a). 剩余的细菌成分可能含有保护性物种（尽管由于细菌DNA产量低，我们无法对这些种群进行测序），或者剩余的细菌可能在肠道代谢或屏障维持中发挥体内平衡功能[29].

在我们的研究中，尽管与长期饮酒相比，肠道细菌群落相对稳定（即多样性没有显著变化），但我们观察到酒精喂养小鼠肝脏的变化，包括炎症细胞因子表达、肝损伤标记物升高和免疫细胞浸润[22]. 这表明，虽然酒精性肝病的某些特征可能与长期肠道细菌组成的变化有关，但还有其他特征，如炎症信号和免疫细胞浸润以及肝细胞损伤，这些特征可能与细菌多样性变化无关。在这里，我们对肠道微生物组在早期酒精性脂肪性肝炎中的作用提供了关键的线索，并为未来对肠肝轴的研究提供了新的关注途径。

结论

这项研究支持以下假设：饮酒会影响肠道微生物群，急慢性喂养模式会在多个分类水平上改变微生物群落。我们的结论是，肠道微生物会影响酒精摄入后的肝脏炎症、中性粒细胞浸润和肝脏脂肪变性，这些数据进一步强调了肠道轴，甚至在早期酒精诱导的炎症中也是如此。

致谢

资金筹措表

本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家酒精滥用和酒精中毒研究所的支持，授予编号为5R01AA017729-05（发给G.S.）和F30AA024680（发给P.L.）。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

我们的16S rDNA测序数据可以在NCBI GenBank数据库中找到，其登录号为：KY571432-KY572675。

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