先前使用双光子荧光寿命成像（2pFLIM）结合基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器的研究表明，Rho-GTPases Cdc42和RhoA在sLTP期间具有不同的空间分布，Cdc42表现出突触受限的活性，RhoA表现出弥漫的异突触模式三为了更全面地了解sLTP期间Rho GTPase活性的时空模式，我们根据Cdc42和RhoA传感器的设计，为Rac1开发了基于FRET的传感器三(; 中的验证,,). 我们使用生物发射技术用传感器转染大鼠器官型海马切片10,11并使用2pFLIM成像CA1锥体神经元12当用双光子谷氨酸去钙在单个树突棘中诱导sLTP时13,14()，Rac1在受刺激的脊椎中迅速（约1分钟内）激活，并保持活性至少30分钟()明显显示出比RhoA或Cdc42更明显的持续相位（参考。三). 这种活化最初表现出有限的扩散，然后慢慢扩散到母枝晶的~10μm上，直到与脊椎中的活性几乎相等(,). 与Cdc42和RhoA类似，Rac1的激活依赖于NMDAR(N个-甲基-d-天冬氨酸受体）和CaMKII()，并且Rac1的药理学抑制和Rac1的单细胞敲除都抑制sLTP(). 因此，与RhoA和Cdc42一样，Rac1是一种连接NMDAR–CaMKII信号传导和sLTP的Rho-GTPase分子。
Rho GTPases Rac1和Cdc42跨同突触和异突触域传递突触后BDNF–TrkB信号一，Rac1传感器示意图。单体增强型绿色荧光蛋白（eGFP）被N端标记到Rac1以保持C端膜的结合。GTP结合导致与PAK2的Pak GTPase结合域关联R71C、S78A（PBD2；蓝线表示突变），使mCherry（mCh）荧光团位于eGFP的FRET距离内，降低其荧光寿命。
b条，利用双光子谷氨酸开盖（白色箭头）在单个脊柱中诱导sLTP期间树突Rac1激活的代表性2pFLIM图像。比例尺，1μm。
c（c），受刺激脊柱（黑色）中双光子谷氨酸去盖（灰色窗口）诱导sLTP期间脊柱体积变化的时间进程，并与相邻脊柱（绿色）进行比较。n个=102个细胞/121个棘。
天，sLTP期间Rac1激活的时间进程，测量为受刺激脊椎（黑色）、附近脊椎（绿色）、受刺激脊柱附近的树突（青色）和图像中整个树突（灰色）中受体结合eGFP–Rac1比例的变化。n个=102/121（细胞/棘）。
e（电子），激活Rac1(n个=56/79），Cdc42(n个=25/38），RhoA(n个=21/23）和TrkB(n个=48/52）（细胞/棘）在树突中，作为与受刺激棘（线）基底距离的函数，在受刺激棘中（圆）。
（f），Rho GTPase激活对突触后合成的BDNF的依赖性。蓝色表示Cre重组酶在Bdnf公司飞行/飞行与Rac1一起切片（左；n个=7/13克朗−,n个=8/16克朗+)，Cdc42（中间；n个=5/12克朗−,n个=4/11克+)或RhoA（右；n个=6/13克朗−,n个=7/14克朗+)（细胞/棘）传感器。黑色表示相应的控件（Cre−)数据。
克，数据摘要来自（f）条形图表示刺激后1-2分钟激活的平均值。误差条代表标准误差*P（P）<0.05（双尾吨-组间测试）+P（P）< 0.05 (吨-与基线相比的测试）。
接下来我们检查了突触后BDNF15还链接NMDAR–CaMKII信令和sLTP，这是sLTP期间Rho GTPase激活所必需的。为此，我们使用了单细胞敲除技术15,16BDNF条件敲除小鼠的器官型海马切片(Bdnf公司飞行/飞行)17,36结合Cre重组酶和Rho GTPase传感器的生物转染。我们发现，在sLTP期间，突触后BDNF的去除显著减弱了Rac1和Cdc42的激活，而不影响RhoA()，并减少sLTP的相关表达15(). 这表明Rac1和Cdc42，而不是RhoA，是突触后BDNF的下游。同样，添加细胞外BDNF清除剂TrkB-Ig（2μg ml−1)显著减弱Rac1和Cdc42的激活(). 最后，使用Trkb公司飞行/飞行（也称为Ntrk2号机组飞行/飞行)小鼠也显著减弱Rac1和Cdc42的激活(). 这些结果表明，自分泌型BDNF–TrkB系统控制Rac1和Cdc42的激活，从而指示与可塑性相关的两个不同的空间信号域：一个包含BDNF-TrkB–Cdc42（脊髓特异性域）和一个包含BNF–TrkB-Rac1（弥漫性域）。由于在sLTP期间BDNF–TrkB信号优先富集于受激脊髓(,)，Rac1分子的扩散()或TrkB下游的Rac1激活剂7,18可能导致了Rac1活性的扩散。相比之下，Cdc42（衰变前）在同一时间段的空间扩散与TrkB相似().
值得注意的是，Rac1扩散的长度尺度与突触串扰的长度尺度相似，在这种现象中，sLTP诱导短暂促进了同一树突上邻近（约5-10μm）棘的sLTP19,20因此，我们接下来讨论BDNF–TrkB–Rac1信令是否会导致这种串扰。与以往研究一致19,20一个阈上sLTP刺激传递到一个脊柱，随后在附近（≤~5μm）的脊柱产生阈下刺激，从而诱发sLTP（以下简称串扰）(). 为了测试串扰是否需要BDNF–TrkB–Rac1信号，我们首先使用了该通路的部分药理抑制。尽管BDNF信号的强烈抑制已被证明会损害sLTP15，我们发现低浓度（0.25μg ml−1)TrkB-Ig保存的sLTP（Δ五超持续的=58±13%（平均值±s.e.m.），其中五表示脊柱体积），但衰减的串扰（Δ五亚持续的=20±8%），表明该过程需要BDNF(). 为了确保这些影响是由于通过TrkB的BDNF信号传导所致，我们使用Trkb公司F616A型突变小鼠，其中包含一个点突变，使TrkB特别容易受到小分子1NMPP1的抑制（参考。21). 我们发现低浓度（0.125μM）的1NMPP1在Trkb公司F616A型切片在不影响sLTP（Δ五超持续= 59 ± 16%, Δ五亚持续的= 9 ± 8%) (). 有趣的是，微弱的BDNF–TrkB抑制也会在串扰诱导的时间范围内（1–2分钟）降低树突状轴中的Rac1活性，而不会抑制受刺激脊髓中的活性(). 同样，高浓度的Rac1抑制剂NSC-23766显著降低sLTP()，小浓度（15μM）抑制了串扰，但不显著影响sLTP（Δ五超持续= 48 ± 12%, Δ五亚持续的= 12 ± 10%) (). 该NSC-23766浓度也趋向于降低轴中Rac1的激活(). 这些数据表明，BDNF启动了一个能够降低结构塑性阈值的信号级联，这与之前的报告一致，这些报告暗示BDNF参与了类似现象22的确，外源性BDNF（20 ng ml−1)应用约10–15分钟，使阈下刺激单独诱导sLTP（Δ五亚持续的= 119 ± 31%) (). 值得注意的是，BDNF单独应用足以激活Rac1和Cdc42，但对脊柱体积没有显著影响()表明BDNF对sLTP有促进作用，但不足。综上所述，这些结果表明，在sLTP诱导期间，在单个脊椎中启动的BDNF–TrkB–Rac1信号能够促进邻近脊椎中的sLTP，从而允许突触串扰。
突触串扰需要BDNF-TrkB-Rac1信号一，左侧，串扰模型示意图。最重要的是，在“非配对”试验中，阈下（亚）刺激被传递到单个脊柱。底部，在“配对”（串扰）条件下，在将阈下刺激传递到同一树突上的相邻脊椎之前，先将阈值刺激传递到脊椎。右侧，非成对（顶部）和成对（底部）阈下刺激的代表性图像。比例尺，1μm。
b条，未成对体积变化的量化（顶部；n个=24/27超阈值（上），n个=25/29 sub）（细胞/棘）和成对（底部；n个=35/47）（细胞/脊柱对）刺激。黑色和灰色三角形分别表示阈上和阈下刺激。
c（c），0.25μg ml的效果−1TrkB-Ig与突触串扰。n个=6/13（细胞/脊柱对）。
天，0.125μM 1NMPP1对神经突触串扰的影响Trkb公司F616A型老鼠。n个=5/10（细胞/脊柱对）。
e（电子），Rac1抑制剂NSC-23766（NSC；15μM）对突触串扰的影响。n个=6/10（细胞/脊柱对）。
（f），20 ng ml的效果−1阈下刺激后BDNF对脊柱体积的影响。n个=6/6 sub，n个=6/7分加BDNF。
克，总结b条–（f）添加Rac1抑制剂EHT-1864（EHT；n个= 7/12; 细胞/脊椎对）和Trkb基因F616A型没有1NMPP1的细胞(Trkb公司F616A型ctrl；n个= 5/7; 细胞/脊柱对）显示sLTP短暂（刺激后1-2分钟）和持续（刺激后>10分钟）阶段的平均值。左边，用阈值刺激刺激脊椎。右，脊髓受到未配对或配对阈下刺激*P（P）<0.05（Dunnet检验，与“配对”阈下刺激标准相比，串扰“控制”）#P（P）<0.05（双尾吨-测试，与每个条件的配对串扰控制）。
为了更具体地探究突触串扰对异突触Rac1活性的需求，我们设计了一种策略来阻断在sLTP过程中从受刺激脊柱扩散的Rac1活性：我们限制了Rac1抑制肽W56（参考文献。23)通过将其融合到MAP2的微管结合结构域（MTBD），将抑制剂浓缩到树枝状富集的微管24,25(,). 这种结构物W56–mCh–MTBD（其中mCh表示mCherry）集中在树突轴中，不包括在棘中(). 我们发现，该抑制剂显著降低了树突轴中Rac1的激活，同时在很大程度上保留了其在受刺激脊柱中的激活(). 相比之下，没有MTBD的W56–mCh导致Rac1激活的全球减少(). 当W56肽被打乱（scr–mCh–MTBD）时，Rac1活性扩散是正常的(). 最后，W56–mCh–MTBD没有改变RhoA的空间扩散(). 这些结果表明，W56–mCh–MTBD特异性抑制Rac1活性向树突扩散。
抑制Rac1和RhoA的信号传播防止突触串扰一，树突状Rac1抑制剂结构示意图。W56通过中间连接序列（波浪线）与人MAP2的mCh和微管结合域（MTBD）融合。
b条，Rac1传感器激活配置文件上W56–mCh–MTBD（W56–MTBD-底部）或加扰控制（scr–MTBD/顶部）影响的典型2pFLIM图像。比例尺，1μm。
c（c），量化加扰控制中Rac1的扩散（左；n个=10/17）与W56–mCh–MTBD（中间；n个=22/36）（细胞/枝晶）。数据表示在指定的时间段内，树突中的结合分数随与受刺激脊椎（线）和受刺激脊柱（圈）之间距离的变化而变化。右，刺激后1-2分钟，在W56–mCh–MTBD存在下，Rac1信号在指示的空间窗口中传播*P（P）<0.05，双尾吨-测试。
天，树突状RhoA抑制剂，显性阴性（DN）RhoA–mCh–MTBD的示意图。
e（电子），代表性的2pFLIM图像，显示DNRhoA–mCh–MTBD表达对RhoA传感器（底部）与加扰控制（顶部）激活曲线的影响。比例尺，1μm。
（f），量化RhoA在控制中的传播(n个=8/17）与DNRhoA–mCh–MTBD(n个=11/18）（细胞/树突）。右，RhoA传播数据摘要*P（P）<0.05，双尾吨-测试。
克，W56–mCh–MTBD的影响（左；n个=30/47）与scr–mCh–MTBD（右；n个=14/17）（细胞/脊柱对）。突触串扰的表达。
小时，DNRhoA–mCh–MTBD的影响（左；n个=14/26）和DNCdc42–mCh–MTBD（右侧；n个=10/15）（细胞/脊椎对）。我，串扰实验总结。对，串扰脊椎的平均值。左侧，第一根脊椎（'LTP'）的平均值*P（P）<0.05，Dunnet检验，与eGFP对照组相比。
与Rac1活性扩散是突触串扰所必需的假设相一致，W56–mCh–MTBD的表达减少了串扰，但没有显著影响sLTP(). 相比之下，scr–mCh–MTBD的类似表达水平既不影响sLTP也不影响串扰(,). 为了进一步测试这种操作的特异性，我们将Rac1特异性GTPase激活蛋白ARHGAP15（参考文献。26)至MTBD。这种结构还可以减少Rac1活性的扩散，而不会显著影响脊椎的激活，并且可以抑制串扰，而不会影响sLTP(). 因此，树突轴中Rac1的激活对于突触串扰是必要的。
由于RhoA激活在sLTP期间也会扩散到附近的脊髓，我们接下来测试了这种BDNF依赖信号是否也是突触串扰所必需的。为此，我们将显性负RhoA（DNRhoA）连接到mCh–MTBD(). 表达DNRhoA–mCh–MTBD显著减少了部分RhoA活性的扩散()，并且在不显著影响sLTP（Δ五超持续= 66 ± 6%, Δ五亚持续的= 21 ± 6%) (). 重要的是，对Cdc42使用相同的策略（其活性在脊髓中划分）对sLTP或串扰（Δ五超持续= 60 ± 7%, Δ五亚持续的=56±6%）()这表明该方法仅在靶向具有扩散激活特征的蛋白质时有效。综上所述，这些数据表明，BDNF-依赖性Rac1信号和BDNF依赖性RhoA信号在附近脊椎的汇聚为这些区域提供了促进结构塑性的基础。
为了研究尽管信号传播仅激活了GTPase的一个子集，但串扰是如何实现的，我们测量了Rho GTPase对未配对和配对阈上和阈下刺激的激活(; 看见响应可变性和和阈下刺激的体积曲线）。我们发现，RhoA和Rac1都表现出扩散活性，仅被未配对的阈下刺激微弱激活(). 然而，当与附近的超阈值刺激配对时，信号扩散为串扰棘提供了额外的Rac1和RhoA激活(). 相比之下，在未配对和配对条件下，Cdc42均被阈下刺激强烈激活，从而解释了相邻脊髓在串扰期间如何达到所需的Cdc42激活水平(). 因此，通过结合低阈值、脊髓特异性Cdc42激活和附近sLTP提供的RhoA/Rac1信号传播，Rho-GTPase信号补充有助于检测sLTP位点附近的弱突触活动。值得注意的是，弱刺激也会导致适度水平的BDNF释放（通过融合到pH敏感荧光团超黄道pHfluorin的BDNF-SEP测量）和TrkB激活，支持这一观点，即在弱刺激期间，该途径仍然起作用().
信号传播在突触串扰期间提供高阈值信号的附加激活一，Rac1激活与未配对反应的比较（左；阈上（黑色）n个=12/12，亚阈值（红色）n个= 15/15; 细胞/棘）和成对串扰（右侧；n个= 5/9; 细胞/脊柱对）刺激。黑色和灰色箭头表示阈上/阈下刺激开始。
b条，与相同一对于Cdc42活性（左：未配对；超阈值n个=14/18，亚阈值n个= 14/20; 右：成对；n个= 9/10).
c（c），与相同一和b条RhoA活性（左：未配对；超阈值n个=9/9，亚阈值n个=17/22；右：成对；n个= 13/24).
天，数据摘要来自一–c（c）条形代表平均峰值活动。对于未成对条件，峰值是未时效后前2分钟的平均值。对于成对条件，阈上棘的峰值对应于刺激后的前2分钟，而串扰棘的峰值基于每个GTPase的最大响应时间（Rac1和Cdc42：第二次刺激后1-2分钟；RhoA：第一次刺激后1–2分钟）来解释信号扩散*P（P）<0.05，采用Tukey–Kramer的事后检验进行方差分析（ANOVA）。
e（电子），上图，表达CA-Cdc42对sLTP脊椎特异性影响的代表性双光子图像。黄色箭头表示在目标（红色圆圈）脊椎上取消勾选后强度增加的非目标脊椎。绿色箭头表示新脊椎。下图是一个典型的sLTP实验的代表性图像，在该实验中，不存在解锁的异突触效应。图像大小，12×12μm。
（f）量化对照组谷氨酸去盖后附近（<~5μm）脊柱体积的平均变化（黑色曲线；n个=13个细胞/13个靶向棘/112个相邻棘），CA-Cdc42-表达（绿色曲线；n个=9个细胞/14个靶向棘/102个相邻棘），以及CA-Cdc42-加上W56–mCh–MTBD-表达（红色曲线；n个=5个细胞/11个靶棘/78个相邻棘）细胞。
克，中的数据摘要（f）. *P（P）<0.05，用Tukey–Kramer检验进行方差分析。
小时，建议模型。来自强烈刺激的钙通过NDMAR激活CaMKII，支持自分泌BDNF–TrkB信号，并通过Rac1和Cdc42赋予肌动蛋白细胞骨架重塑。同时，CaMKII依赖的RhoA活化也作用于肌动蛋白细胞骨架。三种GTP的结合是产生sLTP所必需的。Rac1和RhoA活性从受刺激的脊椎扩散到树突和周围的脊椎，这不足以产生sLTP。然而，即使是微弱的刺激（红色虚线）也能引起足够的BDNF释放，激活Cdc42，补充Rac1和RhoA的活性，并允许突触串扰。
脊髓中Cdc42活性的分区性质可能有助于防止附近非活动突触的非特异性结构可塑性。与该模型一致，刺激表达组成活性（CA）-Cdc42的细胞上的单个脊椎会导致周围未刺激脊椎显著增大（ΔV附近持续= 42 ± 11%) (). 这与控制条件形成鲜明对比，在控制条件下，附近的脊椎体积（ΔV）没有平均变化附近持续= −2 ± 4%) (). 重要的是，受刺激脊髓中的sLTP与对照组相似(). 此外，当CA-Cdc42与W56–mCh–MTBD共同表达时，邻近脊椎中的sLTP受到抑制，而不影响受刺激脊椎中sLTP（ΔV附近持续=3±3%；ΔV持续刺激= 70 ± 13%) ()表明CA-Cdc42的异突触效应依赖于Rac1信号的传播。因此，消除Cdc42激活的分区会降低sLTP的输入特异性，可能是通过补充扩散Rac1和RhoA信号的典型启动效应。
总的来说，我们的数据表明Rac1、Cdc42和RhoA的同时激活可以预测sLTP的发生，而这些蛋白的一个子集的激活可以启动sLTP棘(). Cdc42和Rac1的激活需要突触后自分泌BDNF，并在脊髓特异性（Cdc42）和异突触（Rac1）域上传递sLTP的发生。BDNF–TrkB介导的Rac1信号从受刺激脊椎向外传播对于促进邻近脊椎的sLTP是必要的，这与已知的BDNF前塑性性质一致22,27,28,29BDNF-依赖性RhoA激活的扩散对于突触串扰也是必要的，这表明必须协调BDNF-相关和独立的信号通路才能实现这一现象。脊柱特异性、低阈值Cdc42激活与扩散性、高阈值RhoA和Rac1激活的组合被完美地定位为同时实现脊柱特异性高突触sLTP和促进周围脊柱的sLTP。因此，我们的模型基于三个GTPase小分子Rac、Rho和Cdc42的同时激活，以及自分泌BDNF信号传导，为同突触和异突触可塑性提供了统一的理论。
方法
试剂
人重组BDNF购自Millipore；d-2-氨基-5-磷酸（d-AP5）和NSC-23766来自Tocris；1′-萘甲基-4-氨基-1-第三种-丁基-3-(第页-甲基苯基）吡唑并[3,4-天]嘧啶（1NMPP1）来自圣克鲁斯和中国科学院上海药物研究所；TrkB-Ig是Regeneron送的礼物。通过GenScript合成tat-CN21肽（YGRKKRRQRKRPPKLGQIGRSKRVVIEDDR）。
动物
所有动物程序均由杜克大学医学院动物护理和使用委员会批准。使用雄性和雌性大鼠和小鼠。Trkb公司F616A型突变小鼠由D.Ginty提供21。Bdnf公司飞行/飞行和Trkb公司飞行/飞行由L.Parada提供17,36。种族1飞行/飞行这些动物来自C.Brakebusch30用PCR方法对制备切片前后每只动物的基因型进行了验证。
质粒
含有人类RAC1和PAK1（65–118）的质粒分别来自M.Matsuda和S.Soderling。通过使用定点突变试剂盒（Stratagene）将突变L77P和S115L引入PAK1（60–118），制备PAK2的Pak GTPase结合域（PBD2）。通过扩增Rac1抑制肽W56（参考文献。23)使用带有C末端连接物的悬置PCR（GGGGG-GGGG GGGGCGGGGSGGGGMG MADQLTEEWHRGTAGPGS）并将其插入pCAG-mCh-mCh（参考。三)通过用EcoRI和KpnI限制性消化物去除第一个mCh并用W56连接子扩增子取代它，产生pCAG-W56-（连接子）-mCh。同时，人类MAP2的MTBD（272-end）25从人类cDNA文库中分离并进行PCR扩增。然后用悬置PCR进一步扩增该扩增子以包含连接子（同上），然后使用BamHI-NotI限制性消化插入pCAG-mCh-mCh中以产生pCAG-mCh-（linker）-MBTD。然后使用BamHI和NotI限制摘要将这两个结构组合起来，以创建pCAG-W56-（链接器）-mCh-（链接者）-MBD。W56–MTBD的打乱变体是通过随机重新排序W56的残基而产生的。ARHGAP15-mCh-MTBD是通过在N端和C端分别添加EcoRI和KpnI位点，将ARHGAP 15（1-723；Addgene质粒38903）插入上述-mCh-MTBD-序列中而制备的。
X-mCh-MTBD结构的DNRhoA和DNCdc42变体是通过首先在W56的3′端加入MfeI消化位点，然后用NheI/MfeI消解去除W56并插入显性负结构来制备的。
准备
根据杜克大学医学中心的动物护理和使用指南，从出生后第5-7天的大鼠或小鼠中制备海马切片。简言之，我们用异氟醚对动物进行了深度麻醉，然后迅速将动物斩首并切除大脑。用McIlwain组织切碎器将海马分离并切割成350μm的切片。将海马切片置于由组织培养基（2.5升：20.95克MEM、17.9克HEPES、1.1克NaHCO三，5.8克d-葡萄糖、120μl 25%抗坏血酸、12.5毫升l-谷氨酰胺、2.5毫升胰岛素、500毫升马血清、5毫升1M硫酸镁4，2.5毫升1 M氯化钙2). 切片在35°C和3%CO中培养2。
在培养1–2周后，使用涂有30μg总cDNA质粒的金珠（8–12 mg）（Rac1传感器，供体：受体=1:2；eGFP+W56–MTBD，5:1；Rac1感应器+W56-MTBD；供体：接受体：抑制剂=2:4:1；TrkB传感器，供者：受体=1:1；Cdc42传感器，施主：受体=1:1；RhoA传感器，供体：受体=1:1）。转染后1-5天对只表达eGFP的细胞进行成像，转染后1-2天对表达TrkB的细胞进行图像处理，转染2-5天后对所有其他质粒组合进行图像处理。
对于结构塑性试验，条件敲除切片(Bdnf公司飞行/飞行和种族1飞行/飞行)在成像前，分别用eGFP单独或eGFP和tdTomato-Cre（1:1）转染3–7天。在这些切片中进行传感器实验时，传感器按上述比例使用，Cre重组酶的量等于供体DNA的量。核定位tdTomato信号证实了Cre的存在。
HEK293T细胞（ATCC）在添加有10%胎牛血清的DMEM中培养，37°C，5%CO2在约50–90%细胞汇合处使用脂质体（Invitrogen）和2μg ml进行转染−1总cDNA/35 mm培养皿的比例，如下所示。细胞仅用作表达平台，因此没有对其他细胞系的潜在污染进行严格测试。
2飞行时间
如前所述，使用定制的双光子荧光寿命成像显微镜进行FRET成像三,31,32使用调谐至920 nm波长的钛宝石激光器（MaiTai，光谱物理学）进行双光子成像，允许同时激发eGFP和mCh。使用在物镜处测量的<2 mW激光功率对所有样品进行成像。使用浸没物镜（60×，数值孔径0.9，Olympus）收集荧光发射，用二向色镜（565 nm）分光，并用两个波长滤波器（Chroma，HQ510-2p选择绿色，HQ620/90-2p选择红色）下游的两个单独的光电子倍增管（PMT）进行检测。绿色通道配备了具有低传输时间扩展的PMT（H7422-40p；哈马松），以允许荧光寿命成像，而红色通道配备了宽口径PMT（R3896；哈马松。使用由定制软件控制的时间相关单光子计数板（SPC-150；Becker和Hickl）进行荧光寿命成像的光子计数31，而红色通道信号是使用由Scanimage软件控制的单独数据采集板（PCI-6110）采集的33。
双光子谷氨酸解封
第二台调谐波长为720 nm的钛宝石激光器被用于在细胞外溶液中用4-6 ms、4-5 mW脉冲序列（0.5 Hz时为30倍）在感兴趣的脊椎附近（“LTP刺激”）打开4-甲氧基-7-硝基吲哚基-谷氨酸钙（MNI-笼状谷氨酸）。实验用镁进行2+人工脑脊液（ACSF；127 mM NaCl，2.5 mM KCl，4 mM CaCl2，25 mM NaHCO三，1.25 mM NaH2人事军官4和25 mM葡萄糖），含有1μM河豚毒素（TTX）和4 mM MNI-笼式谷氨酸盐，用95%氧气充气2和5%CO2如前所述，温度为30°C。使用1 ms、4–5 mW脉冲序列（0.5 Hz下30次）进行阈下刺激。如前所述，串扰实验是通过首先传递sLTP刺激（4-6ms），然后在~90s后传递亚阈值刺激到同一树枝晶上的附近（~2-5μm）脊柱来进行的19。每个细胞刺激1-5个棘，在单个细胞上最多进行3次串扰实验。
脊柱体积分析
脊柱体积计算为树突棘头周围感兴趣区域上的背景减去积分荧光强度（荧光，F类). 脊柱体积的变化测量为F类/F类0，其中F类0是刺激前的平均荧光强度。在ImageJ中对2pFLIM上下文外的双光子图像进行了分析。
所有涉及树突状抑制剂构建物的实验都是以盲法进行的，直到实验完成（当各组出现明显分歧时，或者直到至少三个细胞的15-20个单独实验完成，以先到者为准）。
2pFLIM数据分析
为了测量施主结合受体的比例，我们拟合了一条荧光寿命曲线，用高斯脉冲响应函数卷积的双指数函数对整个图像上的所有像素进行求和：
哪里τAD公司是施主与受体结合的荧光寿命，P（P）D类和P（P）AD公司分别是自由施主和施主与受体结合的分数，以及H（H）(吨)是荧光寿命曲线，具有与高斯脉冲响应函数卷积的单指数函数：
在哪儿τD类是自由供体的荧光寿命，τG公司是高斯脉冲响应函数的宽度，F类0是卷积前的峰值荧光，以及吨0是时间偏移量，erfc是误差函数。
我们修复了τD类自由eGFP获得的荧光寿命（2.6 ns）。为了生成荧光寿命图像，我们计算了平均光子到达时间〈吨〉，在每个像素中为：
然后，平均光子到达时间与平均荧光寿命〈有关τ通过偏移到达时间，吨0，通过对整个图像进行拟合得到：
对于图像中的小区域感兴趣（ROI）（脊椎或树突），我们计算了结合分数(P（P）AD公司)作为：
Rho-GTP酶与RBD亲和力的测定
将多组氨酸标记的超转录GFP（sfGFP）–Rac1、mCh-PBD2及其突变体克隆到pRSET细菌表达载体（Invitrogen）中。蛋白质在大肠杆菌（DH5α），用镍纯化+-氨三乙酸（NTA）柱（HiTrap，GE Healthcare），并用脱盐柱（PD10，GE Hearthcare，A类489纳米=83000厘米−1M（M）−1（参考。34); mCh，单位：，A类587纳米=72000厘米−1M（M）−1（参考。35)).
纯化的sfGFP–Rac1负载GppNHp（2′，3′-O（运行）-N个-甲基蒽酰-GppNHp）和GDP（通过在MgCl中存在GppNHp和GDP的十倍摩尔过剩的情况下孵化）2-含1 mM EDTA的游离PBS分别维持10分钟。通过加入10mM MgCl终止反应2将sfGFP–Rac1和mCh–PBD2混合，并在室温下孵育20分钟。在2pFLIM下测量sfGFP与mCh之间的FRET，并通过用双指数函数拟合荧光寿命曲线来计算sfGFP-Rac1与mCh-PDB2结合的分数(方程式（1）). 通过用Michaelis–Menten函数拟合结合分数与mCh–PDB2（[mCh-PDB2]）浓度之间的关系，获得了离解常数。
统计方法
所有实验的样本量都是根据试点实验中确定的信噪比选择的。
在进一步统计分析之前，使用Bartlett检验或Levene检验估计并比较所有数据的方差。
Rho GTPase传感器活性的分布模式是通过对峰值响应的正态性进行Shapiro–Wilk检验（用于统计比较的相同点）来确定的。所有被测传感器均遵循零假设，因此被视为正态分布。因此，使用参数统计来比较Rho-GTPases反应的值。
对于传感器活动的多次比较，首先对数据进行方差分析，然后根据比较的结构进行事后检验，以确定统计显著性。如果将每种情况与组内所有其他情况进行比较，则使用Tukey–Kramer方法。在将每种情况与单一对照进行比较的情况下，使用了Dunnet检验。
为了比较脊柱体积的非正态分布变化值，对数据进行对数变换以解决偏度，然后进行正态参数统计，如图图例所示。为了支持这些统计主张，还使用Wilcoxon秩和检验代替非参数统计，将非参数统计应用于原始的非转换数据吨-测试和Kruskal–Wallis程序代替ANOVA，然后使用Dunn检验进行事后分析。通过这两种方法测试的所有数据都是显著的。
只有当明显的细胞健康不良迹象（例如，树突起泡、脊椎塌陷）出现时，数据才会被排除。
以盲法进行了比较不同遗传扰动的串扰实验。当实验数据达到统计显著性时，或者当实验数据与达到统计显著度的类似实验相比较时，实验人员被揭开盲条。
