重定向效应淋巴细胞过继免疫治疗前列腺癌骨病变

摘要

介绍

前列腺癌是美国男性最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第二大原因(1). 骨是PC最常见的转移部位(2)骨转移是大多数转移性PC发病率的原因。70%以上死于PC的患者检测到骨转移(三). 转移性PC患者的中位生存期只有30个月(4). 激素消融治疗是目前对这些患者的第一个标准治疗，激素依赖性疾病的难治状态通常在12-18个月内出现，之后大约一半的患者在6个月内死于疾病进展。因此，非常需要扩展现有的治疗方法，以对抗播散性PC。“T体”方法，即用具有抗体特异性的嵌合受体重定向效应淋巴细胞，被认为有望用于癌症的过继免疫治疗(5–7). 最近，我们证明了表达erbB2特异性嵌合受体（CRs）（称为T小体）的人淋巴细胞可以直接应用于局部限制的、成熟的PC异种移植物，从而导致肿瘤生长迟缓、前列腺特异性抗原（PSA）分泌减少和延长治疗动物的生存期(8).

然而，优化T体方法用于晚期PC的系统治疗，必须克服几个缺点才能应用于临床。免疫细胞过继转移的主要限制之一是缺乏将基因工程T细胞特异性运输到播散性肿瘤部位的能力。将T细胞贩运到这些部位是一个复杂的多阶段过程，包括沿着内皮细胞在特定部位滚动和阻滞，然后靶组织外渗和渗透。这些过程中的一个重要步骤是由组织分泌的趋化因子及其在T细胞膜上的相应受体之间的相互作用介导的(9). 虽然肿瘤细胞可以分泌趋化因子，但在T细胞不表达适当的趋化因子表面受体的情况下，通常不会发生T细胞的定点贩运(10).

最近，Brentjens等人(11)使用基因靶向人类T淋巴细胞在小鼠模型中根除全身B细胞肿瘤。在该系统中，用抗CD19特异性CR转导的人PBL，然后在CD19存在下被激活和增殖⁺CD80型⁺“人工”抗原提呈细胞和IL-15在体内持续存在，并维持其功能足够长的时间，以消除其远处的肿瘤靶点。

在这里，我们吸取了人类造血干细胞移植的经验教训，以吸引T体到SCID小鼠的PC骨损伤中。我们的方法是基于先前的证明，即人类造血细胞在先前接受全身照射（TBI）的SCID小鼠的骨髓中快速聚集(12–14)或环磷酰胺，增加骨髓基质细胞衍生因子-1（SDF-1）表达的治疗(15). SDF-1是趋化因子CXC亚家族的成员，对T淋巴细胞和前B淋巴细胞具有强大的化学吸引力(16)表达SDF-1受体CXCR4(17). SDF-1影响T细胞滚动和T细胞与活化内皮细胞的粘附强度(18)以及CD4的协同刺激⁺T细胞激活(19).

因此，我们假设骨髓基质微环境中SDF-1的浓度增加，即PC骨转移所在的微环境，将增加全身给药T小体的归巢和滞留。因此，我们建立了一个体内实验系统，以扩大T小体对转移癌的治疗范围。我们在这里证明，在BM中诱导SDF-1表达的治疗增强了erbB2特异性人类T细胞的归巢，从而抑制晚期PC的进展甚至治愈。

结果

改善体外操纵淋巴细胞的迁移。

我们使用一种实验性临床前系统，在SCID小鼠中研究了人类T体治疗PC骨转移的能力，SCID小鼠在小鼠股骨中移植了人类PC异种移植物（图​（图1）。1). 对这些小鼠进行治疗性（erbB2特异性）或对照性（2,4,6-三硝基苯酚特异性[TNP-特异性]）人体T体的全身给药。然而，我们第一次尝试消除这种骨转移失败，我们发现erbB2特异性T细胞几乎没有产生任何作用（数据未显示）。因为之前发现相同的erbB2特异性T小体在肿瘤内给药后清除相同皮下PC异种移植物非常有效(8)，我们怀疑静脉注射后T体未能达到（足够数量）并有效排斥骨肿瘤。用于激活人T细胞及其在IL-2中培养的体外条件，这是逆转录病毒转导和增殖所必需的(20)，已被证明下调参与淋巴细胞迁移的几个分子的表面表达，包括CXCR4(17,21). 因此，我们研究了增加SDF-1（CXCR4配体）的水平是否会增强T小体向骨髓的迁移，从而消除表达相应靶抗原的骨肿瘤。虽然T小体是人类起源的，SDF-1是由SCID小鼠产生的，但这两个物种的SDF-1分子之间几乎完全相同并具有交叉反应性(22,23). 因为作为再生过程的一部分，SDF-1是为了应对组织损伤而产生的(15)，我们测试了提高其在骨骼中浓度的治疗方法的效果，如TBI和环磷酰胺(15). 图​图2A2A表明，2 Gy剂量的亚致死剂量照射导致SCID BM中SDF-1表达增加。环磷酰胺（200 mg/kg，i.p.）也诱导BM中的SDF-1 mRNA表达水平增加（图​（图2A）。2A） ●●●●。因此，在全身给药携带CR的人淋巴细胞之前，使用2 Gy TBI或200 mg/kg环磷酰胺对小鼠进行预处理。事实上，这些经过改造的淋巴细胞在该条件处理方案之后在更大程度上重新填充了小鼠骨髓。人体T体向小鼠BM迁移的水平在TBI的12–24小时内达到峰值（图​（图2B）。2B） ●●●●。单次低剂量环磷酰胺也获得了类似的结果（数据未显示）。

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图1

WISH-PC14诱导成骨细胞骨损伤。将WISH-PC14单细胞悬浮液经转子注入SCID小鼠的右股骨。(A类)肿瘤的X线表现。(B类)对侧股骨的正常BM组织学。放大倍数，×100。(C)与相同B类放大倍数，×200。注意正常的骨小梁和骨膜。(D类)WISH-PC14（T）占据了右股骨的整个BM腔。放大倍数，×100。(E类)肿瘤细胞周围有成骨细胞活性（O）。放大倍数，×200。注意骨小梁增厚。(F类)制备和放大与E类注意副骨形成的骨膜反应（箭头所示）。

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图2

辐射和环磷酰胺对骨髓中SDF-1 mRNA表达的影响以及随后人类T细胞向小鼠骨髓的迁移(A类和B类)用2 Gy照射SCID小鼠或腹腔注射200 mg/kg环磷酰胺或不治疗。(A类)治疗后24小时，制备mRNA并进行RT-PCR。环磷酰胺；mSFF-1α，小鼠SDF-1α；正常、未经治疗的小鼠。H（H）₂O用作阴性对照。(B类)静脉注射给治疗小鼠后，人体T小体向BM迁移的动力学。通过GFP上的FACS分析门控确定达到BM的T小体数量（事件）(n个=每组3只小鼠；实验至少重复了两次）。在6小时和12小时时，受照受试者骨髓中累积的T小体数量明显大于未受照受者(P（P）=0.054和P（P）分别为0.011）。

为了测试工程化T细胞向骨髓的迁移增强是否是由于用低剂量TBI或环磷酰胺预处理后产生SDF-1所致，我们用抗CXCR4或对照抗体处理T体，包括人转铁蛋白受体（TfR）特异性单克隆抗体（在淋巴细胞表面表达，与抗CXCR4单克隆抗体具有相同的同型）。结果如图所示​图3三表明抗CXCR4部分但显著(P（P）=0.003，与抗TfR相比）抑制T小体的特异性体内迁移。在跨阱迁移试验中也获得了类似的结果，其中携带CR的淋巴细胞的迁移仅被抗CXCR4特异性抑制（图​（图44).

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图3

T小体向预处理小鼠骨髓的迁移部分由CXCR4介导。SCID小鼠(n个=每组3只小鼠）在静脉注射erbB2特异性CR淋巴细胞前24小时，用2 Gy TBI照射或注射200 mg/kg环磷酰胺。将T小体与抗CXCR4单克隆抗体（αCXCR4）、不相关对照单克隆抗体抗人TfR（αTfR）或无抗体（无）在冰上预孵育30分钟，然后将其全身注射到小鼠体内。24小时后，提取骨髓，通过FACS分析测定人淋巴细胞数量（辐射实验中检测GFP阳性T小体，环磷酰胺实验中检测CFSE标记细胞）。两种受照小鼠的抗CXCR4治疗与对照治疗（抗TfR）显著不同(*P（P）=0.003）和环磷酰胺处理的小鼠(**P（P）=0.009），并且与无抗体治疗显著不同(P（P）=0.01和P（P）分别=0.0002）。

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图4

T小体向重组人SDF-1α（rhSDF-1）的跨阱迁移具有剂量依赖性，并受到抗CXCR4的抑制。(A类和B类)T体的跨井运移。(A类)T小体向rhSDF-1α浓度增加的方向迁移。(B类)T小体在含有抗CXCR4或抗TfR的冰上预孵育30分钟，然后向含有rhSDF-1α（150 ng/ml）的培养基或单独培养基迁移1小时。与抗-TfR或不治疗相比，抗-CXCR4显著抑制迁移(*P（P）=0.016和*P（P）分别=0.019）。

全身给药T小体对PC BM病变的治疗作用。

在我们建立了改善SCID小鼠体内体外操纵人类淋巴细胞向骨内转移的方案后，我们测试了erbB2特异性人类淋巴细胞的治疗效果。图中显示了将T体全身注射到携带已建立的股内PC（WISH-PC14）异种移植物的SCID小鼠中的结果​图55–5在这组实验中，在静脉注射erbB2或TNP特异性人类T细胞体或培养基之前24小时，对小鼠进行照射（2 Gy TBI）或不照射。如所有3个终点所示，血清PSA（图​（图5），5)，骨射线照相术（图​（图6），6)和动物生存（图​（图7），7)，只有在用低剂量TBI预处理的小鼠中用抗erbB2 CR淋巴细胞治疗的组中才能获得特异性抗肿瘤效果。未受照射的小鼠组之间没有显著的统计差异（图​（图5A）；5A） ；然而，对于受照射的小鼠，用erbB2特异性T小体治疗的组与用TNP-特异性T小体治疗组或未治疗组之间的差异（仅给出培养基；图​图5B）5B） 意义重大(P（P）=0.0145或P（P）分别为0.0455）。无关T小体（TNP-特异性）或未经照射的小鼠均未产生治疗作用。亚致死性TBI仅略微降低了骨髓中WISH-PC14异种移植物的生长速率（通过比较未受照小鼠和受照小鼠中对照[培养基处理]异种移生物的生长可以明显看出）。

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图5

erbB2特异性T小体全身治疗对WISH-PC14 BM损伤的影响取决于小鼠的预照射。(A类和B类)携带已建立的骨内WISH-PC14异种移植物的SCID小鼠也未进行预处理(A类)或用2 Gy TBI预处理(B类)静脉注射erbB2或TNP-特异性CR淋巴细胞或培养基前24小时(n个=每组10只小鼠）。测定小鼠血清中的PSA水平。正方形、圆形和三角形分别代表注射到受体SCID小鼠中的培养基、TNP-和erbB2特异性CR-携带淋巴细胞。

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图6

治疗后BM病变的放射照相。治疗5周后对小鼠进行放射分析。虽然在受照射和未受照射的小鼠对照组以及用erbB2特异性T小体治疗的未受照射动物中观察到肿瘤，但在用erbB2 CR淋巴细胞治疗的受照射动物上，在预照射和用erbB特异性T小体治疗5周后，没有明显的肿瘤放射学征象。

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图7

全身给予erbB2特异性人类淋巴细胞可延长PC-BM损伤小鼠的生存期。(A类和B类)携带已建立的WISH-PC14骨损伤的SCID小鼠的生存数据(n个=每组10只小鼠）用TNP或erbB2特异性CR淋巴细胞或培养基进行系统治疗(A类)或使用(B类)2 Gy TBI预处理。

为了测试当荷瘤小鼠用环磷酰胺而不是照射预处理时，这种方法是否也有效，以及在另一种肿瘤异种移植物上测试这些效果，我们使用了雄激素依赖性和erbB2表达的PC异种移生物LuCaP 35。在这个异种移植模型中(P（P）=0.037）仅在实验的第一个月内，用erbB2特异性T小体治疗的预照射组的肿瘤生长减少（如PSA分泌所示）（图​（图8）。8). 然而，使用环磷酰胺进行预处理（图​（图9）9)与非相关（TNP）特异性的对照细胞相比，erbB2特异性T小体具有更显著和持久的治疗作用(P（P）= 0.011). 此外，在接受erB2特异性T小体治疗的组中，35%（11只中的4只）的小鼠在治疗后2个月内保持低血清PSA水平（<5 ng/ml）。

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图8

环磷酰胺预处理或照射增强了erbB2特异性CR淋巴细胞系统治疗LuCaP-35骨损伤的效果。(A类和B类)用TBI预处理携带已建立的LuCaP-35骨内异种移植物的SCID小鼠(A类)或环磷酰胺(B类)静脉注射erbB2-特异性（三角形）或TNP-特异性（圆形）CR淋巴细胞或培养基（方形）前24小时(n个=每组10只小鼠）。

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图9

erbB2特异性CR淋巴细胞全身治疗对LuCaP-35骨肿瘤小鼠生存的影响。(A类和B类)携带LuCaP-35骨肿瘤SCID小鼠的生存数据(n个=每组10只小鼠）用TNP或erbB2特异性CR淋巴细胞或培养基进行系统治疗，并用2 Gy TBI进行预处理(A类)或环磷酰胺(B类).

讨论

表达预选肿瘤抗原特异性嵌合受体的转基因T细胞的开发克服了过继性细胞免疫治疗的几个关键障碍。现在可以产生临床相关数量的肿瘤特异性自体淋巴细胞，携带各种亚型的CR(8,11,20). 这些细胞对相同的非MHC和限制性抗原具有特异性，能够在预定靶点的刺激下协同工作。已经构建了一个能够选择性识别不同肿瘤相关抗原的大量CR库(10,24–39)在实践中，人们可以用一组包含多种不同特异性和CR设计的T体来攻击给定的肿瘤。这一武器库应该为癌症免疫治疗的主要缺点之一提供了一个可行的解决方案：选择性免疫压力导致逃逸变异体的再生(7,40,41). 同样，三部分CR，如这些研究中使用的，具有额外的共刺激功能，如CD28和4-1BB(20,42,43)，赋予程序性T细胞所需的特征，以抵消通常在携带肿瘤的宿主中发现的无能和凋亡信号(7).

在临床前模型和初步临床试验中观察到的T体临床应用的障碍之一是体外操纵的T体向其肿瘤靶点的低效归位。显然，PBL衍生的基因修饰T细胞在体外激活、转导和长时间繁殖后，会改变其归巢特性，无法有效到达传播疾病的部位，从而无法持续维持其效应器功能。这种模式是普遍的，与CR表达无关，因为非基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在临床试验中也屡次失败，无法证明患者在没有细胞清除治疗的情况下持续性和功能性植入(44–46). 这一问题的一个表现是全身给药的体外操纵淋巴细胞被困在实验动物的肺部(47). 为了克服这一主要局限性，并且为了优化T体方法对播散性癌症的系统治疗，我们在此表明，用低剂量TBI或环磷酰胺对受体进行预处理可以提高过继转移T体产生的治疗效果。我们的数据表明，SDF-1–CXCR4相互作用至少参与了部分效应。已有大量文献证明，作为组织再生过程的一部分，组织诱导剂（如环磷酰胺或TBI）诱导SDF-1的产生和分泌(15). 已知SDF-1是表达CXCR4的造血干细胞趋化作用和趋化性的强大介质(14,23)以及成熟淋巴细胞，如NK和T细胞(17,21,48). 作为适用于T体免疫治疗的晚期和不可治愈肿瘤靶点的模型，我们选择研究PC骨转移。骨髓是PC转移的主要部位，导致了该病的大量发病率和死亡率。在细胞表面表达的几种PC-相关抗原中(49–52)，我们选择靶向erbB2，因为它在高达80%的转移性PC上过度表达，并且随着雄激素依赖性的降低其表达增加(53–55). 此外，erbB2的表达与前列腺癌的进展有关(54,55). 我们在临床前研究中使用的两种异种移植物WISH-PC14(8)和LuCaP 35(56)，代表前列腺癌的侵袭性表型；WISH-PC14具有抗辐射性（数据未显示），而LuCaP 35是从转移淋巴结建立的，其生长独立于雄激素(56)而且抗辐射。这些异种移植物在SCID小鼠中都不会自发转移到骨骼，但它们在注射到小鼠BM后会形成典型的PC骨损伤（图中WISH-PC14所示​图1）。1). 受体预处理和过继转移肿瘤特异性T小体的联合方法被证明对两种PC异种移植物都有效（图​（图55–5).

在这两种预处理方法中，环磷酰胺更有效地创造了适当的条件，使携带CR的淋巴细胞在SCID小鼠中发挥其治疗作用。低剂量环磷酰胺治疗后，大量细胞迁移至骨髓（图​（图22和​和3）。三). 一种解释是这两个过程是相互关联的；即，在实验条件下，环磷酰胺在骨髓中诱导了更多的SDF-1生成，从而吸引了更多的治疗性T小体。在使用的浓度下，小鼠淋巴细胞亚群对环磷酰胺的反应不同。当效应器和辅助性T细胞耐药时，抑制性（或调节性）T细胞敏感(57). 然而，在免疫缺陷SCID小鼠中，这种影响以及对淋巴细胞稳态的影响预计可以忽略不计。

在胰岛细胞瘤转基因小鼠模型中也进行了类似的观察，在该模型中，较高剂量的辐射通过增加粘附分子、细胞因子和趋化因子的表达来调节肿瘤微环境(58). 作者认为，辐射引起的内皮细胞变化逆转了其非粘附表型，从而直接促进了白细胞与内皮细胞的相互作用。在这种情况下，联合照射/过继转移诱导IFN-γ、TNF-α、血管抑制性趋化因子Mig和IP10的表达增强。我们使用了免疫缺陷宿主这一事实并没有否定这种促炎机制也参与我们的模型的可能性。的确，Ganss等人(58)表明单独的照射诱导了促炎事件，其在BM重建后没有达到激活内源性免疫所需的临界阈值，并且肿瘤排斥反应仅在随后输注激活的效应细胞后发生。我们认为，在正常的免疫活性受试者中，淋巴消融预处理的总体效果，如本文所用的预处理，是复杂的，包括对稳态的扰动，以允许外源性淋巴细胞的移植、抑制细胞的消除和炎症环境的诱导，其中包括吸引T淋巴细胞的趋化因子。

根据抗CXCR4部分阻断T小体向BM迁移的事实（图​（图3）三)（以及跨阱实验中T体在SDF-1梯度上的迁移；见图​图4），4)并且辐射和环磷酰胺都增加了SDF-1的表达，我们认为至少部分治疗效果涉及CXCR4–SDF-1相互作用。SDF-1不仅在吸引造血祖细胞进入骨髓中发挥关键作用(12–14,18,23)而且还参与了NK和NKT细胞向BM区室的迁移(17). 此外，一些研究报告了SDF-1激活T细胞：它是CD4的共刺激因子⁺T细胞激活(19)，并且其在肿瘤部位的分泌（本例中为BM）促进了长寿命、肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应的发展(59)导致肿瘤排异。最近，Dudley等人证明，在过继转移肿瘤反应性T细胞之前，用环磷酰胺和氟达拉滨对转移性黑色素瘤患者进行非清髓性调节，对于功能性淋巴细胞克隆的持续重新繁殖以及将其运至转移部位至关重要。该方案的使用使大量患者的肿瘤完全消退(60). 尽管该研究中未确定其机制，但我们认为这些患者中SDF-1表达的增加与SCID小鼠中的表达方式类似。

理论上，癌症患者有意诱导SDF-1的一个担忧是，过度表达CXCR4的癌细胞也有可能导致不必要的迁移至骨骼(61). 虽然大多数来源于普通实体肿瘤的细胞系不表达CXCR4(62)，最近报道CXCR4–SDF-1轴参与乳腺癌转移(63). SDF-1促进转移的作用机制是复杂的。在乳腺癌模型中(63)，抗CXCR4通过抑制CXCR4介导的增强癌细胞对组织的侵袭来减少转移。类似地，横纹肌肉瘤(62)研究表明，SDF-1的作用主要涉及细胞与微环境的相互作用及其迁移，而非细胞增殖和存活。然而，在人类结肠癌异种移植模型中(64)研究表明，CXCR4的激活在侵袭中并不起重要作用，而是导致微转移的产生。

综上所述，我们的研究结果表明，肿瘤特异性T小体被SDF-1所吸引，迁移到骨髓，在那里消灭肿瘤细胞。在患者中，SDF-1可能只对部分效应负责；然而，我们的结果和最近发表的使用TIL进行黑色素瘤免疫治疗的临床研究(60)强烈证明，在过继转移肿瘤特异性T细胞之前，应先用无毒、低剂量辐射或环磷酰胺和氟达拉滨对癌症患者进行预处理。

方法

致谢

脚注

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