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神经化学杂志。作者手稿；PMC 2018年3月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经化学杂志。2017年3月；140(6): 874–888.
2017年2月14日在线发布。 数字对象标识：10.1111/jnc.13923
预防性维修识别码：项目编号：5339046
NIHMSID公司：NIHMS837416
PMID：27935037

由人诱导多能干细胞衍生的脑内皮细胞、星形胶质细胞和神经元组成的等基因血脑屏障模型

斯科特·坎菲尔德,1 马修·斯特宾斯,1 贝瑟马里·索托·莫拉莱斯,1 Shusaku W.Asai公司,1 加德·瓦廷,2 克莱夫·N·斯文森,2 肖恩·帕莱切克,1,*和埃里克·V·舒斯塔1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

血脑屏障（BBB）对于维持血液和大脑之间的物理和代谢屏障至关重要。BBB由脑微血管内皮细胞（BMEC）组成，这些细胞排列在脑血管系统中，与星形胶质细胞、神经元和周细胞结合形成神经血管单元（NVU）。我们假设，由人诱导多能干细胞（iPSCs）生成的星形胶质细胞和神经元可以诱导iPSC-derived BMEC中的BBB表型，从而创建一个健壮的多细胞人BBB模型。为此，iPSC被用于形成神经祖细胞样的EZ球，这些EZ球依次分化为神经元和星形胶质细胞，从而促进神经细胞的生成。iPSC衍生的星形胶质细胞和神经元在原代大鼠BMEC中诱导屏障紧缩，表明其BBB诱导能力。当与人iPSC衍生的BMEC共同培养时，iPSC衍生神经元和星形胶质细胞显著提高了BMEC细胞群的跨内皮电阻（TEER），降低了被动通透性，改善了紧密连接的连续性，而p-糖蛋白（PGP）外排转运体活性保持不变。由1个神经元和3个星形胶质细胞组成的生理相关神经细胞混合物具有最佳的BMEC诱导特性。最后，利用来自同一供体iPSC源的BMEC、星形胶质细胞和神经元成功地证明了一个等基因多细胞BBB模型。预计人类BBB的这种等基因传真可能有助于进一步了解NVU在健康和疾病人类中的细胞相互作用。

关键词：血脑屏障模型、神经血管单位、星形胶质细胞、神经元、干细胞

图形摘要

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我们建立了一个由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑内皮细胞（BMEC）、星形胶质细胞和神经元组成的等基因人血脑屏障（BBB）模型。我们已经证明iPSC衍生的神经元和星形胶质细胞可以改善iPSC衍生BMEC的紧密连接并诱导屏障收紧。一个等基因BBB模型，其中每种细胞类型都来自相同的患者iPSC来源，这将为脑疾病建模和药物开发提供新的方法。

介绍

血脑屏障（BBB）是健康大脑活动的关键，由大脑血管系统中的特殊内皮细胞形成。这些脑微血管内皮细胞（BMEC）形成屏障，调节营养物质、代谢物和细胞在血液和大脑之间的运输，同时有助于保护中枢神经系统免受有毒和致病性损伤。屏障表型是通过紧密连接蛋白、外排转运体和营养物质转运体的特殊队列表达诱导的(赵等人。2015). 在健康条件下，血脑屏障能有效维持血液和大脑之间的微妙动态平衡；然而，在许多疾病中，如中风、阿尔茨海默病和ALS，BBB功能障碍在疾病进展中起着重要作用(兹洛科维奇2008).

许多在体外BBB模型的开发有助于阐明BBB在大脑发育、功能和疾病中的作用，并开发潜在的治疗方法。尽管在解释这些结果并将其与人类状况进行比较时必须考虑物种差异，但已经成功地使用了来自各种动物来源的新鲜分离的BMEC(熟食店等人。2005,沃伦等人。2009,西瓦嫩等人。2009). 此外，新鲜分离的人骨髓基质细胞和永生化的骨髓基质细胞已被用于模拟血脑屏障(切凯利等人。2007,韦克斯勒等人。2005). 然而，一旦从脑微环境中移除，原代和转化的BMEC倾向于去分化，屏障性能降低(Weksler等人，2005年,弗尔斯特等人。2008,男人等人。2008,卡拉布里亚和舒斯塔2008).

BBB模型的一些局限性可以通过包括神经血管单元（NVU）的其他细胞（如星形胶质细胞、神经元或周细胞）来缓解，以帮助提供对独特BBB特性的发展、维持和调节至关重要的线索。通过创造这样的多细胞在体外BBB模型能够更好地逼近更复杂的NVU，研究健康和疾病状态下的BBB功能可以成为更具代表性的体内BBB生理学。开发多细胞BBB模型的一个主要焦点是研究星形胶质细胞和BMEC之间的相互作用(Janzer&Raff 1987年). 共同培养的原代星形胶质细胞增强BBB特性，包括增加TEER和降低细胞旁通透性(Deli等人，2005年). 最近，共培养的周细胞已被证明具有与星形胶质细胞相似的血脑屏障增强作用(中川等人。2007,李普曼等人。2014). 共同培养后，神经元也能刺激BMEC中连续紧密连接的形成(萨维蒂埃里等人。2000,希拉等人。2003,棕色等人。2015). 此外，周细胞、星形胶质细胞和神经元的多细胞组合比任何单一的共培养细胞类型更能诱导BMEC表型(中川等人。2009,李普曼等人。2011,李普曼等人。2012,Brown等人，2015年).

解决规模、人力资源和人类疾病建模等与之相关的属性在体外BBB模型，我们小组最近开发了一种将人类iPSC分化为BMEC样细胞的方法(Lippmann等人，2012年,威尔逊等人。2015). 这些iPSC衍生的内皮细胞表现出许多重要的BBB特征，包括跨内皮细胞电阻升高、荧光素通透性降低、主动外排转运体、营养转运体和紧密连接蛋白的表达(Wilson等人，2015年,Lippmann等人，2012年,Lippmann等人，2014年,李普曼等人。2013). 由于其他外周内皮细胞也可以表达BMEC的一些标志物和表型特征，我们将这些iPSC-derived细胞称为BMEC样细胞（缩写为iPSC-drived BMEC）(Lippmann等人，2012年,威尔逊等人。2015). 此外，我们证明，与NVU细胞（包括原代人脑周细胞、星形胶质细胞和各种组合的神经元）共同培养可诱导血脑屏障特性，如iPSC衍生的BMEC中的屏障收紧(Lippmann等人，2014年,Lippmann等人，2012年). 然而，共同培养的NVU细胞是原始来源，因此规模和可获得性有限。

在这里，我们假设有可能将iPSCs分化为能够在等基因iPSC-derived BMEC中诱导BBB表型的星形胶质细胞和神经元。这种来源于同一人类供体的等基因人类NVU模型可以为研究健康和疾病患者的BBB结构和功能提供实质性益处。为此，我们采用了EZ球体，这是一种稳定且可扩展的多能干细胞衍生的神经干细胞样聚集系统(埃伯特等人。2013,萨琳等人。2014). iPSC-derived EZ球体在长时间培养后保留其形成神经花结的潜力，并可分化为各种神经和胶质细胞谱系(Ebert等人，2013年). 我们证明，与单细胞培养的BMEC相比，与EZ球源性星形胶质细胞和/或神经元共同培养的原代或iPSC源性BMEC的通透性降低，紧密连接定位改善。此外，iPSC-derived星形胶质细胞和神经元增加的BMEC TEER水平高于与原代人NPC-衍生星形胶质细胞、神经元或大鼠星形胶质细胞共同培养的水平。最后，我们通过使用来自同一患者衍生iPSC系的BMEC、星形胶质细胞和神经元，证明了等基因NVU建模的能力。

材料和方法

iPSC向BMEC的分化

IMR90-4（WiCell）和CS03iCTRn2（Cedars Sinai iPSC-Core）iPSCs在Matrigel（BD Biosciences）的第32–56代之间培养，并如前所述每日补充mTESR1培养基（WiCel）(斯特宾斯等人。2015,于等人。2007). iPSC系CS03iCTRn2在Cedars-Sinai iPSC Core上产生，并通过多能性标记、基于阵列的Pluri测试和G带核型分析进行了验证。iPSC每隔3-4天与Versene（Life Technologies）以1:12的典型比例进行传代。用Accutase（Life Technologies）以10000个细胞/厘米的种子密度将iPSCs奇点化后，对BMEC进行分化2并扩展到30000个细胞/厘米2（2-3天）(Wilson等人，2015年). 一旦达到最佳密度（30000个细胞/cm2)达到要求后，将培养基替换为未经处理的培养基（UM:100 mL敲除血清替代物（Life Technologies）、5 mL非必需氨基酸（Life Technologies），2.5 mL谷胱甘肽-max（Life Techologies））、3.5 uLβ-巯基-乙醇（Sigma）和392.5 mL DMEM/F12（1:1），每天持续六天。然后将UM替换为含有200 mL hESFM（生命科技）的EC培养基，并添加20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；WiCell）和1%血小板衍生牛血清（生物医学科技公司），为期两天。然后用Accutase将细胞分离成单个细胞，并在无菌水中以1×10的密度涂敷在IV型胶原（400 ug/mL；Sigma）和纤维连接蛋白（100 ug/mL）上6细胞/厘米21.12厘米2Transwell Clear渗透性嵌件（0.4µm孔径；康宁）或密度为250000个细胞/cm2在12-/24-/96周的组织培养聚苯乙烯板上（康宁）。继代培养BMEC后的前24小时，将细胞培养在EC培养基中，然后在实验期间切换到缺乏bFGF的EC培养基。

iPSC向EZ球源性神经元和星形胶质细胞的分化

4.2（GMOO3814 Coriell Institute）和CS03iCTRn2 iPSC通过在超低附着烧瓶中用胶原酶（1 mg/mL，Gibco）提升完整的iPSC集落，分化为EZ球(Yu等人，2007年). 每隔一天向EZ球体喂食一次EZ球体培养基，该培养基由DMEM/F12组成，补充100 ng/mL bFGF、100 ng/mL表皮生长因子（EGF、Pepro-tech）和5 ug/mL肝素（Sigma），并使用机械分离技术每周传代。神经元的EZ球分化：用Accutase对EZ球体进行奇点化，并以25000个细胞/厘米的速度播种2在Matrigel涂层板上。细胞在由DMEM/F12（70:30；Life Technologies）组成的神经元培养基中培养两周，该培养基补充有1%青霉素-链霉素、2%B27减去维生素A（Life Technologies）和2 ug/mL肝素，培养基每隔一天更换一次(Ebert等人，2013年).EZ球向星形胶质细胞分化：EZ球用含有DMEM/F12的星形胶质细胞诱导培养基处理11天，该培养基添加有1%NEAA、1%N2（神经补充剂）、肝素（2ug/mL）和全反式维甲酸（RA，0.5 uM），每日改变培养基，并因其易于分化为星形胶质细胞而重命名为星形胶质球。然后，可以将天体球体转移回EZ球体介质，并通过机械解离每周传递一次。天体球体可以用Accutase进行奇点化，并以25000个细胞/厘米的密度镀在Matrigel涂层板上2并在含有DMEM/F12（1:1，Life Technologies）和1%NEAA、1%N2和2 ug/mL肝素的星形胶质细胞培养基中培养两周，每隔一天更换培养基(Sareen等人，2014年).

大鼠BMEC的分离

所有动物工作均按照威斯康星大学-麦迪逊动物护理和使用委员会批准的方案进行，并遵循NIH实验室动物护理和利用指南。从成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Harlan）中分离出大鼠脑毛细血管。将脑组织切碎，用2型胶原酶（0.7 mg/mL）和DNAse I（39 U/mL）消化。在20%牛血清白蛋白中离心后，纯化的微血管颗粒在1 mg/mL胶原酶/淀粉酶和DNAse I中进一步消化。为了获得纯毛细血管群，我们使用33%Percoll梯度，并将细胞镀到IV型胶原/纤维连接蛋白涂层的Transwells上。毛细血管在补充有20%PDS、1 ng/mL bFGF、1 ug/mL肝素、2 mM L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM中培养。通过在接种后用平滑肌素（4 ug/mL）处理细胞两天来获得纯BMEC单层。共培养实验在隔离后约4天开始，此时BMEC已经汇合(卡拉布里亚等人。2006).

大鼠星形胶质细胞的分离

如前所述采集星形胶质细胞(韦登费勒等人。2007). 收集P6新生大鼠的皮层，并在HBSS培养基中切碎。利用胰蛋白酶（5 mg/mL）在37°C下消化皮质25分钟，然后消化5分钟的脱氧核糖核酸酶I（114 U/mL）。消化后的组织通过70 um滤网过滤，并以2.5×10的密度播种4细胞/厘米2在胶原蛋白I（50 ug/mL）涂层烧瓶中。星形胶质细胞在补充有10%胎牛血清、10%马血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/L）和1%抗生素抗真菌剂的DMEM中培养。

3T3成纤维细胞和NPC的培养

3T3小鼠成纤维细胞（ATCC）在添加10%FBS的DMEM中培养，每天更换培养基。在共培养实验中，小鼠3T3细胞被用作非神经细胞对照。人类NPC（Guido Nikkhah博士馈赠的一种礼物）保存在含有DMEM/F12（70:30，Life Technologies）的培养基中，补充2%B27、1%抗生素-抗真菌、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、10 ng/mL白血病抑制因子（LIF；Millipore）和5 ug/mL肝素(Lippmann等人，2011年). NPC每周通过机械分离传代。通过将Accutase奇异化细胞接种到多聚赖氨酸（Sigma）涂层烧瓶上，并在缺乏生长因子的鼻咽癌维持培养基中培养12天，将NPC分化为约1:3的神经元：星形胶质细胞(Lippmann等人，2011年).

启动共培养实验

除非另有说明，否则在所有实验中均以类似的方式进行共培养。继iPSC-BMEC亚培养阶段后，立即将BMEC维持为单培养或与人类干细胞衍生的星形胶质细胞、神经元或不同组合、3T3成纤维细胞、原代人类NPC衍生的星形细胞和神经元或大鼠星形胶质细胞共培养。所有实验共培养组以25000个细胞/厘米的速度接种2在开始共同培养之前。将BMEC接种到Transwell上，并将所有共培养亚型接种在Transwell下方的平板表面上。将iPSC-BMEC传代到Transwells上24小时后，所有细胞在EC培养基（+PDS/+bFGF）中培养，然后在所有实验的剩余时间内转移到EC培养基中（+PDS/−bFGF。测试其他共培养基：DMEM/F12培养基（+10%FBS）、EC培养基（%10%FBS；所有实验培养基条件都能培养出活细胞，然而，当EC培养基（+PDS/+bFGF）用于共培养的前24小时，然后转化为EC培养基时，屏障收紧程度最高。大鼠BMEC分离四天后，开始与人iPSC衍生的星形胶质细胞和神经元共同培养大鼠BMECs。在之前描述的大鼠BMEC培养基中使用大鼠BMECs进行的共培养实验。

电阻测量

继BMEC亚培养后，每隔24小时测量一次跨内皮细胞电阻（TEER）。使用带STX2电极的EVOM欧姆表记录电阻（世界精密仪器公司）。TEER值表示为Ωxcm2减去一个不需要的Transwell，再乘以1.12厘米2计算表面积。在每个样品上分别测量三次TEER测量值，并在每个实验条件下至少使用三个三重过滤器进行测量。

紧密连接的免疫细胞化学和分析

如前所述，在单/共培养条件下对iPSC BMEC和在共培养实验中使用的所有实验组进行免疫细胞化学(Stebbins等人，2015年). 初级抗体来源和稀释液见补充表1将细胞固定在冷甲醇（100%，西格玛）中15分钟。将细胞在室温下封闭在10%山羊血清（西格玛）中30分钟。在奥林巴斯荧光显微镜上拍摄图像。先前描述了初级抗体、稀释率、固定剂和阻断剂(Stebbins等人，2015年). 在单细胞培养或与iPSC衍生的神经元和星形胶质细胞共培养（比例1:3）后，对闭塞素和克劳丁-5免疫标记的BMEC中的不连续紧密连接进行量化。用闭塞素或克劳丁-5进行免疫染色后，缺乏至少一个连续连接的细胞被归类为不连续细胞。在图像J中对图像进行处理，对至少10个区域进行量化，其中每个区域约有30个细胞，这些细胞来自三个不同的分化，所有实验组在研究完成之前保持盲法。使用相同的图像，测量每个显示闭塞素或克劳丁-5免疫反应的图像的面积，以确定面积分数指数。

西部印记

用PBS将BMEC冲洗1倍，并使用冰镇RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物（Pierce）进行裂解。使用BCA分析（Pierce）定量裂解液的蛋白质浓度，并将其装入4–12%Tris-Gyline SDS-page凝胶（Invitrogen）中。将样品转移到硝化纤维素膜上后，用含0.1%吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水清洗膜一次，并在封闭缓冲液中封闭1h（5%非脂肪干乳溶于TBST）。然后在4°C下用一级抗体隔夜探测膜(表S1)在阻塞缓冲区中。用5 mL TBST清洗膜3×10 min，然后用10 mL TBST培养10 min，接着抽吸TBST，并用10 mL的TBST再次培养斑点5 min（清洗步骤）。用二级抗体在封闭缓冲液中稀释1h，在室温下黑暗条件下探测膜（1:5000驴抗鼠IRDye 800CW，LICOR；1:5000驴防兔680RD，LICOR）。对膜进行第二次清洗，然后使用LICOR Odyssey成像仪进行成像，并使用LI-COR Image Studio 2.0版进行量化。

流式细胞术

将BMEC或第14天EZ球衍生的星形胶质细胞和神经元与Accutase孵育7分钟。用移液管从板表面轻轻移取细胞，然后将其重新悬浮在各自的培养基中，并在血细胞仪上计数。细胞在1000 g下离心5分钟，并在室温下在2%多聚甲醛中固定20分钟。然后在室温下，将细胞在添加有40%山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS中培养20分钟。初级抗体(表S1)将匹配浓度的对照小鼠或兔IgG在补充有40%山羊血清的PBS中稀释30分钟。一级抗体孵育后，在含有1%FBS的PBS中将细胞洗涤三次。将Alexa-488山羊抗兔或抗小鼠IgG在含有40%山羊血清的PBS中以1:200的稀释度添加到细胞中，并孵育30分钟。将细胞在补充有0.1%BSA的PBS中洗涤三次，并使用FACScaliber（BD）进行分析。

P-糖蛋白外排转运体活性

对于转运体分析，iPSC-BMEC以100万细胞/cm的密度在Transwells上进行亚培养2在EC培养基中单培养或共培养48小时。罗丹明1，2，3（10μM，Sigma）被用作PGP底物，环孢霉素a（10 uM，CsA；Sigma。将iPSC-BMEC从共培养条件中移除1 h，以进行罗丹明1,2,3转运研究；TEER无变化。BMEC在37°C的旋转平台上与CsA预孵育1小时。在37°C的温度下，在旋转平台上接受罗丹明1,2,3（含或不含CsA）1小时。孵育后，从底部室取出等分样品，在荧光板阅读器上对荧光进行定量，并将其归一化为BCA分析定量的蛋白质含量。

渗透率测量

使用荧光素钠（10μM，376道尔顿；Sigma）测定iPSC-BMEC屏障的通透性。在单培养或共培养48小时后，将新鲜EC培养基添加到Transwell系统中，将含有荧光素钠的EC培养基加入顶部培养箱，将不含荧光素纳的EC培养液加入底部培养箱。在0、15、30、45和60分钟时从底室中取出150微升等分试样，并立即用预热的EC培养基替换。基于荧光素从顶部腔室到底部腔室的清除体积来计算渗透系数。

统计分析

整个手稿中的数据以平均值±标准偏差表示。SigmaStat 3.0软件（Systat软件）用于统计分析。使用单向方差分析（ANOVA）和Holm-Sidak校正对所有比较或未配对学生t检验进行统计比较。图例描述了用于每个特定数据集的统计测试。

结果

EZ球衍生星形胶质细胞和神经元的衍生

已制定的方案被用于及时有效地将星形胶质细胞和神经元与EZ球体区分开来(Ebert等人，2013年,Sareen等人，2014年) (图1AEZ球保存在补充了bFGF和EGF（EZ球培养基）的DMEM F/12中，并每周进行机械解离。通过在补充有B27（w/o维生素a）（神经元诱导培养基）的DMEM/F12中培养，EZ球被选择性分化为神经元群(图1A). EZ球衍生的神经元表达神经元特异性标记物βIII微管蛋白，而星形胶质细胞标记物、星形胶质细胞表达的中间丝蛋白GFAP和成熟的胶质细胞特异性标记物S100钙结合蛋白（S100B）在该群体中完全不存在。EZ球衍生神经元对早期外胚层标记物配对盒蛋白6（PAX-6）也呈阴性。通过补充维甲酸的星形胶质细胞诱导培养基，EZ球也分化为神经祖细胞群星形胶质球。然后，在补充N2（星形胶质细胞诱导培养基）的DMEM/F12中，星形胶质细胞进一步分化为星形胶质细胞，导致细胞群表现出胶质形态并表达GFAP和S100B。进一步证实了对星形胶质细胞谱系的选择性分化，EZ球源性星形胶质细胞不表达PAX-6或βIII微管蛋白。流式细胞术显示，80±7%的星形胶质细胞和82±9%的神经元分别表达GFAP和βIII微管蛋白(补充图1). 研究了从EZ球分化7、14和21天的星形胶质细胞和神经元在iPSC衍生的BMEC中诱导屏障特性的能力。第14天，星形胶质细胞和神经元提供了最大的TEER升高，因此被用于随后的实验(补充图2). 此外，在与iPSC-derived BMEC共同培养后，星形胶质细胞和神经元继续分别表达βIII微管蛋白和GFAP(补充图1). 综上所述，iPSC来源的EZ球体在相对较短的14天时间内产生了BBB诱导的星形胶质细胞或神经元。

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用于BBB建模的神经元、星形胶质细胞和BMEC的衍生

（A） iPSC 4.2 EZ球体在EZ球体介质中保持悬浮状态。在用神经元诱导培养基处理14天后，EZ球被单一化并分化为神经元。在用补充有视黄酸的星形胶质细胞诱导培养基处理11天后，EZ球体也进一步分化为星形球体群体。在EZ球培养基中保持星形胶质细胞悬浮，然后在星形胶质细胞诱导培养基中14天后分化为星形胶质细胞。为了检测神经元和星形胶质细胞的分化，对EZ球衍生细胞群进行免疫细胞化学标记，以检测早期神经外胚层标记物PAX-6、神经元标记物β-III微管蛋白、星形胶质细胞标记物S100B和GFAP。比例尺=200µm。为了推导BMECS，在分化开始前（第0天）将单一化IMR90-4 iPSC扩增3天，在UM/F培养基中分化6天，然后切换到基于EC的培养基中培养2天。（B） 对IMR90-4 iPSC衍生的BMEC进行Pecam和VE-Cadherin、葡萄糖转运蛋白Glut-1、紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin以及外排转运蛋白PGP的免疫标记。比例尺=100µm。（C） iPSC-BMEC差异化和共同培养时间表。第8天分化的BMEC与EZ球衍生的星形胶质细胞或神经元或控制细胞类型（包括大鼠星形胶质细胞、人类神经祖细胞衍生的星形细胞和神经元、小鼠3T3成纤维细胞）共同培养。所有共培养实验均在EC培养基中进行，直到第15天监测BBB表型。

BMEC与EZ球源性星形胶质细胞和神经元共培养增强屏障紧密性

接下来，iPSC衍生的BMEC与EZ球衍生的星形胶质细胞和神经元共同培养。如前所述，iPSC衍生的BMEC表达关键的BBB标记物，包括内皮细胞标记物Pecam、BBB葡萄糖转运蛋白Glut-1、紧密连接蛋白、闭塞素和克劳丁-5以及外排转运蛋白PGP(Lippmann等人，2012年) (图1B). 共培养EZ球源性星形胶质细胞和神经元对纯化的BMEC屏障形成的影响评估如下图1C重要的是，这些共培养物需要鉴定适用于存在的所有细胞类型的通用培养基。为了确定合适的共培养培养基，在BMEC分化的第8天，将iPSC衍生的BMEC和共培养细胞类型（星形胶质细胞和/或神经元）并行分化，并将其置于含有不同量PDS和FBS的几种培养基（见材料和方法）中共培养(图1C). 如前所述，在含有1%PDS和20 ng/mL bFGF（EC+bFGF/+PDS）的EC培养基中，共培养最初24小时（第8至9天）观察到最大的屏障诱导，然后在第9至12天切换到含有1%PDS但缺乏bFGF的EC培养液（EC-bFGF/+PDS）(Lippmann等人2014). 为了证明EZ球体衍生的神经元和星形胶质细胞能够诱导血脑屏障特性，首先将它们与原代大鼠BMEC共同培养，并通过TEER监测屏障的形成(图2A). 单培养大鼠BMEC的TEER值为86±11Ωxcm2当与EZ球源性星形胶质细胞共同培养时，大鼠BMEC TEER升高至291±38Ωxcm2（p<0.05）。同样，与EZ球衍生神经元共同培养可将大鼠BMEC TEER升高至208±21Ωxcm2（p<0.05）。EZ球衍生神经元和星形胶质细胞（1:3）的组合使大鼠BMEC的TEER升高到356±42Ωxcm2（p<0.05）(图2B). 因此，EZ球衍生神经细胞能够在原代大鼠BMEC中诱导屏障功能。

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EZ球源性星形胶质细胞和神经元BBB诱导效应的测定

（A） 采用Transwell系统进行共培养。将BMEC接种在Transwell过滤器上，并将共培养细胞类型接种在微孔底部。（B） 原代大鼠BMEC与iPSC 4.2 EZ球衍生神经元、星形胶质细胞或神经元和星形胶质细胞的混合物（1个神经元：3个星形胶质细胞）共同培养，并监测TEER。使用ANOVA计算统计显著性。*与大鼠BMEC相比，p<0.05；#与神经元相比p<0.05。数值为单个大鼠BMEC分离物和单个神经元和星形胶质细胞分化物的三个重复的平均值±SD，并对另外两个独立的分离物和分化物重复实验，以验证报告的统计趋势。

由于EZ球衍生神经细胞在原代大鼠BMEC中诱导屏障特性，因此通过与其他几种诱导性和非诱导性细胞类型的比较，系统地研究了EZ球派生星形胶质细胞和神经元在与人iPSC衍生BMEC共培养模型中对TEER的影响(图3A和3B). 与单细胞培养（神经元491±86Ωxcm）相比，与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞共培养可显著提高iPSC-衍生BMEC的TEER2（p<0.05）；星形胶质细胞558±4Ωxcm2（p<0.05）；与单细胞培养153±9Ωxcm相比2). 与与星形胶质细胞或单独与神经元共培养相比，结合EZ球衍生神经元和星形胶质细胞进一步提高了TEER。神经元与星形胶质细胞的1:1比例将共同培养的BMECS的TEER提高到661±41Ωxcm2（p<0.05）而神经元与星形胶质细胞的比例为1:3时，TEER进一步升高至886±54Ωxcm2（p<0.05）。

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优化共培养条件以诱导iPSC-derived BMEC的屏障收紧

对多种共培养细胞在IMR90-4 iPSC-derived BMEC中诱导屏障紧缩的能力进行了检测。（A） 免疫细胞化学检测GFAP和β-微管蛋白III，分别检测星形胶质细胞和神经元的分布。天球、EZ球和EZ球衍生的星形胶质细胞和神经元由iPSC 4.2 EZ球生成。以原代人NPC衍生的星形胶质细胞和神经元混合物、原代大鼠星形胶质细胞以及小鼠3T3成纤维细胞作为对照。比例尺=200µm。（B） 在共同培养开始后48小时（第10天）达到最大TEER值。所有共同培养的细胞以25000个细胞/厘米的速度接种2EZ球衍生神经细胞被用作纯神经元或星形胶质细胞培养物，或作为所示的混合物。（C） 在共培养开始后48小时（第10天）测量荧光素渗透性。使用方差分析计算统计显著性*与单培养相比p<0.05，$与神经元或星形胶质细胞共培养相比p<0.05，#与所有组相比p<0.05。数值为单个分离/分化的三个重复的平均值±SD，并对三个额外的分化重复实验，以验证报告的统计趋势。

相比之下，原始人类神经前体细胞（NPC）来源于星形胶质细胞和神经元的混合物(图3A)将共培养iPSC衍生BMEC的TEER值提高到611±40Ωxcm2（p<0.05）(图3B)，与之前报告的值类似(Lippmann等人，2012年). 与原代大鼠星形胶质细胞共培养也提高了iPSC-BMEC TEER（784±19Ωxcm2（p<0.05））(Lippmann等人，2014年). 为了评估EZ球神经祖细胞是否影响BMEC TEER，我们将未分化的EZ球与iPSC衍生的BMEC共同培养。尚未表达星形胶质细胞或神经元标记物的EZ球和EZ球衍生的星形胶质球(图3A)与单培养iPSC衍生的BMEC相比，TEER仅略微升高（247±33Ωxcm2（N.S.）；285±12Ωxcm2（p<0.05）。最后，将小鼠3T3成纤维细胞用作非诱导性共培养对照。3T3细胞共培养没有升高TEER，具有统计学意义（187±14Ωxcm2（N.S.））。

我们还利用荧光素通透性评估EZ球衍生细胞对iPSC衍生BMEC屏障特性的影响(图3C). 单培养iPSC-derived BMECs显示Pe（电子）=4.8±0.3 × 10−7cm/s。与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞共同培养（1:3）可显著降低Pe（电子）1.20±0.01×10−7cm/s（p<0.05），与共同培养TEER升高一致。同样，NPC衍生的星形胶质细胞和神经元以及原代大鼠星形胶质细胞显著降低荧光素通透性，表明BMEC屏障收紧（NPC衍生神经细胞Pe（电子）=2.0±1.0 × 10−7cm/s（p<0.05），原代大鼠星形胶质细胞pe（电子）=1.9±0.1 × 10−7厘米/秒（p<0.05）；分别）。EZ球源性神经元和星形胶质细胞，特别是以1:3的比例，增强了BMEC中的屏障收紧，并与其他非干细胞源性人类NPC和大鼠星形胶质细胞进行了类似的基准测试。

共培养增加BMEC的紧密连接定位

为了确定与EZ球衍生细胞共培养后增强的iPSC衍生屏障特性是否与紧密连接中的结构变化有关，通过免疫细胞化学检查紧密连接蛋白的定位和连续性。在单细胞培养中，iPSC-derived BMEC显示出闭塞素和克劳丁-5经常不连续的连接(图4A). 与EZ球体衍生的神经元和星形胶质细胞（1:3）共培养48小时后，具有不连续连接的细胞数量显著减少(图4A和4B)对应于结合蛋白和克劳丁-5免疫反应性的总体增加(图4C与单一培养相比，闭塞素增加83±24%，克劳丁-5面积分数指数增加44±14%（p<0.05）。此外，Western blotting用于评估共培养是否影响紧密连接蛋白表达水平(图4D). 与单细胞培养相比，与EZ球源性神经元和星形胶质细胞共培养导致闭塞素和克劳丁-5水平轻微且无统计学意义的增加(图4E). 综上所述，这些结果表明，与EZ球源性星形胶质细胞和神经元共同培养可以增强iPSC源性BMEC的屏障特性，并表明屏障特性的这些变化是由于紧密连接的形成和维持得到改善。

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EZ球共培养后紧密连接连续性分析

与iPSC 4.2 EZ球衍生神经元和星形胶质细胞（1:3）共培养48小时后，研究IMR90-4 iPSC衍生BMEC中紧密连接蛋白的定位和表达水平。（A） 闭塞素和克劳丁-5的免疫细胞化学显示不连续紧密连接（白色箭头）。比例尺=50µm。（B） 通过计数含有至少一个不连续紧密连接的细胞，在单培养和共培养条件下对BMEC中的不连续连接进行量化。（C） 通过计算具有闭塞素和克劳丁-5免疫反应性的每张图像的面积，对单培养和共培养条件下BMEC的紧密连接定位进行额外量化，得出面积分数指数。将数据标准化为单一培养条件，并以百分比表示。使用Student t检验计算面板（B）和（C）的统计显著性*与单细胞培养相比p<0.05。值是三个盲法独立微分的平均值±SD。（D） 在单培养和共培养条件下，通过β-肌动蛋白负载控制，对紧密连接蛋白clodin和claudin-5进行Western blot。显示了三份Western blot样品的单道代表性。（E） 定量蛋白质印迹以比较紧密连接蛋白表达水平。共培养样品独立归一化为每个单独的单培养样品。使用Student t检验计算统计学显著性。数值为三个独立微分的平均值±SD。

BMEC转运体未因共培养而改变

通过测量罗丹明123在iPSC-derived BMEC单层中的转运，研究了EZ-球衍生细胞共培养对iPSC-Drived BMECs中PGP外排转运体活性的影响。比较单细胞培养的iPSC-derived BMEC和与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞共培养的iPSC衍生BMEC之间的PGP活性（1:3）。单细胞培养的BMEC在环孢霉素A（CsA）抑制后罗丹明123的转运增加（45±8%（p<0.05）），表明iPSC-derived BMEC的基线PGP活性(图5A). 与EZ球源性神经元和星形胶质细胞共培养后，PGP活性与单培养iPSC源性BMEC在统计学上没有区别（CsA存在时增加40±8%）。相比之下，与原代大鼠星形胶质细胞、NPC衍生的星形胶质细胞和神经元或小鼠3T3成纤维细胞共培养的iPSC-衍生的BMEC也产生了与iPSC-派生的BMEC单一培养相比在统计学上无法区分的PGP活性。综上所述，这些结果表明，如前所述，PGP在iPSC-derived BMEC中是活跃的，并且与iPSC-drived或primary derived星形胶质细胞和神经元共同培养不会影响这种活动(Lippmann等人，2012年,Lippmann等人，2014年,Wilson等人，2015年). 此外，与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞（1:3）共同培养不会影响谷氨酸-1、前列腺素P、MRP-1、BCRP或转铁蛋白受体TfR的定位或表达水平(图5B和5C) (补充图3). 因此，屏障收紧仍然是iPSC衍生的BMEC与EZ球体衍生的神经元和星形胶质细胞共同培养的主要表型效应。

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共培养后BMEC的评估

（A） 为了评估IMR90-4 iPSC衍生的BMEC中的主动外排转运体活性，在有和没有PGP抑制剂环孢菌素A（CsA）的情况下，测量PGP底物罗丹明123的反式BMEC转运。IMR90-4 iPSC衍生的BMEC与大鼠星形胶质细胞、人NPC衍生的星形胶质细胞和神经元、iPSC 4.2 EZ球衍生的神经元和星形胶质细胞（1:3）或小鼠3T3成纤维细胞共同培养。在有或无CsA的两室共培养模型中测量罗丹明123从心尖到基底外侧室的转运，并报告为原始荧光单位（RFU）。使用ANOVA计算统计显著性。*在每个实验条件下，p<0.05 vs.无抑制对照。数值为单个分化/分离的三个重复的平均值±SD，并对另外两个独立分化重复实验，以确认统计趋势。（B） IMR90-4 iPSC-derived BMEC在单细胞培养或与4.2 iPSC-EZ球衍生神经元和星形胶质细胞（1:3）共培养48小时后的免疫细胞化学检测葡萄糖转运蛋白、谷氨酸-1、外排转运蛋白、前列腺素P、MRP-1、BCRP或转铁蛋白受体TfR的表达。比例尺=100µm。（C） 用流式细胞术测定定量转运体表达水平。阳性免疫标记细胞群的几何平均数用于比较联合培养和不联合培养的表达水平。流式细胞仪数据样本可在补充图3将数据归一化为单培养表达水平。使用Student t检验确定统计显著性。数值为三个独立微分的平均值±SD。

等基因iPSC-衍生人BBB模型的推导

在证明了EZ球源性神经元和星形胶质细胞对iPSC源性BMEC的屏障增强作用后，如TEER增加、通透性降低和不连续紧密连接减少所示，我们接下来研究了衍生BMEC的潜力，来自同一供体衍生iPSC系（CS03iCTRn2）的星形胶质细胞和神经元构建人类NVU的等基因模型。正如上述IMR90-4（BMEC）和4.2-iPSC（星形细胞和神经元）线所示，CS03iCTRn2衍生的BMEC、神经元和星形细胞表达适当的组织特异性标记物(图6A和6B). CS03iCTRn2衍生的BMEC与神经元共培养：星形胶质细胞（1:3）比单培养（785±30Ωxcm）增强近4倍的TEER2与201±14Ωxcm相比2; 分别（p<0.05）），该屏障保持在~700Ωxcm2持续5天(图6C). 在同基因共培养模型中，与单培养的CS03iCTRn2衍生的BMEC相比，荧光素通透性降低了13倍，也证明了屏障紧缩。（Pe（电子）=0.62±0.11 × 10−7厘米/秒vs.8.1±0.9×10−7厘米/秒；分别（p<0.05）(图6D). 同基因模型中的PGP外排转运体活性不受共培养的影响，单培养的BMEC在CsA抑制后罗丹明1,2,3转运增加38±14%，而共培养的BMECs的PGP外排转运器活性增加45±12%(图6E). 与来自混合iPSC系的共培养一样(图2–5)，我们成功地将BMEC与来自供体或匹配iPSCs的星形胶质细胞和神经元共培养，并观察到BMEC群体中的屏障特性增强。

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一种等基因神经血管单元的研制

iPSC-derived BMEC和EZ-sphere衍生的星形胶质细胞和神经元从同一CSO3n2-iPSC系分化而来。（A） CSO3n2衍生BMEC中BBB标记物的免疫细胞化学分析。比例尺=100µm。（B） 星形胶质细胞和从CSO3n2 EZ球分化的星形胶质细胞及神经元标记物的免疫细胞化学。比例尺=100µm。（C） CSO3n2 iPSC-derived BMEC与CS03n2 iPSC衍生神经元和星形胶质细胞共培养前后的时间TEER曲线。使用Student t检验计算统计学显著性*与单细胞培养相比p<0.05。数值为单个分化的三个重复的平均值±SD，对另外两个独立分化重复实验，以验证统计趋势。（D） 在共培养开始后48小时测量荧光素钠渗透性。使用Student t检验计算统计显著性*与单细胞培养相比p<0.05。数值为单个分化的三个重复的平均值±SD，对另外两个独立分化重复实验，以验证统计趋势。（E） 在共培养开始后48小时测量PGP外排转运体活性。使用方差分析计算统计显著性*p<0.05 vs.无抑制。数值为单个分化的三个重复的平均值±SD，对另外两个独立分化重复实验，以验证统计趋势。

讨论

本研究表明，iPSC EZ球衍生的星形胶质细胞和神经元可以与iPSC衍生的BMEC结合，形成一个包含这三种关键NVU细胞类型的完全人类iPSC衍生BBB模型。重要的是，许多模型是嵌合体的，因为它们使用来自不同物种的神经血管单元的细胞。通常，使用不同年龄动物的组织分离每种细胞类型是不同的方案(Lippmann等人，2013年,Deli等人，2005年,Syvänen等人，2009年,Warren等人，2009年). 因此，多细胞BBB模型的技术复杂性可以明显看出。使用iPSC技术，可以从单个可扩展、无差异的iPSC源中导出每种人类细胞类型。然而，获得iPSC神经元和星形胶质细胞的典型方案可能需要数周到数月才能区分(基姆等人。2011,Krencik&Zhang 2011年)，使构建基于iPSC的人体BBB模型的物流变得复杂。相比之下，EZ-spheres是一种自我更新的前花结神经干细胞群体，可以长时间悬浮培养，通过机械分离技术传代，并在相对较短的时间内（2周）分化为一系列神经谱系。如上所述，这些两周分化的神经元和星形胶质细胞群体能够显著改善iPSC衍生的BMEC的屏障特性。因此，结合相对较短的BMEC分化（8天），在神经元和星形胶质细胞分化之前的自我更新“中间”阶段培养EZ球的能力大大减少了用iPSC-derived细胞建模BBB的后勤挑战。

EZ球源性星形胶质细胞和神经元增强BBB特性的能力首先通过其在共同培养的大鼠BMEC中增加屏障紧密性的能力得到证实。随后，与iPSC衍生的BMEC共同培养，发现EZ球体和星际体祖细胞没有明显的诱导性。然而，进一步分化的EZ球衍生星形胶质细胞和神经元增加了BMEC屏障特性，表明神经细胞规范是BBB诱导的关键。有趣的是，我们发现与EZ球源性星形胶质细胞共培养相比，与神经元共培养产生的屏障诱导增强，这与之前的报告一致，即星形胶质细胞共同培养比神经元共同培养更能诱导BMEC屏障特性(希拉等人。2005). BMEC与EZ球源性星形胶质细胞和神经元的混合物共同培养，比单独的任何一种细胞类型都能更大程度地改善屏障功能，且神经元与星形胶质细胞的最大诱导比为1:3，与成人大脑中报告的分布极为相似(阿兹维多等人。2009,Herculan-Houzel&Lent 2005年). 就绝对诱导能力而言，EZ球衍生的星形胶质细胞和神经元与其他共培养模型相比表现良好。此前，我们证明，在与大鼠星形胶质细胞（700Ωxcm）共同培养后，iPSC-derived BMEC中的TEER升高2)、人类初级NPC衍生神经元和星形胶质细胞（450Ωxcm2)和初级周细胞，然后是NPC衍生的神经元和星形胶质细胞（600Ωxcm2) (Lippmann等人2012,Lippmann等人，2014年). 通过与iPSC-derived周细胞共培养，可能进一步增强iPSC-drived BMEC的特性，尽管尚未报道具有脑特异性的iPSC-direved周血球(Kusuma公司等人。2015,范德米尔等人。2013). 此外，关键血脑屏障信号通路的操纵可用于进一步增强血脑屏障特性，正如我们之前在周细胞、星形胶质细胞和神经元共培养模型中用维甲酸增强iPSC衍生的BMEC特性所证明的那样(Lippmann等人2014).

共培养后观察到的主要表型变化是通过TEER观察到的屏障功能改善和被动通透性降低。如前文所述，氢化可的松治疗的大鼠BMEC，在闭塞素或克劳丁-5蛋白水平上未观察到显著变化，这表明存在足够的紧密连接蛋白来观察屏障的收紧(卡拉布里亚等人，2006年). 或者，以前的研究已经证明连接连续性和屏障表型之间存在着很强的相关性(烟蒂等人。1990,Weidenfeller等人，2007年,卡拉布里亚等人，2006年,韦登费勒等人。2005,Lippmann等人，2014年,Nakagawa等人，2009年). 与这些研究类似，与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞共同培养后，iPSC-derived BMEC中不连续连接的数量显著减少。这些数据表明，紧密连接连续性而非蛋白质表达水平可能是共同培养时观察到的屏障诱导的原因。作为另一种可能受共培养影响的BBB表型，对PGP外排活性进行了评估。我们之前已经证明iPSC-derived BMEC表达功能性外排转运体，包括PGP、多药耐药蛋白和乳腺癌耐药蛋白(Lippmann等人，2012年,Lippmann等人，2014年,Wilson等人，2015年,Stebbins等人，2015年). 同样，本研究中产生的iPSC-derived BMEC显示PGP外排功能。与EZ球源性星形胶质细胞和神经元共培养对PGP活性没有实质性影响，原代大鼠星形胶质细胞或原代人NPC源性星形细胞和神经元的共培养也没有实质性作用。尽管许多研究表明，共培养可以提高PGP蛋白的表达和活性水平(贝雷佐夫斯基等人。2004,多古等人。2005,Nakagawa等人，2009年,佩里埃等人。2007)，其他研究报告永生化或原代BBB共培养模型中PGP的表达或活性没有变化，与我们的观察结果类似(弗里斯等人。2014,林等人。2007). 此外，鉴于其独特的分化起源，iPSC-derived BMEC可能已经拥有与原代或永生化BMEC不同的PGP表达的适当线索。例如，添加维甲酸可以增强永生化人和大鼠脑细胞系中PGP的表达和活性(Mizee公司等人。2013,埃尔·哈夫尼等人。1997)，它没有改变iPSC-derived BMEC中的PGP活性(Lippmann等人2014). 最后，与EZ球衍生神经元和星形胶质细胞（1:3）共同培养似乎不会影响其他关键的BMEC特征，如谷氨酸-1、MRP-1、BCRP或TfR转运体的表达水平。

最后，据我们所知，我们首次创建了一个等基因血脑屏障模型，其中神经元、星形胶质细胞和BMEC来源于同一人类iPSC系。等基因BBB模型的表现类似于结合不同来源的BMEC和EZ球体的模型，并显示TEER升高而渗透率降低。此外，与之前描述的以原代大鼠星形胶质细胞和原代人类NPC为共培养神经细胞源的模型相比，iPSC-derived BMEC与EZ球源性星形胶质细胞及神经元共培养可导致TEER延长升高(Lippmann等人2012,Lippmann等人，2014年)从而增加了模型部署的时间窗口。据预测，这种等基因BBB模型的开发将为人类BBB模型提供新的应用。具体来说，研究人类遗传疾病对血脑屏障功能的影响的能力可能被证明是强大的。此外，可以部署iPSC衍生的BBB模型来逐个患者分析药物渗透性，从而为患有神经疾病的患者提供个性化的药物治疗方法。

补充材料

Sup信息

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致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款NS083688和哈特韦尔基金会的支持。作者感谢Masatoshi Suzuki博士（威斯康星大学麦迪逊分校兽医学院比较生物科学系助理教授）对EZ球培养和分化技术的投入。

常用缩略语

英国广播公司血脑屏障
脑微血管内皮细胞脑微血管内皮细胞
NVU公司神经血管单位
iPSC诱导多能干细胞
TEER（三通）跨内皮电阻
PGP公司P-糖蛋白
GFAP公司胶质纤维酸性蛋白

脚注

利益冲突披露

作者声明不存在利益冲突。

工具书类

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