胶质细胞ATP控制皮质星形胶质细胞BDNF循环

摘要

大多数关于星形胶质细胞与突触相互作用的研究都着眼于识别特定分子和信号通路，揭示星形胶质细胞对突触传递和可塑性的影响。在最近的一份出版物中，我们提供了明确的证据，证明长期增强（LTP）需要突触胶质细胞清除（前）脑源性神经营养因子（proBDNF）并随后再循环(图1).¹神经营养素摄取受体p75^NTR公司在星形胶质细胞上表达，²其清除LTP诱导的电刺激后在突触处释放的过量前BDNF。^三然后，内源性BDNF前体作为成熟蛋白释放，提供神经营养素的来源，对维持突触后神经元中TrkB磷酸化至关重要。^4-8考虑到BDNF胶质细胞的再循环，神经营养素信号被保留下来，以加强突触活动和巩固记忆。

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图1。

长期记忆保持需要突触胶质细胞吸收和再循环proBDNF。随后的相关步骤解释了再循环过程：（i）proBDNF-由神经元分泌并内化为突触前胶质细胞通过第75页^NTR公司LTP诱导电刺激后；（ii）含有p75的内吞囊泡^NTR公司/在进入分泌途径之前，前BDNF存在于突触前胶质细胞；（iii）再循环的前BDNF被加工成成熟的神经营养素，诱导附近神经元的TrkB磷酸化；（iv）实现从早期LTP到晚期LTP转换的调节功能；（v） 星形胶质细胞中BDNF胶质细胞的再循环可以深刻影响视觉物体识别记忆。

星形胶质细胞不是电兴奋细胞；因此，在突触间隙接收来自神经元的信号是这些细胞调节BDNF循环的最预期机制。这提供了一个模型，通过该模型，表达感受器的星形胶质细胞从活动的突触释放，传递导致内吞性BDNF分泌的内部信号。星形胶质细胞表达许多不同的递质和调节剂的受体，包括谷氨酸、ATP、腺苷和鸟苷，并在受到刺激时显示钙信号。⁹这增加了BDNF神经胶质循环受到高度调节的可能性，并表明神经胶质细胞上递质受体的复杂激活控制最终神经营养素的可用性。这一观点提出了神经-胶质相互作用的一种新机制，表明星形胶质细胞是多种递质的功能靶点，它们可以响应并调节可塑性，以适应突触需求。为了支持这一假设，我们提供了明确的证据，即除了谷氨酸外，细胞外核苷酸ATP还调节培养的皮层星形胶质细胞内吞性BDNF的分泌。

BDNF在星形胶质细胞传质诱导分泌中的再循环

为了了解星形胶质细胞分泌内吞性BDNF的触发事件，我们使用了P1-2大鼠皮层的星形胶质细胞培养物，其中未检测到基础和刺激性神经营养素分泌。^三星形胶质细胞与前体和成熟BDNF亚型（混合物）混合培养10分钟。之所以选择这个时间，是因为它与这些细胞中充分的proBDNF内化相关。^三然后将星形胶质细胞置于灌注室中，每隔5分钟收集一次灌注液。每个组分中BDNF的数量通过2位点免疫分析测定。^10-13

我们最初分析了先前描述的高钾（40mM KCl）在促进培养的星形胶质细胞中胶质递质分泌方面的作用。^14,15众所周知，这种刺激通过去极化和钙增加的机制调节神经元BDNF的分泌，^12,16-19但它是否也能引起星形胶质细胞分泌内吞性BDNF尚不清楚。KCl处理细胞5分钟后BDNF免疫反应增强(图2). BDNF的释放迅速增加，灌流液中的最大水平在KCl给药开始后5分钟达到。这表明去极化调节星形胶质细胞内吞性BDNF的分泌。

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图2。

KCl公司^负极谷氨酸介导的去极化诱导皮层星形胶质细胞（左侧）内吞性BDNF的释放。对之前接触BDNF（混合物）10分钟的星形胶质细胞进行灌注，并用KCl（40 mM）刺激5分钟。灌注液中BDNF分泌的ELISA定量显示在KCl施用之前（0至10分钟）、期间（10至15分钟）和之后（15至30分钟）BDNF的水平。（右）此面板显示在KCl（40 mM）或谷氨酸（500µM）刺激后收集的5分钟分数中测量的BDNF水平。数据为平均值±SEM（误差线）。*，P≤0.05。

已知高钾可以通过激活培养的星形胶质细胞中的电压门控钙通道来增加细胞内钙水平，²⁰接下来，我们试图研究皮层星形胶质细胞暴露于已知的提高细胞内钙的刺激是否可以模拟高钾对BDNF释放的影响。为了支持这一假设，向BDNF（混合）处理的星形胶质细胞施加谷氨酸（500µM）5分钟后，显示其触发了内吞BDNF分泌(图2).^三谷氨酸诱导的BDNF分泌程度与KCl处理后观察到的相似，BDNF水平在相同的分数内达到峰值。因此，星形胶质细胞可以通过感应递质介导的去极化来提供内吞BDNF分泌。这表明，在生理条件下，胶质活性分子而非电压依赖性兴奋诱导星形胶质细胞去极化，²¹和BDNF分泌。根据这一想法，我们之前已经证明，虽然高频（50 Hz）电刺激会诱导培养神经元分泌内吞性BDNF，¹¹同样的刺激对培养的星形胶质细胞无效。^三我们的数据清楚地表明，电活动不足以诱导胶质细胞分泌内吞性BDNF。^三

ATP介导皮层星形胶质细胞内吞性BDNF的释放

星形胶质细胞分泌的内吞性BDNF使用谷氨酸作为外源刺激，^三这并不一定局限于这种类型的发射机；相反，可以预期，不同的递质可以触发类似的内吞BDNF分泌。这促使我们研究培养的星形胶质细胞在细胞外核苷酸ATP（一种参与突触传递的著名信号分子）触发去极化条件下是否最终释放内吞性BDNF。

为了研究ATP是否可以作为胶质嘌呤能受体的配体来触发内吞BDNF分泌，我们用外源性BDNF（混合物）培养星形胶质细胞10分钟，然后用ATP（100µM）刺激5分钟(图3). 这导致了细胞内BDNF分泌增加，与谷氨酸给药诱导的分泌增加相当(图2)提供证据表明，这两种递质诱导具有类似功效的内吞BDNF分泌。为了进一步了解ATP诱导星形胶质细胞分泌BDNF的机制，我们分别使用ATP类似物2-甲基-Tio-ATP（50µM）或α/ß-亚甲基-ATP（50µM。在BDNF（混合）处理的星形胶质细胞中添加ATP类似物可显著增加灌流液中的BDNF(图3). 我们的结果表明，P2X和P2Y受体使星形胶质细胞对ATP作出反应，最终通过钙升高促进BDNF的释放，这是以前在小胶质细胞中观察到的机制。²²然而，细胞内信号在释放过程中的作用是一个备受争议的问题，需要进一步研究。

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图3。

ATP和ATP类似物介导的皮质星形胶质细胞（左）内吞BDNF的释放将先前暴露于BDNF（混合物）10分钟的星形胶质细胞灌注并用ATP（100µM）刺激5分钟。ELISA定量测定灌流液中BDNF的分泌量，结果显示在应用ATP之前（0至10分钟）、期间（10至15分钟）和之后（15至30分钟）BDNF水平。（右）ATP（100μM）、α/ß-亚甲基-ATP（50μM）或2-甲基-Tio-ATP（50µM）诱导的BDNF分泌增加。数据为平均值±SEM（误差线）。*，P≤0.05。

已知细胞外核苷酸ATP与常规神经递质共同定位于皮质突触，在突触前去极化刺激时可从皮质突触释放或从突触后部位分泌。²³星形胶质细胞与释放的神经递质直接接触，²⁴提示神经胶质细胞分泌内吞性BDNF可能由ATP触发。在突触传递的三分假说中，星形胶质细胞是突触的第三个有效成分，²⁵谷氨酸和ATP从神经元向星形胶质细胞的转运可以根据突触需求发挥复杂的调节信号，维持足够水平的BDNF(图4). 由于BDNF的胶质囊泡释放受神经元活动的调节，²¹然后，星形胶质细胞可将神经元网络活动与神经营养素的局部突触需求耦合。这种BDNF的“按需”供应可能有助于在行为相关的回路中募集活跃的突触；因为那些有助于识别嗅周皮层中的学习对象。¹总的来说，我们的结果表明神经元可能调节胶质BDNF的循环通过不同的递质的释放，表明神经-星形胶质细胞的相互作用在信息处理与认知功能的耦合中可以发挥比先前预期更复杂和功能性的作用。

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图4。

星形胶质细胞（左）的局部和远距离BDNF再循环神经胶质活性谷氨酸和/或ATP通过增加细胞内钙（Ca²⁺). 虽然谷氨酸可以从突触前末端释放，但ATP可以从突触前和突触后末端释放。（右）胶质活性ATP促进细胞内钙的局部升高，随后扩散到同一星形胶质细胞和/或相邻星形胶质细胞的不同末端。这就增加了ATP使胶质细胞发挥细胞网络功能的可能性，该网络能够在附近或长距离突触处进行BDNF胶质再循环。

胶质细胞也善于诱导细胞内钙的局部升高。令人惊讶的是，虽然神经胶质细胞中的钙信号被认为依赖于IP3介导的内部存储释放，但最近的数据表明，皮质星形胶质细胞信号依赖于通过ATP门控P2×1R离子通道的钙内流。²⁶这种钙升高发生在缺乏IP3受体的星形胶质细胞精细过程中，在这种过程中，感觉刺激会引起血流量增加之前星形胶质细胞钙的快速增加。²⁶这些新数据提示，同一星形胶质细胞不同末端的钙依赖性信号通路（包裹多个不同的突触）可能会根据网络活动而不同。此外，局部钙随后扩散（钙波）到邻近的星形胶质细胞。钙波被认为是由于远距离钙信号所需的可扩散ATP而传播的。²⁷这就增加了ATP使胶质细胞发挥细胞网络功能的可能性，细胞网络能够进行信息处理和存储，这些功能通常分配给神经元。²⁸在网络水平上，电刺激传入可能会激活几种类型的神经元和胶质细胞，并同时释放ATP。我们的研究结果表明，ATP介导胞内BDNF分泌增加了胶质网络与神经元网络一起积极参与信息处理和记忆存储的可能性，胶质网络对BDNF的释放具有精确的时间和空间调控(图4). 因此，胶质细胞和神经元网络之间的相互作用可能会增强组织记忆的能力，并大大扩展存储能力。脑源性神经营养因子-胶质细胞循环是否可以作为信号机制参与大脑皮层神经元-胶质细胞网络通信副维萨这是一个很有吸引力的假设，尚待阐明。

材料和方法

如前所述进行释放实验；¹⁰高钾（40 mM）、谷氨酸（500µM）、ATP（100µM。开始灌注后10分钟开始治疗，并维持5分钟。采用双位点ELISA法测定各组分中BDNF的含量。^{10月13日至29日}

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