Nur77通过减弱磷酸烯醇丙酮酸羧激酶sumoylation将葡萄糖代谢转换为糖异生抑制肝癌

Nur77通过PEPCK1调节代谢模式抑制肝癌

代谢重编程是癌症的标志⁴Nur77是否影响HCC代谢尚不清楚。为了解决这个问题，研究了Nur77可能参与葡萄糖代谢的情况。Nur77在Huh7细胞中的过度表达不仅降低了葡萄糖摄取和乳酸排泄，还抑制了细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR）(图2a，顶部，补充图2a，顶部）。HepG2细胞中Nur77的敲除逆转了这些趋势(图2a、底部和补充图2a，底部），表明Nur77可以阻止葡萄糖分解代谢。然而，Nur77过度表达显著增加，而Nur77敲除降低了葡萄糖生成(图2a)这意味着Nur77可以促进葡萄糖异生，这是一种消耗ATP的葡萄糖合成代谢过程。因为ATP在Nur77过表达时耗尽，但在Nur77敲低时积累(图2a)，Nur77可能通过调节葡萄糖代谢抑制肝癌细胞增殖。同样，p53抑制糖异生可能导致肿瘤抑制^30,31; 然而，Nur77仍然调节p53非完整Hep3B细胞的葡萄糖代谢(补充图2b). 因此，p53确实不参与Nur77介导的葡萄糖调节途径。Nur77可以调节葡萄糖代谢(补充图2c)但不是细胞增殖(补充图1k)在正常肝L02细胞中，进一步表明HCC和非转化肝细胞对Nur77的调节方式不同。

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图2

Nur77通过PEPCK1调节肝癌发生的代谢。

(一)分析Nur77过度表达的Huh7细胞（顶部）或Nur77敲除的HepG2细胞（底部）的葡萄糖摄取和生成、乳酸排泄、ECAR、OCR和ATP水平。ECAR bar值代表糖酵解能力，OCR bar值代表ATP生成相关的耗氧量。ECAR和OCR的海马追踪曲线如所示补充图2a. (b条)的表达式级别肽1采用实时荧光定量PCR（top）或western blot和免疫组织化学染色（bottom）检测临床HCC（C）和配对副癌（P）标本中的基因（top和蛋白（botton）。Tubulin用于指示装载蛋白质的数量。比例尺，100μm。(c（c）)肝癌组织中Nur77和PEPCK1蛋白表达水平的正相关(n个=82). (d日)Kaplan-Meier生存曲线显示HCC患者的总生存率与PEPCK1表达水平呈正相关。有82名患者的生存信息。(e（电子）)来自DEN/CCl的HCC样本中内源性PEPCK1的表达水平₄-以及HFD/STZ诱导的WT和Nur77-KO小鼠。(（f）)裸鼠异种移植瘤的图像（左）和重量（右）(n个=6). PEPCK1在Huh7细胞中过度表达，然后将其皮下注射到裸鼠的后侧翼。比例尺，1厘米(克)用Ki67和PCNA免疫组化染色评价裸鼠异种移植瘤中肿瘤的增殖状态。在每只小鼠20个随机选择的区域中对阳性细胞进行量化(n个=6). 比例尺，25μm。(小时,我)PEPCK1首先被敲除，然后Nur77在Huh7细胞中过度表达。葡萄糖摄取和产生、乳酸排泄、ECAR、OCR和ATP水平(小时)，以及细胞增殖(我)分别进行了测量。Tubulin用于指示装载蛋白质的数量。数据表示为至少三个独立实验或括号中所示数量的小鼠的平均值±标准偏差*对<0.05; **对<0.01; ***对<0.001. 使用双尾Student’s分析数据t吨-在中测试(一,（f）,克)，单向方差分析，然后是Tukey事后（post-hoc）在中测试(b条,小时)和Pearson的七方检验(c（c）).

与Nur77在L02细胞中的核定位相反，Nur77主要分布在不同肝癌细胞系的细胞质中(补充图2d)这可能与Nur77在肝癌细胞中失去大多数转录活性有关，因为Nur77的转染并没有诱导其下游靶E2F1的mRNA和蛋白水平（参考文献。³²)在HepG2、Huh7和SMMC-7721细胞中(补充图2e). 相反，Nur77，而不是Nur77 2G突变体，其锌指处的2 Cys到Gly突变导致其DNA结合能力丧失，仍然显著促进L02细胞中E2F1的表达(补充图2e). 因此，Nur77对HCC细胞增殖的抑制可能与其转录活性无关。Nur77 2G仍然抑制SMMC-7721细胞的生长，这一事实进一步支持了Nur77作用的论点(补充图2f). 有理由认为，细胞质Nur77通过与位于细胞质中的代谢相关蛋白的相互作用损害葡萄糖代谢。

有趣的是，对SMMC-7721细胞中免疫沉淀样品的质谱分析表明，PEPCK1，一种位于细胞质中的糖异生速率限制酶，可能是一种新的Nur77结合蛋白(补充图2g，h). 这两种蛋白之间的相互作用通过转染或内源性联合免疫沉淀试验得到证实(补充图2i). 此外，这两个基因和蛋白在临床样本中的表达水平较低，但在副癌组织中的表达较高(图1a和​和2b），2亿)，其蛋白质水平显示出明显的正相关(图2c). PEPCK1表达较低的患者也与临床预后不良密切相关(图2d). 在DEN/CCl中₄-或HFD/STZ诱导的小鼠HCC样本，Nur77的消融伴随着PEPCK1表达水平的降低(图2e). 然而，Huh7和SMMC-7721细胞株中PEPCK1的敲除并没有损害Nur77的表达水平(补充图2j)表明Nur77是PEPCK1功能的上游因子。因此，Nur77可能通过PEPCK1介导抑制肝癌细胞生长。

PEPCK1对Huh7异种移植瘤生长有显著抑制作用(图2f)Ki67和PCNA水平明显下降(图2g). Huh7细胞中PEPCK1持续过度表达(补充图2k（左）导致葡萄糖生成增加、葡萄糖摄取减少、乳酸排泄、ECAR和OCR、ATP耗竭(补充图2l，m，top），并抑制菌落形成和细胞增殖(补充图2n). PEPCK1被击倒扭转了这些趋势(补充图2l，m，底部），表明Nur77和PEPCK1可能参与相同的信号通路，共同调节HCC的发展。Nur77或Nur77 2G的过度表达不再改变葡萄糖代谢、ATP水平(图2h和补充图2o)或细胞生长(图2i和补充图2p)当PEPCK1同时被击倒时(补充图2k，右侧）。总之，可以得出结论，PEPCK1的存在是Nur77通过调节代谢途径抑制HCC的先决条件。

PEPCK1的氨酰化影响其稳定性

据报道，乙酰化是PEPCK1降解的主要转录后修饰¹⁰然而，在当前的研究中，当细胞裂解物与去甲酰化抑制剂NEM孵育时，我们在通过抗SUMO1抗体呈阳性的小鼠HCC样品中观察到两个额外的样本（箭头表示）位于典型的PEPCK1带（星号表示）之上(图3a，左）。DEN诱导的HCC，但非正常肝组织(图3a（右）和临床HCC样本中，但不包括副癌样本(图3b)，这两个特定的带也可以检测到。类似地，只有在NEM存在的情况下才能检测到HepG2细胞中PEPCK1的内源性sumoylation(图3c，顶部）。SUMO1和相应E2酶Ubc9的转染(图3c，底部），或与外源性PEPCK1以及SUMO1和Ubc9一起使用(补充图3a)诱导PEPCK1酰化。相反，转染缺陷的Ubc9突变体（Ubc9^C93S公司)或缺陷SUMO突变体（SUMO^GGAA公司)³³诱导的无氨酰化(补充图3a、b). 然而，三个关键乙酰化位点（PEPCK1）的突变^交流-3KR)在PEPCK1中（参考。¹⁰)不影响sumoylation(补充图3c). 因此，PEPCK1确实是sumoylated。

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图3

氨酰化诱导PEPCK1降解。

(一)在DEN/CCl中₄-诱导的HCC样本（左）或正常肝脏（对照）与DEN/CCl₄-诱导的HCC样品（右），首先免疫沉淀内源性PEPCK1，然后分别与抗PEPCK1抗体或抗SUMO1抗体孵育。星号代表PEPCK1蛋白的位置；箭头表示sumoylation带。(b条)临床肿瘤和配对副癌标本中PEPCK1及其sumoylation的水平。免疫沉淀内源性SUMO1，然后与抗PEPCK1抗体孵育。(c（c）)Top，用抗SUMO1抗体免疫沉淀带有或不带有NEM（20 mM）的HepG2细胞裂解物，然后与抗PEPCK1抗体孵育。Bottom、SUMO1和Ubc9转染293T细胞，Flag-SUMO1免疫沉淀，然后用抗PEPCK1抗体进行蛋白质印迹检测。(d日)Sumoylation对不同肝癌细胞系内源性PEPCK1表达的影响，这些肝癌细胞系转染了SUMO1/Ubc9（top）或经Sumoylion抑制剂、anacardic acid（20μM，12 h）处理后，无论是否转染SUMO1/Ubc9基因（中部和底部）。(e（电子）)Sumoylation减弱了SMMC-7721细胞中PEPCK1的稳定性，这些细胞转染了不同的质粒，然后用CHX（100μg ml）处理⁻¹)用于不同的时间（左）。通过软件Image J（右）定量PEPCK1蛋白的量。(（f）)SMMC-7721细胞中PEPCK1琥珀酰化关键位点的测定。每个小组中PEPCK1蛋白的量都是标准化的。(克)Lys124位点对于用CHX（100μg ml）稳定SMMC-7721细胞中的PEPCK1蛋白非常重要⁻¹)治疗。(小时)用MG132（5μM）或ALLM（20μM）处理SMMC-7721细胞12 h后，Sumoylation通过泛素化途径诱导PEPCK1降解^K124R型和PEPCK1^K471和473R检测到（中部和右侧）。将NEM（20 mM）添加到细胞裂解液中，以抑制每个磺酰化试验中的去磺酰化度。Tubulin或GAPDH用于指示装载蛋白质的数量。数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准偏差*对<0.05; **对<0.01. 采用单因素方差分析和Tukey分析数据事后（post-hoc）测试。

转染SUMO1和Ubc9降低Huh7、SMMC-7721和HepG2细胞系中内源性PEPCK1的表达水平(图3d，顶部），而非活动Ubc9^C93S公司或SUMO^GGAA公司突变体不能(补充图3d). 相反，用鱼腥草酸（一种磺酰化抑制剂）处理细胞³⁴，在这些细胞系中使用或不使用外源性SUMO1和Ubc9刺激PEPCK1表达(图3d、中间和底部）。一贯地，基于环己酰亚胺（CHX）的蛋白质稳定性分析表明，PEPCK1的稳定性仅在SUMO1/Ubc9时显著降低，而在Ubc9时没有显著降低^c93秒或SUMO^GGAA公司，被转染(图3e). SUMO1/Ubc9的转染也导致PEPCK1的大量降解^交流-3KR(补充图3e). 因此，PEPCK1酰化和乙酰化降低了蛋白质的稳定性。

通过质谱分析，许多物种中保守的Lys124、Lys471和Lys473被鉴定为PEPCK1中可能的sumoylation位点(补充图3f). K124R突变完全消除了较大的磺酰化分子，而较小的磺酰基化分子则受到K471R或K473R突变的轻微影响(图3f). 双突变体PEPCK1^K471和473R没有更小的sumoylated蛋白(图3f). 因此，Lys124、Lys471和Lys473是PEPCK1 sumoylation的位点。虽然有三个PEPCK1 sumoylation位点，但Lys124上的sumoylation-而不是Lys471或Lys473上的sumo ylation-与PEPCK1稳定性有关(图3g和补充图3g). 这些结果强烈表明，Lys124在sumoylation调节的PEPCK稳定性中起主导作用。有趣的是，这种氨酰化诱导的PEPCK1降解通过泛素化途径发生，如MG132而非ALLM处理所示，在SUMO1/Ubc9存在的情况下导致PEPCK1积累(图3h（左），同时靶向PEPCK1但不靶向PEPK1的内源性泛素增加^K124R型(图3h，中间）。相比之下，泛素含量的增加仍然可以与PEPCK1结合^K471和473R(图3h，右），这又一次表明Lys124是PEPCK1稳定性的唯一关键位点。

p300通过乙酰化Ubc9增强PEPCK1的酰化

PEPCK1 sumoylation是如何调节的尚不清楚。p300被记录为作为乙酰转移酶诱导PEPCK1乙酰化¹⁰出乎意料的是，p300也显著增强了SUMO1/Ubc9-诱导或内源性PEPCK1 sumoylation(图4a、b)从而抑制不同肝癌细胞中内源性PEPCK1的表达水平(图4b). 相反，p300敲除有效地消除了Ubc9/SUMO1诱导的PEPCK1 sumoylation(补充图4a，左），从而增强不同肝癌细胞中PEPCK1的表达(补充图4a，右侧）。然而，如果没有Ubc9转染，即使存在SUMO1，单独p300也不能显著增强PEPCK1的sumoylation(图4a这表明p300与PEPCK1相扑没有直接关系。事实上，p300可以增强PEPCK1的sumoylation^交流-3KR(补充图4b)或PEPCK1乙酰化^K124R型(补充图4c)进一步证明了p300在PEPCK1酰化和乙酰化中的双重作用。此外，在Ubc9和SUMO1存在的情况下，无论p300转染与否，PEPCK1的稳定性都是不同的(补充图4d). p300似乎选择性地增强了PEPCK1的sumoylation，而不是其他蛋白，因为p300的转染并不影响Ubc9在不同肝癌细胞株中诱导的全局sumoylion(补充图4e). 这些发现不仅暗示了p300在调节PEPCK1的sumoylation中的一种新功能，而且还暗示了PEPCK1的乙酰化和sumoylate是调节PEPCCK1稳定性的两条不可或缺的p300通路。

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图4

p300增强了PEPCK1的合成。

(一)p300增强SUMO1/Ubc9诱导293T细胞的sumoylation。将不同的质粒转染到细胞中，显示了sumoylation。(b条)p300抑制不同肝癌细胞株内源性SUMO1和PEPCK1水平。p300转染细胞，SUMO1免疫沉淀，抗体显示内源性PEPCK1 sumoylation。(c（c）)p300增强的PEPCK1 sumoylation依赖于其乙酰转移酶活性。如图所示，将不同的p300非活性突变体转染到293T细胞中。(d日)p300乙酰转移酶活性对增强293T细胞中Ubc9与PEPCK1的结合至关重要。(e（电子）)p300可以促进Ubc9，但不能促进Ubc9^K65R公司，与293T细胞中的PEPCK1结合。(（f）)p300与Ubc9相互作用^K65R公司293T细胞（左）中Ubc9小于p300，p300可以乙酰化Ubc9，但不能乙酰化Ubc9^K65R公司，用抗乙酰化抗体检测（Ac，右）。(克)Ubc9公司^K65R公司对293T细胞中p300增强的PEPCK1酰化无影响。将NEM（20mM）加入到细胞裂解物中，用于在每次去酰化测定中抑制去酰化。

p300参与PEPCK1合成的模式非常有趣。首先，p300活性对其增强的sumoylation很重要，无论是组蛋白乙酰转移酶结构域的缺失还是p300的催化失活突变^D1399Y型（参考。¹³)和300页^{S1396R/Y1397R}（参考。¹⁰)导致PEPCK1的sumoylation没有增强(图4c)，而不损害两种蛋白质之间的相互作用(补充图4f). 其次，只有原生p300，而不是这些突变体，可以增强PEPCK1和Ubc9之间的相互作用(图4d). 第三，尽管PEPCK1与Ubc9及其突变体Ubc9相互作用^K65R公司其p300乙酰化位点Lys65发生突变（参考文献。³⁵) (补充图4g)，p300仅促进了Ubc9，但不促进Ubc9^K65R公司，针对PEPCK1(图4e). p300与Ubc9的交互效果更好(图4f，左），且仅基本乙酰化的Ubc9，而非Ubc9^K65R公司(图4f，右侧）。这种情况导致p300增强Ubc9-诱导的PEPCK1 sumoylation(图4g)支持Ubc9乙酰化调节不同SUMO靶向蛋白的观点³⁵此外，p300仍然增强了Ubc9对PEPCK1的靶向性^交流-3KR(附图4h)从而诱导PEPCK1的酰化^交流-3KR(补充图4b). 结合以下事实300页和Ubc9公司肝癌患者的基因和蛋白表达水平高于副癌患者(补充图4i，j)可以得出结论，p300通过乙酰化Ubc9和促进乙酰化Ubc9与PEPCK1的结合，可以增强PEPCK1的sumoylation，从而导致肝癌细胞和临床HCC样本中PEPCKl的表达降低。

Nur77通过减弱PEPCK1 sumoylation抑制肝癌

尽管Nur77轻度增强了糖异生基因的转录，如Fbp2公司和Eno3公司在几个肝癌细胞中(补充图5a)，不影响PEPCK1 mRNA水平(补充图5b). 结合Nur77与临床样本中PEPCK1蛋白水平呈正相关(图2c)，我们假设Nur77可能通过调节其sumoylation而损害PEPCK1的表达。事实上，Nur77过表达大大减弱了SUMO1/Ubc9在不同肝癌细胞系中诱导的PEPCK1的sumoylation，即使存在p300(图5a). 内源性PEPCK1在不同细胞系中表达增加(图5b)Nur77转染后一段时间(图5c). Nur77对PEPCK1表达的这一功能是通过提高PEPCK1的蛋白质稳定性来实现的，因为稳定的Nur77表达可以提高PEPCK1或PEPCK1的半衰期^交流-3KRCHX在场(补充图5c). 因此，Nur77通过调节PEPCK1的sumoylation增强PEPCK1的表达。

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图5

Nur77的激活减弱PEPCK1的sumoylation并稳定PEPCK1。

(一)Nur77在不同肝癌细胞系中消除了SUMO1/Ubc9诱导的sumoylation（顶部）和p300增强的sumoolation（底部）。PEPCK1 sumoylation的量由软件Image J进行量化，并在PEPCK1的车道下显示。(b条)Nur77在转染SUMO1和Ubc9的不同肝癌细胞系中提高内源性PEPCK1表达水平的作用。(c（c）)在转染SUMO1和Ubc9的HepG2细胞中，Nur77以时间依赖性的方式提高了PEPCK1蛋白的表达。(d日)Nur77阻断了co-IP检测到的293T细胞中Ubc9与PEPCK1的结合。(e（电子）)Nur77破坏了293T细胞中用特异性抗乙酰化赖氨酸抗体（Ac）检测到的PEPCK1（左）或Ubc9（右）上的p300乙酰化作用。(（f）)裸鼠异种移植瘤的图像（左）和重量（右）(n个=6). 在Huh7细胞中稳定地过表达PEPCK1或PEPCK1 K124R，然后将Nur77进一步稳定地转染到这些细胞中。将细胞皮下注射到裸鼠的后侧翼。将1 cm的比例尺NEM（20 mM）添加到细胞裂解液中，以抑制每个磺酰化试验中的去甲酰化。GAPDH用于指示装载蛋白质的数量。数据表示为括号中所示数量的小鼠平均值±s.e.m*对<0.05; ***对<0.001. 采用单因素方差分析和Tukey分析数据事后（post-hoc）测试。

Nur77下调PEPCK1的sumoylation并增加PEPCK1的表达可能有两种机制：（1）Nur77与Ubc9竞争与PEPCK1的相互作用，以及（2）Nur71通过损害p300活性影响Ubc9的乙酰化。我们的数据表明，这两种机制都涉及。首先，Nur77和Ubc9可以竞争性地结合到PEPCK1中相同的1–280氨基酸残基区域，该区域覆盖关键的sumoylation位点Lys124(补充图5d)，因此Nur77中断了Ubc9-PEPCK1交互(图5d)并减弱Ubc9诱导的PEPCK1 sumoylation(图5a). 第二，Nur77过度表达可阻断p300活性以诱导PEPCK1或Ubc9乙酰化(图5e)伴随着Nur77对p300-Ubc9或p300-PEPCK1相关性的损害(补充图5e、f)根据我们之前的发现，Nur77通过相互作用抑制p300乙酰化活性³⁶.

为了进一步评估PEPCK1 sumoylation在Nur77抑制的HCC样本中的作用，我们进行了异种移植瘤实验，其中PEPCK1或PEPCK1^K124R型首先转染Huh7细胞，然后在这两个细胞系中分别稳定表达Nur77(补充图5g). 如所示图5f，转染PEPCK1或PEPCK1^K124R型对照组单独用药对肿瘤生长无明显影响。然而，进一步过度表达Nur77通过调节PEPCK1而非PEPCK1显著抑制肿瘤生长^K124R型。这个体内结果一致表明，Nur77对肿瘤生长的抑制作用是通过PEPCK1介导的，该介导与赖氨酸124处的PEPCK1-sumoylation相关。

抗体和试剂

抗-HA（cat.#H-9658；1:5000稀释度用于western blot）、抗Flag（cat.#F-1804；1:5000倍用于western-blot）、抗PARP（cat.#P7605；1:5000淡化度用于wester blot）和抗β-微管蛋白（cat.#T4026；1:5000稀用于wester-blot）抗体购自Sigma。抗-PCK1（cat.#D12F5；1:2000稀释度用于western blot）、抗Nur77（cat.#D63C5；1:2000稀用于westernblot），抗SUMO1（cat.#4930S；1:2000稀释剂用于wester-blot）和抗乙酰化赖氨酸（cat.#9681S；1:200稀释度用于western-blot）和抗甲素（cat.#15D3；1:2000倍用于westerblot）抗体来自细胞信号技术。抗-PEPCK-C（cat.#P-14；1:2000稀释用于western blot）和抗-Ubiquitin（cat.#sc-8017；1:2000淡化用于westernblot）抗体来自Santa Cruz生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。抗Myc（目录号11667149001；用于蛋白质印迹的1:5000稀释）抗体来自Roche。抗-SUMO1（cat.#332400；1:2000稀释用于western blot）抗体来自ThermoFisher scientific。抗-GAPDH（类别#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M20006”，“term_id”：“211565”，“term_text”：“M30006”}}M20006型; western blot抗体的1:5000稀释度来自Abmart生物技术。抗乙酰化赖氨酸（cat.#05–515；1:2000稀释用于western blot）抗体来自Millipore。免疫组化的抗-PEPCK1（cat.#ab133603）和抗钉子（cat.#ab180714）抗体来自Abcam。免疫组织化学的抗Nur77（cat.#ARP31941T100）抗体来自Aviva Systems Biology。免疫组织化学的抗ki-67（cat.#12202S）抗体来自细胞信号技术。

化学试剂N-乙基马来酰亚胺（类别号128-53-0）和5-氮杂-2-脱氧胞苷（类别号2353-33-5）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Anacardic acid（目录号16611-84-0）来自Abcam（英国剑桥）。CHX（cat.#2112s）来自细胞信号技术（美国马萨诸塞州贝弗利）。MG132（类别号s2619）来自Selleckchem（美国德克萨斯州休斯顿）。2-NBDG（目录号N13195）来自Invitrogen（美国马里兰州盖瑟斯堡）。

临床肿瘤样本

新鲜HCC癌及癌旁组织取自厦门大学中山医院，患者知情同意，经中山医院医德委员会批准。这些样品用于实时PCR、western blot和MSP分析。肝癌及其相应的邻近肝组织微阵列从中国上海奥图生物技术公司获得。采用免疫组织化学染色法检测159例（分类号HLiv-HCC180Sur-03、HLiv-HCC 180Sur-04）中Nur77的表达，检测82例（分类编号HLiv-HCC180Sur-02）中PEPCK1和蜗牛的表达，获得完整的患者诊断和生存信息。

动物模型

野生型（WT）和Nur77基因敲除（KO）小鼠（C57BL/6J背景）购自美国Jackson实验室，并在12小时光照/12小时黑暗循环中保持，可自由获取食物和水。在WT和KO小鼠之间以盲法评估肿瘤数量或肿瘤重量，但不是随机分配。所有动物实验均经厦门大学动物伦理委员会批准（受理号：XMULAC20120030）。

对于DEN/CCl₄-诱导肝癌模型²⁴，15日龄雄性小鼠腹腔内注射二乙基亚硝胺（DEN，溶于PBS，25 mg kg⁻¹体重）。一周后，小鼠腹腔内注射10%四氯化碳（CCl₄每公斤体重0.5毫升玉米油），每周一次，持续22周。

用于HFD/STZ诱导的肝癌模型²⁵，2日龄雄性小鼠腹腔注射STZ（溶于柠檬酸缓冲液中，200μg/只）。四周后，用高脂肪饮食（HFD，60%的热量来自脂肪，Research Diets，Inc.）喂养小鼠至20周龄，然后处死。记录肿瘤数量和肝脏重量，并计算肝脏与体重的比值。

裸鼠模型取厦门大学实验动物中心雄性裸鼠（BALB/c，18~20g，6-7周龄）。PEPCK1或PEPCK124R在Huh7细胞中稳定表达，进一步转染或不转染Nur77。电池（2×10⁶细胞）悬浮在150μl PBS中，并皮下注射到小鼠的两侧后部。接种后24天，处死小鼠并记录肿瘤重量。

免疫组织化学染色和评分

使用DAKO EnVision系统（瑞士楚格DAKO Diagnostics），用二甲苯和乙醇将福尔马林固定石蜡包埋样品脱蜡，以进一步进行过氧化物酶免疫组织化学染色。将载玻片与稀释在含有BSA的Tris缓冲盐水中的抗体在4°C下孵育过夜。然后使用过氧化物酶标记聚合物和底物色素来可视化感兴趣蛋白的染色。

免疫组织化学染色采用免疫反应评分（IRS）系统进行半定量⁶²IRS给出了0-12的范围，作为比例得分（0-4）和染色强度得分（0-3）之间乘积。比例分数表示阳性细胞的估计百分比（0：无阳性细胞；1：<10%阳性细胞；2：10-50%阳性细胞；3：51-80%阳性细胞；4：>80%阳性细胞）。强度得分代表染色的平均强度（0：无染色；1：黄色；2：粘土层；3：茶色）。每个样本由三人以盲法进行评估，平均分数被视为最终IRS。IRS解释如下：0-1：阴性；2-3：轻度表达；4-8：中度表达；9–12：表达力强。

质粒结构

带有HA标签的人类p300构建物之前已经建立⁶³p300-ΔHAT是通过从p300中删除氨基酸残基1413-1721而产生的。人类HA-Ubc9和Myc-SUMO-1由Olle Larsson（瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所）提供。旗钉是来自于春冬（中国福建厦门大学）的礼物。Nur77、PEPCK1、p300、HA-Ubc9或MYC-SUMO-1的点突变是用Quick Change诱变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA，USA）产生的，并通过测序进行验证。如有要求，可提供各种构造的基本信息。

免疫沉淀和western印迹

如前所述进行免疫沉淀⁶⁴简单地说，用裂解缓冲液ELB（150 mM NaCl、100 mM NaF、50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、0.5%Nonide P-40（NP-40）和1 mM PMSF）在冰上裂解细胞，然后用适当的抗体将细胞裂解液孵育2小时，然后用蛋白G-Sepharose珠孵育另1小时h.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，将回收到珠上的蛋白-抗体复合物进行western blot分析，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。用一级抗体探测膜，然后与二级抗体孵育。使用增强化学发光法检测免疫反应产物（Pierce，Socochim SA，瑞士洛桑）。未删节的western blot扫描显示于补充图7.

慢病毒系统的产生

使用基于慢病毒的载体pLL3.7在肝细胞癌细胞中表达shRNAs。将寡核苷酸（Invitrogen）退火并亚克隆到pLL3.7中。通过转染亚融合HEK293T细胞、慢病毒载体和磷酸钙转染包装质粒产生慢病毒。转染48小时后收集病毒上清液，在75000离心克90分钟后，重新悬浮并通过0.45μm过滤器（Millipore）过滤。将新接种的肝癌细胞感染慢病毒，通过western blot或RT-PCR检测靶基因的敲除效率。shRNA靶向mRNA的寡核苷酸序列（5′至3′）分别为：Nur77的GGGCATGGTGAGGAAGAGAT、PEPCK1的GACCATCAGACAAT、p300的CTTCACATCCGACAT和蜗牛的GGTGTAACTGCAA。

集落形成和细胞增殖测定

对于集落形成分析，细胞接种在60 mm培养皿中，并在37°C和5%CO下培养₂持续15天。菌落用甲醇固定，用0.1%结晶紫在20%甲醇中染色15分钟，然后拍照。为了进行细胞增殖，将细胞分为三份接种在六孔板的每个孔中，并在6天内每天计算细胞数量。

定量实时PCR

使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，并使用FastQuant RT Kit（中国北京天根）合成互补DNA。使用SYBR Green Power Master Mix按照制造商的协议（美国麦迪逊市普罗米加）进行特定定量实时PCR实验。用于qRT-PCR分析的特异性引物为Nur77的5′-CTCTGGAGGTCATCCGCAAG-3′，5′-CTGGCTAGACCTGTACGCC-3′；PEPCK1的5′-GCTCTTGAGAGAGAGAATGG-3′，5′-TGCTCTGGGTGAGAGATC-3′；E2F1的5′-GAGGTCACTTCTGAGGAGGAG-3′，5′-GCTGAGAGAGACTGG-3′；p300的5′-AATCCTTCCATACCAACC-3′，5′-GAGGGCAGTCAGAGCCATAC-3′；Ubc9的5′-ATTATCCATCTTCTCCGCCACA-3′，5′-CTCTCTTGAGCTGGGTCTT-3′；FBP1的5′-GGTGACAAGGATGGAAGATA-3′，5′-GGGAACTTCTCCTCTGGATG-3′；5′-ACCGCTCTTGGTGAATTT-3′，5′-ATTCAGTGGTGGCCGCAT-3′用于FBP2；ENO3的5′-CGCAATGGGAAGTACGATCT-3′，5′-TCGAGAGACACAGATA-3′；G6Pc的5′-GGGAAAGATAAGCCGACCTAC-3′，5′-CAGCAAGGTCGGACAG-3′；β-actin的5′-CAGCCTTCCCCTGGGCATG-3′，5′-ATTGTGCTGGGTCCAGGCAG-3′。

荧光素酶报告试验

用多种质粒转染细胞，包括荧光素酶相关报告基因、β-半乳糖苷酶（β-gal）表达载体和其他需要的载体。转染后，对细胞进行裂解并测量荧光素酶和β-半乳糖活性。β-半乳糖活性用于归一化转染效率。

亚细胞分馏的制备

亚细胞分离如前所述²⁰简单地说，在用PBS清洗后，将细胞刮除并溶解在0.5 ml低渗NP-40缓冲液（10 mM Hepes（pH 7.9）、10 mM KCl、0.15%NP-40、0.1 mM EDTA（pH 8.0）和0.1 mM EGTA和蛋白酶抑制剂）中的冰上10 min。将细胞裂解液以4000 rpm离心5 minmin.收集上清液（细胞质部分）。用低温低渗NP-40缓冲液将含核颗粒洗涤两次，然后再悬浮在SDS缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM EDTA和1%SDS及蛋白酶抑制剂）中进行超声处理，以获得核部分。

ChIP测定

将甲醛直接添加到培养基中，使细胞交联，最终浓度为1%，并在37°C下培养10分钟。将颗粒悬浮在200μl SDS裂解缓冲液（1%SDS、10 mM EDTA和50 mM Tris（pH 8.1））中，然后进行超声处理。离心后，使用特定抗体对可溶性染色质进行免疫沉淀。通过苯酚/氯仿萃取回收DNA，并使用针对相关启动子的引物进行PCR分析。

氨酰化和泛素化分析

检测PEPCK1-SUMO1体内将含有N-乙基马来酰亚胺（NEM，20 mM）（一种有效的去甲酰化酶抑制剂）的预分离细胞裂解物与抗PEPCK1或抗SUMO1抗体在4°C下旋转4 h。用ELB裂解缓冲液洗涤蛋白G-Sepharose上收集的免疫沉淀物三次，然后进行western blot。为了在转染Flag-PEPCK1、HA-Ubc9和Myc-SUMO1的细胞中检测sumoylated-PEPCK1，将含有NEM的细胞裂解液与抗Flag抗体孵育，用蛋白G-Sepharose沉淀，用ELB洗涤三次，并用western blot分析。

对于泛素化分析，细胞裂解物用抗Flag抗体进行免疫沉淀，在1%SDS中煮沸5分钟洗脱，在ELB裂解缓冲液中稀释10倍，然后用抗Flug抗体重新免疫沉淀。western blot检测泛素结合蛋白。

DNA甲基化分析

使用EpiTect系统（德国希尔登Qiagen Gmbh）用亚硫酸氢钠处理基因组DNA。简单地说，每次反应使用20μl体积的2μg DNA，并与85μl亚硫酸氢盐和35μl DNA保护缓冲液混合。用20μl缓冲液EB洗脱的EpiTect自旋柱回收亚硫酸氢处理的DNA。然后，对每个引物对的完全甲基化和非甲基化对照DNA样品进行测试。在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳后分析PCR产物。

代谢分析

对于葡萄糖摄取测定，细胞接种在六孔板中，然后在37°C下用30 nM 2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）处理1 h。流式细胞术分析2-NBDG的摄取。

为了测量葡萄糖输出量，将细胞接种在六孔板中。用补充有2 mM丙酮酸钠和20 mM乳酸钠的1 ml无葡萄糖DMEM替换培养基。培养3 h后，收集培养基，并使用葡萄糖比色/荧光测定试剂盒（Biovision）测量葡萄糖浓度。用POLARstar Omega（BMG Labtech，VIC，Australia）在Ex/Em＝535/587nm处测量上清液的吸光度。

OCR和ECAR使用Seahorse Biosciences XF96分析仪（马萨诸塞州北比勒里卡）进行测量。细胞在平板中培养24小时，然后在37°C的XF培养基（含有25 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的非缓冲DMEM）中驯化2小时。根据制造商手册，使用XF细胞Mito应力测试曲线测量OCR。简言之，在基础条件下测量基础OCR，然后依次向每个孔加入寡霉素（3.5μM）、羰基氰化物对三氟甲氧基苯基腙（2μM）和鱼藤酮/抗霉素A（1μM）。根据制造商手册，使用XF糖酵解应激试验曲线测量ECAR，并在基本条件下测量基础ECAR，然后依次将葡萄糖（10 mM）、寡霉素（3.5μM）和2-脱氧葡萄糖（100 mM）添加到指定的最终浓度。XF分析由连续混合（3分钟）、暂停（3分钟”）和测量（5分钟）循环组成，允许每10分钟测定一次OCR/ECAR。ECAR条形值代表糖酵解能力，其通过从最大值中减去非糖酵化酸化得到。OCR条形值代表ATP生成相关的耗氧量，即从基础值中减去非线粒体呼吸和质子泄漏。

ATP水平检测

根据试剂盒说明，使用ENLITEN ATP分析系统生物发光检测试剂盒（Promega）通过生物发光法测定细胞内ATP水平。简单地说，电池（2×10⁴)在6孔板中接种24小时，然后收集并用500μl冰冷均化缓冲液（0.25M蔗糖和10mM HEPES NaOH（pH 7.4））均化。将等量的冰镇10%三氯乙酸（TCA）加入匀浆中，摇晃20 s，然后在10000下离心克在4°C下保持10分钟。收集上清液（400μl），并将其添加到200μl三醋酸缓冲液（1 M，pH 7.75）中进行中和。用去离子水将上清液稀释50倍，并使用20μl稀释提取物通过光度计进行ATP测定。

相互作用蛋白和sumoylated位点的鉴定

为了检测与Nur77的相互作用蛋白，将Flag-Nur77转染到293T细胞中，然后用抗Flag抗体免疫沉淀并用200μg ml洗脱⁻¹标记肽（Sigma）。蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后进行银染色。从银染凝胶中切下可见带，用胰蛋白酶在凝胶中消化蛋白质，并用液相色谱-质谱法进行分析。

为了检测PEPCK1 sumoylation位点，将转染Flag-PEPCK、HA-UBC9和Myc-SUMO-1（RGG）的293T细胞与抗Flag抗体孵育。纯化后的PEPCK1蛋白经8%SDS-PAGE分离，考马斯蓝染色。SUMO1-PEPCK1结合物在单独的凝胶切片中切除。蛋白质用胰蛋白酶在凝胶中消化。在与Eksigent NanoLC Ultra 2D Plus HPLC系统连接的AB Sciex TripleTOF 5600质谱仪上分析胰蛋白酶肽。使用ProteinPilot V4.5β对MS和MS/MS数据进行解释。手动检查光谱以消除假阳性，不包括低信噪比的光谱、错误的修饰赋值和低于95%的置信值，除非在与理论MS/MS产品离子光谱进行比较后，由于存在a-离子而证明是合理的。

统计分析

所有统计分析均由GraphPad Prism 5进行。统计数据表示为平均值±标准误差t吨-测试或单向方差分析，然后是Tukey事后（post-hoc）测试。应用Pearson卡方检验分析临床HCC组织中Nur77与PEPCK1、Nur77与PCNA、Nur77与核蜗牛的相对免疫反应评分（IRS）的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析评价Nur77或PEPCK1表达与肝癌预后的关系。显著性阈值被视为具有统计学意义(对≤0.05），高度显著(对≤0.01）或极显著(对≤0.001).

我们感谢Olle Larsson博士（瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所）慷慨提供HA-UBC9和Myc-SUMO-1质粒，Flag-Snail是Yu Chundong博士（中国福建厦门大学）的礼物。赵世民博士（中国上海复旦大学）为乙酰化蛋白的免疫沉淀提供抗乙酰化赖氨酸抗体。这项工作得到了国家自然科学基金（U1405224）、科技部和国家自然科学资金（2014CB910602）、高校学科人才引进计划（111项目，B12001）、，厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室开放研究基金（SKLCSB2016KF001）。