Oncotarget公司。2016年9月27日；7(39): 63767–63778.
RSPOs促进HSC活化并促进肝纤维化
,1,2 ,三 ,4 ,5 ,2和2
新光音
1中国浙江省嘉兴市嘉兴学院附属妇幼保健院消化与肝病中心，邮编314001
2中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院消化与肝病中心，314001
慧星易
三浙江大学第二附属医院重症监护室，中国浙江省杭州市，310009
王林林（Linlin Wang）
4浙江大学医学院基础医学科学系，杭州，310058
吴万新
5中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院病理科，314001
吴晓军
2中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院胃肠病学和肝病中心，邮编314001
凌华于
2中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院消化与肝病中心，314001
1中国浙江省嘉兴市嘉兴学院附属妇幼保健院消化与肝病中心，邮编314001
2中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院消化与肝病中心，314001
三中国浙江省杭州市浙江大学第二附属医院重症监护室，310009
4浙江大学医学院基础医学系，杭州，310058
5中国浙江省嘉兴市嘉兴学院第一附属医院病理科，314001
2016年2月18日收到；2016年8月24日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
摘要
屋顶板特异性响应蛋白（RSPO）是有效的Wnt途径激动剂，参与广泛的发育和生理过程。本研究探讨了RSPOs在肝纤维化尤其是肝星状细胞（HSC）激活中的活性和机制。通过纤维化生物标记物（α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白-I）、表型变化（脂滴积聚）和增殖增加来评估HSC激活。同样，通过核β-catenin的表达和T细胞特异性转录因子（TCF）的活性来评估Wnt通路的活性。我们发现RSPOs在人纤维化肝组织中过度表达，并且其表达与肝纤维化分期相关。体外研究表明，在HSC激活过程中，RSPOs水平升高，用RSPOs刺激可增强Wnt通路活性，随后促进HSC激活。此外，体内实验表明，RSPOs的敲除同时抑制Wnt通路活性和HSC激活。有趣的是，Wnt信号通路的抑制剂Dickkopf1削弱了RSPO对HSC的影响。综上所述，我们的结果表明RSPOs通过增强Wnt通路促进HSC活化并促进肝纤维化。
关键词：RSPO、肝纤维化、Wnt途径、HSC
简介
肝纤维化是对慢性肝损伤的可逆创伤治疗反应，其晚期肝硬化是全球最常见的死亡原因之一[1–三]. 更糟糕的是，肝硬化患者发生肝细胞癌（HCC）的风险最高，HCC是第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因[4]. 目前，肝纤维化的最佳治疗依赖于早期诊断。然而，肝纤维化的早期阶段是无症状的，因此使肝纤维化成为一个巨大的医学挑战。
肝星状细胞（HSC）激活和永存是肝纤维化的中心事件[1,2]. 细胞内事件驱动HSC激活和永存的报道越来越多，其中Wnt通路已被揭示起关键作用[5–7]. Wnt信号在体内稳态期间对组织更新和修复至关重要[8,9]. 已证明顶板特异性响应蛋白（RSPOs）强烈增强Wnt途径，尤其是通过增强β-连环蛋白的转录活性[10,11]. RSPO蛋白家族由四个同源成员（RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4）组成，在脊椎动物中进化保守，参与广泛的发育和生理过程[10,11]. 先前的研究已经证明，RSPO1-LGR5（富含亮氨酸的重复性G蛋白偶联受体5）轴在组织损伤时对肝干细胞至关重要[12]RSPO1对肠干细胞诱导至关重要[13,14]. 此外，RSPO2和RSPO3与结肠癌相关[15,16]. 上述研究表明，RSPOs在胚胎发育和组织稳态期间对细胞增殖、分化和存活的调节至关重要。然而，RSPOs与肝纤维化之间的关系尚未得到广泛研究。
在本研究中，我们观察到RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）在人类肝纤维化组织中的高表达，并且其表达与肝纤维化分期相关。体外研究表明，RSPOs水平在HSC激活过程中增加，与RSPOs共同培养可促进HSC激活。此外，通过慢病毒传递击倒小鼠中的RSPOs可抑制Wnt通路活性和HSC激活。此外，众所周知的Wnt抑制剂Dickkopf1（DKK1）抑制了RSPOs对HSC激活的影响。我们的研究表明，RSPO促进肝纤维化的发生，并表明RSPO可能是肝纤维化早期诊断和治疗干预的潜在靶点。
结果
RSPO在人纤维化肝组织中的过度表达
我们评估了肝纤维化临床样本中RSPOs蛋白的表达。分别用抗人RSPO1、RSPO2和RSPO3的抗体进行免疫组织化学染色，共检测了63个人纤维化肝组织样本。取10例正常肝组织作为对照。如果细胞核或细胞质染色呈阳性，则认为样本呈阳性。如图所示（代表性图片），RSPOs染色多见于HSC的细胞质中。在63例患者中，36例（57.1%）的纤维化肝组织中RSPO1强烈表达（评分2或3），而其他患者（42.9%）的免疫反应较弱（评分0或1）。然而，正常肝组织中RSPO1的表达显著低于纤维化组织（Wilcoxon Signed Ranks Test，第页= 0.019). 在RSPO2和RSPO3染色中也发现了类似的表达模式。RSPO2在纤维化组织中的强表达和弱表达分别为38（60.3%）和25（39.7%），而在正常组织中RSPO2的表达明显较低（Wilcoxon Signed Ranks Test，第页= 0.012). RSPO3在纤维化组织中的强表达和弱表达分别为38（60.3%）和25（39.7%），而正常组织中RSPO3的表达显著低于纤维化组织（Wilcoxon Signed Ranks Test，第页= 0.004).
RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）在人类纤维化肝组织中过度表达(A类)免疫染色的代表性图片显示，RSPOs在人纤维化肝组织中呈阳性表达，而在人正常肝组织中则呈阴性表达（bar=50μm，放大倍数×400）。(B类)人纤维化肝组织中RSPOs mRNA水平显著升高(n个=32）与人类正常肝组织相比(n个= 10). (C类)Western Blot分析表明RSPOs在人纤维化肝组织中过度表达。数据表示三个独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差**第页与人类正常肝组织相比<0.01。
为了验证这一发现，用实时PCR检测了人纤维化肝组织中RSPOs的mRNA水平。对32例人类纤维化肝组织样本进行了检查，并以10例正常肝组织样本作为对照。纤维化组织中RSPOs的mRNA水平显著升高(第页RSPO1、RSPO2和RSPO3）比正常组织（图). Western blot分析肝组织中RSPOs的蛋白表达。Western blot分析的结果（图)与PCR实验结果一致，RSPOs在纤维化组织中的蛋白表达增加。
RSPOs的表达与肝纤维化分期相关
分析RSPOs表达与肝纤维化临床病理特征的相关性。如表所示，RSPOs的表达与患者年龄（Mann-WhitneyU型测试，第页RSPO1=0.826，第页RSPO2=0.955，以及第页=0.113（RSPO3）或性别（Mann-WhitneyU型测试，第页RSPO1=0.638，第页RSPO2=0.705，以及第页=0.536（对于RSPO3）。有趣的是，RSPOs的表达与肝纤维化阶段的改良Knodell评分密切相关（Kruskal-Wallis秩和检验，第页<0.01（RSPO1、RSPO2和RSPO3）[17].
表1
肝纤维化患者的临床病理特征和RSPO表达
| 特点 | 患者人数 | RSPO1型 | RSPO2号机组 | RSPO3号机组 |
|---|
| 弱 | 强大 | P（P）价值 | 弱 | 强大 | P（P）价值 | 弱 | 强大 | P（P）价值 |
|---|
| 年龄 | | | | | | | | | | |
| ≤ 50 | 18 | 8 | 10 | 0.826 | 7 | 11 | 0.955 | 11 | 7 | 0.113 |
| > 50 | 45 | 19 | 26 | | 18 | 27 | | 14 | 31 | |
| 性别 | | | | | | | | | | |
| 男性 | 37 | 18 | 19 | 0.638 | 17 | 20 | 0.705 | 15 | 22 | 0.536 |
| 女性 | 26 | 9 | 17 | | 8 | 18 | | 10 | 16 | |
| 诺德尔得分 | | | | | | | | | | |
| 我 | 11 | 10 | 1 | | 8 | 三 | | 8 | 三 | |
| 二 | 17 | 12 | 5 | < 0.01 | 10 | 7 | < 0.01 | 13 | 4 | < 0.01 |
| 三 | 23 | 5 | 18 | | 7 | 16 | | 4 | 19 | |
| 四、 | 12 | 0 | 12 | | 0 | 12 | | 0 | 12 | |
培养激活HSC期间RSPOs蛋白和mRNA增加
我们进一步分析RSPOs在培养激活小鼠HSC期间的表达。培养新鲜分离的小鼠HSC在体外一天、两天、七天和十天。然后检测RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）、纤维化生物标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原蛋白-I的蛋白表达（图)Western blot检测。结果表明，与第1天和第2天相比，第7天α-SMA和胶原蛋白-I的蛋白表达显著增加，这表明新分离的HSC正在经历从静止细胞到高度成纤维细胞的表型转换。有趣的是，α-SMA和胶原蛋白-I的蛋白表达在第10天保持较高水平，这意味着激活的HSC会持续存在。同样，完全激活的HSC（第7天和第10天）中RSPOs的蛋白表达显著升高。免疫荧光分析也观察到类似结果（图). 为了证实上述发现，RSPOs的mRNA水平（图)通过实时PCR检测。我们发现RSPOs的mRNA水平在第1天和第2天之间没有明显变化，而在第7天和第1天之间有显著增加(第页RSPO1、RSPO2和RSPO3）和第10天和第1天<0.01(第页RSPO1、RSPO2和RSPO3均<0.01）。
在培养激活小鼠HSC期间，RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）的表达增加(A类)Western blot分析显示RSPOs、α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的蛋白表达随着时间的推移而增加。(B类)免疫荧光结果与WB实验结果一致。(C类)完全激活HSC（第7天和第10天）中RSPOs mRNA水平显著高于静止HSC（第一天）；mRNA水平在第1天和第2天之间没有显著差异。(D类)完全激活的HSC中TCF活性升高（第7天和第10天），第1天和第2天之间没有明显变化。数据表示三个独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差*第页与静止HSC（第1天）相比<0.05**第页与静止HSC相比，<0.01。
分析HSC培养起始期间WNT/β-catenin途径的活性。与静止的HSC（第1天和第2天）相比，完全激活的HSC中核β-catenin的表达显著上调（图). 同样，TCF活动在第7天和第10天显著升高，而在第1天和第2天之间没有显著变化（图). 这些发现表明细胞质β-连环蛋白稳定并移位到细胞核，随后激活完全激活的HSC的TCF/LEF（淋巴增强因子结合因子）依赖性转录。
用重组RSPOs外源性刺激增强WNT途径活性，随后促进HSC活化
为了确定RSPOs在肝纤维化形成中的功能，将新鲜分离的小鼠HSC与重组RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）共同培养。未经治疗的静止HSC作为对照。蛋白质表达（图)和信使核糖核酸水平（图)分别通过蛋白质印迹分析和实时PCR检测α-SMA、核β-连环蛋白和胶原-I的表达。与RSPOs共培养时，α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的mRNA水平显著增加(P（P）RSPO1、RSPO2和RSPO3均<0.01）。因此，当重组RSPOs刺激时，α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的蛋白表达显著增强。
RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）增强WNT途径活性，随后促进HSC的纤维生成和增殖，而DKK1抑制HSC的激活(A类)重组RSPOs刺激新分离的HSC中α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的蛋白表达上调，而重组DKK1导致活化HSC中的α-SMA，核β-catanin和胶原-I的下调。(B类)实时PCR结果与Western blot分析结果一致。(C类)油红O染色显示，重组RSPOs处理HSC后脂滴减少，而重组DKK1（bar=50μm，放大×400）刺激后脂滴无明显变化。(D类)与对照组相比，重组RSPOs处理后TCF活性显著增加，而重组DKK1处理后则降低。(E类)MTT分析显示RSPO上调HSC增殖，而DKK1抑制HSC增殖。数据表示三个独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差*第页与对照组（未经重组RSPO和DKK1处理的静止HSC）相比<0.05**第页与对照组相比<0.01。
为了了解RSPOs在WNT/β-catenin途径激活和随后HSC激活中的作用，在RSPOs刺激下的TCF活性（图)通过荧光素酶报告分析。实验结果与上述发现一致，即当用重组RSPOs处理时，TCF活性显著增加(第页RSPO1、RSPO2和RSPO3均<0.01）。
肝损伤后，HSC经历从静止的维生素a储存细胞向缺乏细胞质脂质滴的肌纤维母细胞样细胞的表型转变[1]. 油红O染色显示与重组RSPOs共同培养的HSC中脂滴减少（图)这与RSPO促进HSC活化的上述结果一致。
以前的研究表明HSC的激活可诱导增殖反应[1]. 增殖试验结果表明，经RSPO处理后，HSC的生长显著增加（图). 总的来说，这些发现表明与RSPOs共培养增强了WNT途径的活性，随后促进了HSC的激活。
DKK1影响HSC激活
为了了解Wnt/β-catenin途径是否是RSPOs激活和促成纤维作用的介体，我们用重组DKK1处理激活的小鼠HSC，而未经处理的静止HSC作为对照。蛋白质表达（图)和mRNA水平（图)分别用Western blot和real-time PCR检测α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白I。结果表明，与对照组相比，α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的mRNA水平和蛋白表达均无明显变化。油红O染色（图)HSC细胞质中脂滴增多。荧光素酶报告试验表明TCF活性显著降低(第页=0.012）（图). HSC生长曲线与对照组几乎相同（图). 这些结果表明，DKK1可能通过抑制Wnt信号活性来抑制RSPO对HSC激活的影响。
RSPOs的敲除抑制WNT通路活性和HSCs激活
为了全面了解RSPOs在肝纤维化形成中的生物学作用以及上述发现的潜在机制，通过慢病毒传递实现了RSPOs基因沉默。通过实时PCR验证慢病毒传递对RSPOs表达的影响。结果显示，RSPO和DKK1的mRNA水平均降低（图). 为了进一步阐明RSPO诱导的HSC活化的机制，体内对小鼠进行慢病毒传递。CCl公司4-将诱导性肝纤维化小鼠分为五组(n个=每组12）。每组通过尾静脉注射转染一种慢病毒载体（Lenti-shRSPO1、Lenti-sh-RSPO2、Lenti-shRSPO3、Lentis-shDKK1和Lenti-sh control作为对照）。采集小鼠HSC进行进一步分析。蛋白质表达（图)和mRNA水平（图)分别用Western blot和real-time PCR检测α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白I。shRSPOs组α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的mRNA水平显著降低(第页与对照组相比，shRSPO1、shRSPO2和shRSPO3的差异均<0.01。相反，α-SMA的mRNA水平(第页<0.01），核β-连环蛋白(第页<0.01）和胶原蛋白-I(第页=0.022），shDKK1组显著高于对照组。Western blot检测结果与PCR检测结果一致，shRSPOs组α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白I的蛋白表达降低，而shDKK1组增加。
敲除RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）抑制WNT通路活性和HSC激活，而敲除DKK1则增强RSPOs的表达(A类)实时PCR结果显示，慢病毒传递降低了RSPOs和DKK1的mRNA水平。(B类)与对照组相比，敲除RSPOs可下调α-SMA、核β-catenin和胶原蛋白-I的表达，而敲除DKK1可增强α-SMA，核β-catanin和胶原-I的表示(C类)实时PCR结果与Western blot分析结果一致。(D类)油红O染色显示，敲除RSPOs可增加HSC中的脂滴，而敲除DKK1可减少脂滴（bar=50μm，放大倍数×400）。(E类)与对照组相比，RSPOs敲除HSC的TCF活性显著降低，而DKK1敲除显著增加TCF活性。(F类)MTT分析显示RSPOs敲除抑制HSC增殖，而DKK1敲除促进HSC增殖。数据表示三个独立实验的平均值，误差条表示平均值的标准偏差*第页与对照组（CCl4诱导的肝纤维化小鼠通过慢病毒转导干扰siRNA）相比<0.05**第页与对照组相比<0.01。
油红O染色显示shRSPOs（shRSPO1、shRSPO2和shRSPO3）中的脂滴增加，这表明活化的HSC可能正在恢复到更静止的表型（图). 荧光素酶报告试验表明，shRSPOs组的TCF活性显著降低(第页对于shRSPO1、shRSPO2和shRSPO3，<0.01）（图). 与对照组相比，shRSPOs组的HSC增长率显著下降（图). 总的来说，这些发现表明RSPOs基因的敲除抑制WNT途径的活性，并随后导致肝纤维化的解决。
有趣的是，我们的研究表明DKK1削弱了RSPO对HSC的影响。与PCR和Western blot分析结果一致，油红O染色显示shDKK1组的脂滴减少（图)shDKK1组TCF活性显著增加(第页<0.01）（图). 此外，与对照组相比，shDKK1组的HSC增长率显著上调（图). 总之，上述结果表明RSPOs和DKK1的协同作用可能促进HSC活化。
讨论
肝纤维化的发展是肝硬化和肝癌等肝病致命并发症的关键阶段。虽然通过控制潜在原因可以逆转肝纤维化，甚至早期肝硬化，但目前对终末期肝硬化患者可用的唯一治疗方法是移植[18]. 同时，先前的研究报告称，肿瘤和HSC之间的双向相互作用构成了一个“扩增环”，以进一步促进肝脏的转移生长[19]. 因此，肝纤维化的早期诊断和治疗干预是一项尚未满足的主要医疗需求。
在本研究中，我们的数据提供了RSPOs可能参与肝纤维化形成的证据。对人肝纤维化组织的分析表明，与正常肝组织相比，RSPOs过度表达，并且RSPOs的表达与肝纤维化分期相关。这些发现使RSPO成为早期检测和治疗肝纤维化的有力靶点。
体内研究表明，在HSC激活过程中，RSPO的表达增加，并且完全激活的HSC保持较高的RSPO水平，这表明在激活的HSC中，RSPO的启动随后持续存在。这些发现与之前的一项研究一致，即肝脏损伤后，RSPO的转录水平增加了三到六倍[12].
与重组RSPOs共培养增强了Wnt通路活性，促进了HSC的纤维生成、增殖和表型转换，而RSPOs的敲除抑制了Wnt途径活性并抑制了HSC激活。此外，我们的研究还表明DKK1对RSPO的功能具有抑制作用。据报道，DKK1通过竞争LRP5（低密度脂蛋白受体相关蛋白5）或LRP6受体来抑制RSPO功能[20–22]RSPO和DKK1之间的平衡协调组织内稳态[23]. 我们的数据与这些报告一致，并表明RSPOs和DKK1的相互作用协调肝纤维化的发生体内和在体外.
综上所述，我们的研究表明RSPOs通过增强Wnt通路促进肝纤维化，而DKK1对RSPOs功能具有抑制作用（图). 由于肝纤维化是致死性肝病的基本阶段，因此限制纤维化的进展而不影响伤口愈合仍然是医生和研究人员面临的挑战。我们的研究可能为肝纤维化的分子机制带来新的角度。
慢性肝损伤可能通过增强Wnt/β-catenin通路上调RSPOs表达，进而促进肝纤维化，而DKK1对RSPOs功能具有抑制作用
检测血清DKK1作为肝癌诊断的生物标志物[24]. 同样，为了应用我们的研究结果寻找更好的纤维化标记物，还需要进一步研究血清中RSPOs蛋白的微量检测的可行性，并将其与肝纤维化分期联系起来。
材料和方法
患者和肝组织样本
该研究得到嘉兴学院伦理委员会的批准。人体肝组织取自嘉兴学院第一附属医院，并获得每位患者的书面知情同意。共采集63例肝纤维化组织标本，10例正常肝组织标本作为对照。组织样品在−80°C的温度下保存。
肝纤维化评估
使用改良的Knodell评分系统评估人类肝脏样本中的纤维化阶段[17]. 两位经验丰富的病理学家以双盲的方式评估了样本的肝脏组织学。结果分为四类：纤维门静脉扩张（I）、纤维间隔（II）、桥接性纤维化（III）和肝硬化（IV）。
使用的动物
健康昆明小鼠（8-10周龄，体重38-40克）购自上海SLAC实验动物有限公司（中国上海）。这些动物被安置在标准动物实验室条件下，并提供实验室食物和水。所有参与动物研究的人员都接受了有关实验方法以及小鼠护理、维护和处理的指导。遵守了所有有关实验动物护理和使用的机构和国家指南。实验方案经嘉兴学院动物实验伦理委员会批准。
抗体和试剂
RSPO1/2/3、α-SMA和胶原蛋白-I的多克隆兔购自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。兔β-catenin多克隆、HRP偶联的二级抗兔IgG来自CST（Cell Signaling Technology，MA，USA）。人RSPO1/2/3抗体、重组小鼠RSPOs（RSPO1、RSPO2和RSPO3）和重组小鼠DKK1购自R&D（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）。NEPER核和细胞质提取试剂盒来自Pierce（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）。Lipofectamine 2000、Opti-MEM I Reduced Serum Medium和TRIzol均来自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）。DMEM和FBS购自Gibco（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）。TCF报告基因质粒TOPFLASH和对照非活性报告基因FOPFLASH购自Upstate（Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，NY，USA）。CCl4、橄榄油、胶原酶IV、蛋白酶E、Nycodenz、DAPI、BSA、Triton X-100、MTT和DMSO均来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）。慢病毒载体购自Inovogen（Inovogen-Tech，中国北京）。Oil Red O试剂盒购自AMTS（美国Mastertech Scientific；美国加利福尼亚州洛迪）。
造血干细胞的分离和培养
如前所述，从昆明小鼠的肝脏中分离出初级星状细胞[25]. 简单地说，对小鼠肝脏进行灌注就地与DMEM（美国吉布科）一起清除肝脏中的血液。用蛋白酶E（美国西格玛）和胶原酶IV（美国西格玛）消化肝脏后，根据制造商的方案，用Nycodenz（美国西雅玛）密度梯度离心法对分散的细胞悬浮液分层。产生的上层含有新分离的HSC。用相控显微镜检查分离的HSC的纯度，并根据台盼蓝排除法检查其活力（纯度>95%，活力>95%）。然后将分离的HSC培养在37°C、密度为1×10的DMEM（美国吉布科）中的无涂层塑料板上，DMEM中添加10%的FBS（美国吉布克）5细胞/厘米2用于未来研究。
免疫组织化学染色
组织样本固定在10%福尔马林和石蜡包埋物中进行免疫组织化学分析。在脱蜡、复水和抗原提取后，用3%的H培养肝组织切片2O（运行）2然后用10%山羊血清在5%牛血清白蛋白中进行血清封闭（美国西格玛）。然后，将肝组织切片与抗RSPO1（1:1000稀释，美国研发系统公司）、RSPO2（1:1000稀，美国研发体系公司）和RSPO3（1:1000稀释剂，美国研发公司）的一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下使用HRP结合的二级抗兔IgG抗体（1:2000稀释，美国圣克鲁斯）1小时。使用SABC试剂盒（中国博斯特）进行免疫组织化学染色。为了量化免疫染色，两名经验丰富的研究人员以双盲的方式在六个随机选择的高倍放大镜下对细胞进行计数。结果按RSPOs染色细胞百分率评分如下：<10%（0分），10%~50%（1分），51%~75%（2分），76%~100%（3分）。得分0和1被视为弱表达，而得分2和3为阳性表达。
免疫荧光分析
将细胞经对甲醛固定，然后用0.1%Triton X100在PBS中渗透，并用4%BSA封闭。然后用兔RSPOs多克隆抗体（Abcam，Cambridge，MA）在4°C下培养细胞过夜。然后用HRP-结合兔IgG（CST，MA，USA）培养细胞一小时。Nuclei用DAPI染色（美国密苏里州Sigma-Aldrich）。图像是使用荧光显微镜拍摄的（日本东京奥林巴斯）。
实时PCR
根据制造商的说明，通过实时PCR（StepOne-Plus，Applied Biosystems，CA）定量mRNA水平。为了尽量减少与DNA污染相关的问题，设计了引物以跨越基因组序列中的至少一个内含子。表中列出了用于扩增的引物根据制造商的方案，使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA）从细胞中分离出总RNA。使用UV-1800分光光度计（日本京都岛津）在A260/A280（1.8–2.2）和A260/A230（3.0–4.0）的吸光度比下评估分离RNA的质量。热循环条件包括在50°C下初始步骤2分钟，在95°C下变性10分钟，然后在95°C下35–40个循环30秒，60°C下45秒，72°C下1分钟，以及在72°C的最终延伸步骤10分钟。每个样品分析三份，使用β-肌动蛋白进行归一化。采用比较阈值（Ct）法计算样品与对照组相比的mRNA相对量。
表2
引物序列
| 基因 | 正向序列 | 反转顺序 |
|---|
| R-海绵1 | 5′-ATTCTGCTGGAGGAGACGA-3′ | 5′-CTCCTGACACTTGTGCAGA-3′ |
| R-自发2 | 5′-CAAGCATGGACTCAGCGTTA-3′ | 5′-TCTACAGCCTCTTGTGCCT-3′ |
| R-自发3 | 5′-GTGAGCCAGTGAGAGGT-3′ | 5′-CTCGCTCTCCCTTTGAACAC-3′ |
| α-SMA | 5′-CTGACAGAGGCACCACTGAA-3′ | 5′-CATCTCCAGAGTCACACA-3′ |
| 胶原蛋白-I | 5′-TTCACTACAGCCACGCTGTG-3′ | 5′-GATGACTGTCTTGCCCCAAGTT-3′ |
| β-连环蛋白 | 5′-CAGCAGTTTGTGGAGGGCGTG-3′ | 5′-TGTCAGGGGAGCTGTGGCTCC-3′ |
| β-肌动蛋白 | 5′-TCATCACTATGTGGCAACGAGC-3′ | 5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′ |
蛋白质印迹
根据制造商的说明，使用NE-PER提取试剂盒（美国皮尔斯）提取细胞核和细胞质蛋白质组分。然后对提取物进行SDS-PAGE分离蛋白质，然后电泳转移至硝化纤维素膜（加利福尼亚州联合市Axygen）。在用含有5%无脂牛奶的磷酸盐缓冲盐水封闭后，用兔RSPOs多克隆抗体（Abcam，Cambridge，MA）、α-SMA（Abcan，Cambribridge）、胶原蛋白-I（Abcam，Cambricki，MA），β-catenin（CST，MA，USA）和β-Actin（HarO，Shanghai，China）孵育硝化纤维素膜在4°C下过夜，然后在室温下与HRP-结合兔IgG（CST，MA，USA）孵育1.5小时。使用商业ECL检测试剂盒（中国上海哈罗）检测免疫标记蛋白。
RSPO和DKK1刺激
将新分离的小鼠HSC维持到70%汇合。然后，更换培养基，将HSC在含有5%FBS的DMEM（美国吉布科）中培养24小时。然后将HSC暴露于重组小鼠RSPOs（RSPO1为100 ng/ml，RSPO2为10 ng/ml和RSPO3为50 ng/ml）（美国研发系统公司）24 h。同样，将活化的HSC暴露在重组小鼠DKK1（50 ng/ml）（美国R&D公司）24小时。最后，采集细胞进行进一步分析。
荧光素酶报告试验
使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）将TOPFLASH和FOPFLASH（美国Upstate Biotechnology）瞬时转染细胞。转染24小时后，收集细胞，并使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州普罗米加）在光度计（美国BioTek Instruments）上测量荧光素酶和肾素发光。TCF报告活性由萤火虫与Renilla荧光素酶活性的比值表示。进行了两次独立的转染，每个样品检测三次。
油红O染色
使用油红O分析测定脂滴的累积。简单地说，将0.5 g油红O粉末（美国Mastertech Scientific；CA，USA）溶解在100 mL异丙醇中，制成储备溶液，用水（3:2）稀释并过滤。在25°C下进行染色1小时，然后在ddH中清洗两次平板2O，并在显微镜下观察和拍摄（CK显微镜，日本东京奥林巴斯）。
增长分析
将HSC以2.0×10的密度播种到96 well板中三每口井。在细胞接种后第1天、第2天和第3天，通过MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）测定法测量细胞生长。简单地说，将100μg MTT（Sigma，美国）加入每个孔中。在37°C下培养4 h后，通过在每个孔中添加100μl二甲基亚砜（美国Sigma-Aldrich）溶解活细胞产生的紫色甲霜晶体。然后在Bio-Rad 550微孔板读取器（Bio-Rad，美国）中在570nm波长下读取每个孔的吸光度。HSC增长率计算如下：
细胞生长率=（试验组/对照组的平均吸光度）×100%。
肝纤维化动物模型
采用橄榄油20%CCL4溶液皮下注射，每周2次，每次5ml/kg，共10周，建立小鼠肝纤维化模型。64只昆明种小鼠随机分为两组。第一组(n个=4）作为正常对照组，实验组(n个=60）为肝纤维化模型。
慢病毒载体的构建和生产
shRNA序列（表)将抗小鼠RSPOs（shRSPO1、shRSPO2和shRSPO3）和DKK1（shDKK1）亚克隆到慢病毒载体pLVshRNA-mCherry（2A）puro（Inovogen Tech，中国北京）的EcoR I和BamH I位点，并以扰乱的shRNA作为对照（shControl）。通过转染293T细胞包装假型重组慢病毒。简言之，1.5×106将293T细胞置于6 cm培养皿中培养20 h。然后用1.7μg pLVshRNA-mCherry（2A）puro-shControl或pLVshRNA-mCherry。G使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。在72 h时收集含有慢病毒的上清液（Lenti-shRSPO1、Lenti-sh-RSPO2、Lenti-shRSPO3、Lentis-shDKK1和Lenti-sh Control），通过0.45μm低蛋白结合过滤器（Millipore、Bedford、MA）过滤，在4000 g下离心浓缩15 min，并在−80°C下保存。通过荧光激活细胞分选分析测定慢病毒载体滴度，病毒滴度为1.0×108时间单位/毫升。
表3
shRNA序列
| 基因 | | shRNA序列 |
|---|
| shRSPO1公司 | 福沃德 | 5′-GATCCCCTGTTCAGAAGATCAACGGTTCAAGACCGTTCAGTAAC AGTTTTGGAAA-3′ |
| 反向 | 5′-AATTTTCCAAAAAAACTGTTCAGAATCAACGGTCTCTTGAACCGTGACTT CTGAACAGGGG-3′ |
| shRSPO2公司 | 福沃德 | 5′-GATCCCCGAGAAGGAATGCGTCAGTATACAGAGTACTGACTCTCTC TTTTTT GGAAA-3′ |
| 反向 | 5′-AATTTTTTCCAAAAAGAGAGAATGCGTCAGTACTTGATACTGACGCATT CCTTCTCGGG-3′ |
| shRSPO3公司 | 福沃德 | 5′-GATCCCCGGATTGGCATGAAGAGATTCAAGATTCAAGAGACTCTTCATGCCAATCCT TTTTT GGAAA-3′ |
| 反向 | 5′-AATTTTCCAAAAAGGATTGGCATGAAGACAGATCTTCGAATCTGCCATG CCAATCGGG-3′ |
| shDKK1型 | 福沃德 | 5′-GATCCCCGAGGTGAGATCTGTCTTCAAGAGAGACATCTGTACCCTC TTTTTTGGAAAA-3′ |
| 反向 | 5′-AATTTTCCAAAAAGAGGTGAGATCTGTCTCTTGAGACACATGT ACACCTCGGG-3′ |
| sh控制 | 福沃德 | 5′-gatccccgaggattctgttgtacagtcagagctccgtaagacaacatgtctt TTTTGGAAA-3′ |
| 反向 | 5′-aattttccaaaaagaggattctgtgttacagcttgactccgtaagacacatgtcggg-3′ |
HSC与慢病毒载体（Lenti-shRSPO1、Lenti-sh-RSPO2、Lenti-shRSPO3、Lentis-shDKK1和Lenti-sh对照，MOI=20）共培养。感染四天后，收获HSC，通过实时PCR验证慢病毒递送的效果。
体内慢病毒的转导
体内通过尾静脉注射0.1 mL病毒滴度为1.0×10的浓缩病毒悬浮液，实现慢病毒（Lenti-shRSPO1、Lenti-sh-RSPO2、Lenti-shRSPO3、Lentis-shDKK1和Lenti-sh control，作为对照）的转导8PBS中的TU/mL慢病毒颗粒；每两周注射一次。注射6周后，动物被一氧化碳处死2暴露后取肝组织。
统计分析
数据以平均值±SEM表示。双尾学生的t检验用于评估组间差异。对于组织学分期的半定量分析，使用了非参数检验（Wilcoxon检验）。值为第页<0.05被认为具有统计学意义。
脚注
利益冲突
所有作者都声明，他们没有相互竞争的利益。
给予支持
本研究由嘉兴市科学技术项目（2014AY21030-1）、浙江省科学技术公益项目（2015C33279）、浙江省级自然科学基金（LY16H030016）、浙北麻醉中心、嘉兴市神经与疼痛医学重点实验室、，浙江省卫生厅胃肠病学专项支持学科（GJJX-010-002）、嘉兴市重点支持学科（胃肠病理学04-Z-12、传染病04-Z-14）。
参考文献
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