生物传感器的FRET成像使研究人员能够研究活细胞中信号级联的时空动力学1此外，已经证明双光子荧光寿命成像（2pFLIM）对脑片中小神经元隔室的信号转导成像是有用的2–4，揭示了生物化学整合和计算的原理5然而，由于合适的FRET–FLIM对数量有限，很难用2pFLIM同时成像多个FRET传感器。因此，我们设计了一种新的红色FRET对，与基于EGFP的生物传感器一起适用于同步FLIM。
由于许多FLIM传感器使用EGFP或单体EGFP（mEGFP）作为FRET供体，我们的目标是开发一种红色或橙色FRET供料，它可以与基于EGFP的生物传感器同时激发，但具有可分离的荧光发射。我们从氰激发橙色荧光蛋白（CyOFP1）开始，因为它具有高量子产率、长单指数荧光寿命衰减以及在与EGFP相同波长下的激发性6然而，CyOFP1有两个不太理想的特性：其短波发射尾将EGFP发射的收集限制在窄带；尽管许多融合蛋白都能正确定位CyOFP1，但在浓度≥1μM时它是二聚体6.
我们开始进一步红移并使CyOFP1单体化。引入发色团相互作用残基的突变，我们发现His-61突变为Met（H61M）导致荧光红移()同时保持0.77的高荧光量子产率。然而，与CyOFP1一样，这种“CyRFP1”突变体在10μM时是二聚体(补充图1a). 为了增加CyRFP1的单体性，我们检测了CyOFP1最接近结晶的前身海王星的晶体结构；我们注意到Ala-161的疏水性接触，这是单体红色荧光蛋白mCherry中的带电Arg残基占据的位置。将Ala-161突变为带电残基Arg或Lys，我们发现CyRFP1 A161K突变体比CyRFP更具单体性(补充图1b).
CyRFP1的表征及GCaMP6的双重成像（a） mCyRFP1、CyRFP2和mEGFP的归一化吸收光谱。虚线表示近似2p激发（920 nm）。（b） mCyRFP1、CyRFP2和mEGFP的归一化发射光谱。虚线矩形表示绿色和红色发射滤光片的透射。（c） HEK293细胞中共表达mEGFP和mCyRFP1的荧光寿命衰减曲线与实验仪器响应函数（IRF）一起拟合为单指数衰减。（d） 用2p显微镜观察转染CyRFP1和GCaMP6s的器官型海马切片中CA1锥体神经元的树突段。箭头所指的脊椎用2p谷氨酸开盖刺激。显示了未插拔前的图像、指示的未插拔脉冲数后64毫秒的图像以及最终未插拔后30秒的图像。（e） 在谷氨酸去壳诱导的结构可塑性过程中，d组显示脊椎体积（Δ体积）的变化以及GCamp6和CyRFP荧光比率（Δ比值）的变化。（f）体内转染GCaMP6s和CyRFP1的运动皮层2/3层神经元树突段的2p图像。顶部面板显示脊柱2中的钙自发升高。下图显示了枝晶钙瞬态。合并、覆盖CyRFP1和GCaMP6图像。（g） 图f中两个脊髓和树突轴的绿-红荧光比率变化的时间进程。插图显示了CyRFP1荧光的时间历程。比例尺，2μm。
然而，CyRFP1 A161K在细菌中的成熟度低于其二聚体前身(补充表1). 重新筛选发色团相互作用位点，得到一个成熟度提高的N41A突变体(补充表1)，即使在相对较高的100μM浓度下也是单体(补充图1a). 该突变体命名为mCyRFP1，表现出广泛的吸光度和以500 nm为中心的激发(补充图1c、d); 峰值和平均发射分别为596 nm和600 nm(和补充图1d); 以及0.65的¼(补充表1). mCyRFP1荧光显示K（K）一第5.6页(补充图1e)并以45秒的标准化半场时间进行光漂白(补充图1f)，类似于黄色荧光蛋白的半场休息时间7最后，mCyRFP1和CyRFP均显示长的单指数荧光衰减，荧光寿命分别为3.55 ns和3.71 ns(,补充图2、和补充表2).
接下来，我们比较了CyOFP1及其新突变体在哺乳动物细胞中的表现。表达CyRFP1的细胞和表达CyOFP1的一样明亮。表达mCyRFP1的细胞虽然比表达CyRFP的细胞暗，但比表达CyRFP1 A161K的细胞亮三倍(补充图3a)与mCyRFP1成熟度提高一致。表达mCyRFP1的细胞可以在典型的宽场成像条件下持续激发数分钟，然后失去一半的初始亮度(补充图3b). mCyRFP1与组蛋白H2B的融合不干扰有丝分裂(补充图4a)以及与各种亚细胞标记的融合被正确定位(补充图4b). 为了进一步表征mCyRFP1的单体性，我们量化了组织化滑面内质网（OSER）分析的性能，该分析报告对FP单体性敏感8我们观察到mCyRFP1与内质网（ER）膜蛋白（CytERM）融合的正常细胞百分比为82.4%(补充图4c)，该值与mVenus和mKate2的公布分数最为相似9我们还测试了mEGFP和mCardinal作为参考，获得了96.8%和41.8%的分数，与之前公布的分数相似9(补充图4c). 因此，与100μM时的单体一致在体外mCyRFP1在细胞中作为融合标签表现良好。
CyRFP1和mCyRFP2的一个主要优点是它们能够与EGFP共存，同时它们的排放很容易与EGFPs的排放分离(). 因此，与mEGFP相比，我们进一步表征了CyRFP1和mCyRFP的双光子（2p）激发光谱(补充图5a，b). 虽然CyRFP1和mCyRFP2都有一个宽的约1000 nm的2p激发峰，但在900–940 nm激发时，它们的亮度高于EGFP，这是神经元EGFP成像常用的波长10由于CyRFP1在2p激励下比mCyRFP2亮度更高，且进入绿色通道的电流更少(补充图5c)，我们测试了CyRFP1作为结构标记物的可用性，用于在单个树突棘中与绿色荧光传感器同时进行2p成像体外和体内.用荧光钙指示剂GCaMP6s生物转染神经元11和CyRFP1，我们能够同时成像Ca2+海马脑片CA1锥体神经元2p谷氨酸去激活诱导脊髓结构可塑性的瞬态和脊髓体积变化(). 在这些条件下，在树突棘的重复2p成像过程中，CyRFP1和mCyRFP2没有显示出任何可检测到的光漂白(补充图5d). 此外，在器官型切片中长期表达（约1周）后，这些荧光团在神经元细胞核中没有聚集，而mCherry则倾向于在溶酶体中聚集和积累12(补充图6). 最后，我们测试了CyRFP1在体内活体动物成像。GCaMP6s和CyRFP1转染2/3层锥体神经元后，使用子宫内电穿孔，我们通过成年小鼠运动皮层的颅窗同时成像树突棘的自发钙事件和棘结构(和补充视频1). 在这些条件下，脊椎和树突中明亮的CyRFP1荧光表明，即使在表达数月后，CyRFP的光学特性仍然保持稳定。此外，这些结果μ̇问题15证明使用稳定的CyRFP1荧光校正运动伪影并量化相对细胞内[Ca2+]归一化为结构体积。
mCyRFP1的长荧光寿命和单指数衰减()表明它将是一种有效的FLIM–FRET供体。接下来，我们将注意力转向识别一种远红色荧光蛋白，该蛋白可以作为有效的FLIM–FRET问题34哺乳动物细胞中mCyRFP1的受体13我们测量了mCyRFP1融合到候选受体mCardinal的HEK细胞的荧光寿命14，mNeptune2（参考。14)和mMaroon1（参考。15). mCyRFP1–mMaroon1融合显示了最高的FRET效率（62.3±0.2%）和接受FRET的蛋白质部分（折叠效率=69.2±0.3%，补充图7a、b). 计算出的Förster半径(第页0)假设随机荧光团间取向，mCyRFP1–mMaroon1对的6.3 nm大于其他常用的FLIM–FRET对mEGFP–sREACh和mEGFP–mRFP(补充表3). 此外，用于激发EGFP和mCyRFP1的波长对mMaroon1的激发最小（2p激发时为920 nm；和补充图5a，b)在测量mCyRFP1荧光寿命时，将mMaroon1发射引起的污染降至最低(补充图7c). 对共表达EGFP和mCyRFP1的HEK细胞的FLIM分析，无论是单独表达还是与FRET受体融合，都证实了我们能够同时测量EGFP与mCyRF P1结合态或非结合态的寿命，且两个通道之间的串扰最小(补充图7c，d).
FLIM中mCyRFP1-mMaroon1 FRET对的表征（a） mCyRFP1和mMaroon1的吸收和激发（例如，激发；em，发射）的归一化（标准）光谱。（b） 红移RhoA传感器RhoA–CyRM的主要负离子（DN）和组成活性变体的荧光寿命衰减曲线。（c）红移Cdc42传感器Cdc42–CyR2的示意图，以及表达传感器（WT）或主要负离子传感器（DN）的HEK293细胞的代表性荧光寿命图像或组成活性（CA）突变，通过2pFLIM获得。（d） Cdc42–CyRM突变体的结合分数（DN、WT和CA分别为80、50和59个细胞）。（e） RhoA–CyRM示意图和表达传感器（WT）或其具有DN或CA突变的变体的HEK293细胞的代表性荧光寿命图像。（f） RyoA–CyRM突变体在HEK293细胞中表达的结合分数（DN、WT和CA分别为184、190和181细胞）。比例尺，20μm。误差线代表s.e.m。；统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验进行测量。
为了验证基于mCyRFP1和mMaroon1的FLIM–FRET传感器，我们使用这些荧光团为小型GTPases Cdc42和RhoA创建并测试了传感器。我们在之前建立的Cdc42和RhoA分子间传感器系统中替换了EGFP和mCherry三分别使用mCyRFP1和mMaroon1创建名为Cdc42–CyRM（mCyRF P1–mMaroon 1）和RhoA–CyR的新传感器(). 在HEK细胞中，FLIM测量显示Cdc42-CyRM和RhoA-CyRM组成活性变体的结合分数显著高于显性阴性和野生型变体。传感器的灵敏度与之前报告的传感器的灵敏度相似三，确定mCyRFP1–mMaroon1作为新的FLIM–FRET对的有用性。
最后，我们测试了基于mEGFP和mCyRFP1供体的两个生物传感器是否可以同时执行双色2pFLIM。具体来说，我们试图在器官型海马脑片中通过2p谷氨酸去激活诱导的单棘结构可塑性过程中成像CaMKII和RhoA的激活16为了成像CaMKII活性，我们使用了Green-Camuiα，一种FRET传感器，它使用mEGFP和暗YFP变体dimVenus进行分子内排列4对于RhoA成像，我们使用RhoA–CyRM(). 我们验证了从mEGFP–CaMKII–dimVenus到mCyRFP1寿命期间没有污染(补充图7c，d)以及dimVenus和mMaroon之间缺乏FRET(补充图8a; 看见补充表4用于比较所用的荧光蛋白）。我们用调谐至920nm的2p激光同时激发两个传感器，并使用二向色镜分离GreenCamuiα的绿色发射和RhoA–CyRM的红色发射。先前在单独的实验中使用2pFLIM传感器的工作发现，在诱导结构可塑性的过程中，CaMKII的激活在空间上仅限于受刺激的脊椎并在1分钟内衰减，而RhoA的激活主要沿着受刺激脊椎附近的树突扩散，并持续数十分钟三,4使用Green-Camuiα和RhoA–CyRM，我们发现在单个脊椎上的谷氨酸去盖可以诱导短时间和有限的CaMKIIα激活，然后在同一脊椎上长时间和广泛的RhoA激活(). 通过一系列的对照实验，我们进一步验证了双色FLIM测量不受实验伪影或不同通道之间串扰的影响(和补充图8b–d). 这些结果表明，使用mEGFP和mCyRFP1 FRET供体可以同时成像两个生化传感器。此外，双色FLIM显示，在单个脊柱的结构可塑性期间，CaMKII活性比RhoA活性更具局限性和短暂性，这与之前使用单色FLIMs的研究一致三,4.
结构塑性下单个树突棘RhoA和CaMKII活化的FLIM同步测量（a） 用于实验的CaMKII-alpha传感器（Green-Camuiα）和RhoA–CyRM的示意图。（b，c）用2pFLIM获得的器官型海马切片中CA1锥体神经元树突段RhoA（b）和CaMKII（c）激活的代表性荧光寿命图像。使用2p谷氨酸去盖法（用箭头标记）在单个脊柱中诱导结构可塑性。比例尺，2μm。（d） RhoA和CaMKII传感器在受刺激脊椎及其相邻树突轴（10个脊椎，8个神经元）脊柱结构可塑性期间荧光寿命的平均变化。（e） 在以下条件下，在同步CaMKII–RhoA成像期间，受激脊髓的瞬态（顶屏；CaMKIII为16–64 s，RhoA为16–76 s）和持续（底屏；20–30 min）荧光寿命变化的定量：对照，无细胞外Ca2+（无Ca2+），将Green-Camuiα替换为mEGFP–dimVenus融合（+mEGFP-dimVenus），并将RhoA–CyRM的受体替换为Cdc42–CyR的受体（+RhoA假受体）。（分别为10/8、10/8、7/6和8/6棘/细胞；误差条代表s.e.m.；使用单向方差分析和Dunnett多重比较测试测量统计差异）。
CyRFP1的改进特性包括高亮度、大斯托克斯位移和EGFP的发射分离，使CyRFP2和GCaMP6在脑切片和体内在整个神经元中表达CyRFP1应能更好地量化小微室（如树突棘）中的钙动力学17此外，我们设计了单体变体mCyRFP1，当与多种蛋白质融合时表现良好。新的mCyRFP1–mMaroon1 FLIM–FRET对支持双色FLIM以及基于mEGFP的FRET探针。由于mCyRFP1和mEGFP可以由相同波长的光共存，而它们的发射可以分离，因此真正同步的FRET–FLIM是可能的，正如我们通过同步成像CaMKII和RhoA活动所证明的那样。最近开发的mEGFP受体比REACh更暗，将进一步简化多色FLIM–FRET成像18.
双FRET–FLIM通过在同一细胞中成像，可以更准确地量化蛋白质活性之间的时空关系。此外，使用多色FLIM对两条信号通路进行时空关联，有助于破译生物化学信号在不太受控制的条件下的动力学，例如在活体动物中。
