科学信号。作者手稿；2017年2月22日PMC提供。
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深测序和高分辨率成像显示隔室特定定位Bdnf公司海马信使核糖核酸神经元
马克斯·普朗克大脑研究所突触可塑性系德国法兰克福马克斯·冯·劳厄大街4号研究室，邮编：60438
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补充材料。
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补充数据文件S1。
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摘要
脑源性神经营养因子（BDNF）是调节各种大脑功能的神经营养素家族。虽然很多是已知其转录是如何调节的，内源性BDNF公司mRNA及其亚细胞定位模式辩论事项。我们在在大鼠海马中进行原位杂交以重新检查这个问题。我们对大鼠海马脑片进行3′端测序，检测到2个亚型Bdnf公司包含短或长3′非翻译区（3′UTR）。大多数Bdnf公司转录本中含有短的3′UTR亚型，在相对于其他神经元转录物的数量。Bdnf公司mRNA是存在于大鼠海马切片的体细胞隔室或培养的大鼠海马神经元但在树突中很少检测到过程。药物刺激海马神经元Bdnf公司表达，但没有改变Bdnf公司异构体丰度。调查结果表明内源性的Bdnf公司mRNA虽然含量很低，但主要是定位于海马神经元的体细胞室。两者都有Bdnf公司mRNA亚型的半衰期较短其他神经元mRNA。此外，研究结果表明，使用互补高分辨率技术可以提供内源性的敏感测量转录物丰度。
介绍
脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养素家族(1)调节各种脑功能，包括神经细胞的发育和可塑性中枢和外周神经系统。BDNF是一种典型的靶向衍生蛋白可以促进感觉神经元的生长和存活(1)以及神经干的存活和分化单元格(2). 在培养的神经元中，BDNF还可以促进生长锥的定向转动(三)以及轴突的分化和成熟(4). 在成熟神经元中，尤其是在海马，BDNF是长期突触可塑性的调节剂(5). 尽管有许多功能被赋予对于BDNF，BDNF mRNA的基础（非刺激）丰度(6)和蛋白质(7)都很低在大脑中(8)并贯穿整个开发过程(9). 然而BDNF公司受到许多流程的监管，包括发起人(10)，DNA甲基化(11，12),和可选拼接(10)，建议有充分的可能性BDNF公司表达式。
BDNF公司mRNA在许多兴奋性神经元中表达(13)也以展览闻名活性依赖性增加的丰度，如对由高频刺激、钾诱导的去极化或癫痫发生(14——16). 两个不同的BDNF公司mRNA 3′未翻译区（UTR）亚型已被鉴定(17——20)，其中包括据报道影响了BDNF公司信使核糖核酸(21). 有人建议3′UTR亚型仅限于胞体，长亚型的靶向是树突，但大多数研究通常依赖于对报告转录本的分析树突近端过度表达。因此，我们检查了内源的丰度和定位Bdnf公司抄本，包括编码序列（CDS）-包含短和长3′UTR大鼠海马中的异构体，使用各种最先进的定量方法技术。
结果
深RNA测序和基因计数揭示Bdnf公司mRNA是在大鼠海马中少量存在
为了调查BDNF公司抄本以及海马中3′UTR的多样性，我们进行了RNA大鼠海马mRNA序列测定(22). 我们获得了2294个短核苷酸序列（以下简称称为“读”），映射到老鼠Bdnf公司转录序列（由国家生物技术中心提供信息）预测两种不同的3′UTR亚型，即498和2887个核苷酸（nt）长()，这与以前的研究一致(17——20). 这个预测的两个3′UTR的3′末端都包含一个poly（a）（聚腺苷酸）共有序列(; 短=AUUAAA，长=AAUAUA）。的相对读取次数短和长3′UTR（1500读，0.65分数，566读，0.25分别为分数）预测了短期与长期的比例为3:1CA1区3′UTR(图S1A)，类似于定量反转他人获得的转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）数据(23). 我们使用qRT-PCR验证了这些数据发现短到长3′UTR的比率相似（4:1）(). 因为Bdnf-CDS公司成绩单包括短文和长文3′UTR以大约4:1的比率，检测客户尽职调查转录本代表对短3′UTR亚型的粗略估计，我们因此，将短亚型称为Bdnf公司-客户尽职调查。
内源性Bdnf公司mRNA在海马体。(A类)显示长（顶部）和短的基因结构示意图（底部）3′UTR亚型Bdnf公司. (B类)基因组显示3′端序列读取映射的浏览器视图Bdnf公司.突出显示读数和产生的亚型灰色。3′端基的峰值代表位置和表达3′末端为UTR亚型，并确定亚型的预测。对于比较时，将显示RefSeq注释。这些数据代表了八个四只大鼠的海马。(C类)3′端序列分析（3′end-Seq）显示两种基因的表达BDNF公司异构体(Bdnf-CDS公司表示短亚型）相对于Vgf（Vgf）和凸轮2a大鼠海马总量RNA。(D类)的相对表达式值Bdnf公司亚型与Vgf（Vgf）和凸轮2a已确定通过qRT-PCR。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM。(E类)长UTR亚型与BDNF-CDS公司海马中由3′端决定测序和qRT-PCR。数据为三个独立数据的平均值±SEM实验。(F类)NanoString计数Bdnf信用违约互换或凸轮2a从海马提取的100 ng总RNA组织。数据是来自三个独立实验的平均值±SEM。
检查Bdnf公司相对于其他海马体中的转录本，我们比较了我们获得的读取次数Bdnf公司mRNA[短（CDS）和长UTR亚型]凸轮2a-CDSmRNA，编码树突定位海马体中丰富的蛋白质(22，24，25). 这个Bdnf-CDS公司表达了转录本约为观察值的5%凸轮2a()经qRT-PCR证实(). 我们比较了Bdnf公司另一种神经分泌蛋白的mRNA，Vgf（Vgf）。我们发现了Bdnf-CDS公司成绩单丰度约为观察到的丰度的15%Vgf（Vgf）成绩单()，由确认qRT-PCR（定量RT-PCR）(). 尽管Bdnf公司转录本数量低于凸轮2a和血管内皮细胞生长因子，与总数相比海马转录组，Bdnf公司成绩单金额较高而不是中位转录表达(图S1B). 要验证这些结果进一步说明，我们还使用了NanoString计数器(26)，一种允许高分辨率可视化的技术单个信使核糖核酸分子。在从CA1区制备的100 ng总RNA中，检测到44000个计数（单个mRNA分子）凸轮2a-客户尽职调查mRNA与仅200相比计数为Bdnf-CDS公司信使核糖核酸()，表明Bdnf公司有成绩单约为的0.5%凸轮2a这些数据共同表明那个Bdnf公司有两种3′UTR亚型：短亚型为与其他神经元转录物相比，其数量较少亚型的含量远远低于短型，这表明大多数这个Bdnf公司转录本包含短的3′UTR。
因为我们所有的数据都是从大鼠海马体收集的，所以我们评估我们的发现是否可以扩展到其他表达Bdnf公司即小鼠和人类。我们重新分析了之前的人类、小鼠和大鼠大脑3′端序列的公开数据集组织(27). 我们发现两个人和鼠标BDNF公司成绩单数量均匀低于大鼠海马的观察值(图S1C). 因为Bdnf公司这三个物种的表达都很低，而且比例另一份成绩单(凸轮2a)这些数据表明从我们对老鼠的分析中得出的结论Bdnf公司信使核糖核酸丰度和定位也可能适用于其他物种。
这个Bdnf公司转录本定位于神经元体
在神经元中，一些mRNA物种定位于树突可以局部转化为蛋白质。我们检查了这个Bdnf-CDS公司细胞体层和神经膜层的转录物使用一系列技术（RNA测序、qRT-PCR、，NanoString）和高分辨率原位杂交。海马切片显微解剖以分离体细胞层和神经膜层(22); 神经膜层富含树突和轴突(28). 3′端测序用于确定Bdnf公司mRNA。我们计算的读取次数Bdnf公司来自躯体或神经膜层，发现大多数（86%）内源性Bdnf公司在体细胞层检测到转录物(). 从qRT-PCR和NanoString实验产生了类似的结果(和图。第1部分). 比较Bdnf公司对于其他抄本，我们分析了一种著名的树突定位转录本凸轮2a和a主要存在于细胞体的转录本，Vgf（Vgf），由RNA测序、qRT-PCR和NanoStringBdnf公司两种基因的转录表达模式凸轮2a或Vgf（Vgf）表示类似相对于Vgf（Vgf）(图S1B)，具有更大的胞体中一致检测到的转录物丰度高于神经纤维，无论使用何种技术(和图S2，A至C).
内源性BDNF公司mRNA主要表达于神经元索马塔。(A类)显示以下表达式的条形图Bdnf公司在里面3′端测定大鼠海马体细胞和神经胶质层测序、qRT-PCR和NanoString。3′端测序数据来自八只河马的代表。qRT-PCR和NanoString的数据是指±三个独立实验的SEM。(B类)高分辨率原位杂交检测Bdnf公司或凸轮2a游离海马中的转录物（品红色）体外培养21天后的神经元（DIV 21）。树突状物用MAP2抗体（第一组为红色，其余为灰色）；原子核是DAPI染色（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）面板，其他部分为绿色）。比例尺，20µm。第一个面板（黑色背景），显示原始图像；对其他图像进行了处理杂交信号的更好可视化Bdnf-CDS，Bdnf-UTR公司长的，或凸轮2a。(C类)7-µm厚的高分辨率原位杂交取4周龄大鼠海马切片。图像经过处理如（B）所示，不同之处在于从处理过的图像。(D类)基因组浏览器视图显示分布具有代表性的体细胞和神经膜之间的3′端测序读数从四只大鼠的海马获得的数据。
高分辨率可视化Bdnf公司成绩单是原位杂交显示
要直接可视化Bdnf公司本族语抄本环境，我们使用高分辨率原位杂交大鼠海马神经元培养()或大鼠海马脑片()使用设计用于检测Bdnf-CDS公司或Bdnf-UTR公司长的成绩单。这些实验显示内源性Bdnf-CDS公司神经元细胞中的颗粒体细胞，但树突中很少或没有颗粒，通过微管相关蛋白2（MAP2）的免疫染色(、和图S3A). 在培养中海马神经元，一簇Bdnf-CDS公司成绩单可以是在胞体中发现，但在树突中未观察到颗粒(). 成熟的CA1区域海马，观察到类似的模式()，其中偶尔在前20µm近端树枝晶，通常被认为是细胞体的延伸。在突触中观察到的少数粒子神经丝通常与细胞核相连，表明可能是体细胞位于移位的锥体神经元、中间神经元或神经胶质细胞中。在现场信号Bdnf-UTR公司长的成绩单是检测到的级别甚至低于Bdnf-CDS公司成绩单。虽然在细胞中清楚地检测到少量阳性颗粒小体，游离的树突中可见微弱或无信号神经元()或CA1中的神经元海马脑片区域().这些数据与我们获得的读数的相对比例一致长3′UTRBdnf公司躯体和神经纤维(图S1A). 我们还分析了内源性的分布Bdnf公司抄本在其他海马亚区，包括CA3和齿状回（DG）(图S3B). 表达式和分布模式Bdnf公司CA3和DG中的转录本与CA1中观察到的结果相当(图S3、C和D). 为了进行比较，原位杂交对于内源性凸轮2a两个躯体都有丰富的信号以及培养和CA1中分离海马神经元的树突海马亚区()，与之前的报告类似(22，29，30). 总之，有四种不同的技术表示Bdnf公司转录本明显较低在所有海马亚区和DG的体细胞中的数量很少在神经膜中可以检测到。
尽管内源性的基础丰度Bdnf公司mRNA是低，有明显证据表明Bdnf公司转录物丰度可以通过多种活动依赖性机制增加(14——16，20，31，32). 我们检查了我们的技术对检测以下两种情况的敏感性增加Bdnf-CDS公司或3′UTR长的亚型。我们测试是否使用γ-氨基丁酸增强神经活动A型（GABAA类)受体拮抗剂荷包牡丹碱改变其丰度或本地化Bdnf公司抄本。现场杂交荧光信号Bdnf-CDS公司在里面荷包牡丹碱处理的海马细胞与对照组相比显著增加在未经处理的细胞中().使用针对长3′UTR的探针进行相同的分析长的亚型没有显示出显著差异，这表明新的转录本主要包含短3′UTR亚型(). 我们还通过用神经肽垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）先前显示的引发动作潜能长时间爆发的条件点火(33). 原位荧光信号，用于Bdnf公司-客户尽职调查在PACAP中处理与未治疗组相比，海马细胞显著增加单元格(). 同样的分析使用靶向长3′UTR亚型的探针没有发现显著差异，表明CDS/UTR发生了变化长的比率有利于PACAP处理细胞中的短转录(). 关于激活上下文中的本地化，Bdnf公司转录本几乎只在躯体中检测到以及表现出最高丰度的神经元中的近端树突Bdnf公司现场信号。我们的结论是荷包牡丹碱和PACAP处理诱导了Bdnf公司，带有新转录物更有可能具有短的3′UTR亚型(图S4、A和B). 这个经qRT-PCR证实，其中Bdnf-CDS公司在两种细胞中均观察到总分离RNA荷包牡丹碱和PACAP处理的海马细胞(). 使用qRT-PCR，我们还检测到荷包牡丹碱或PACAP诱导的长3′UTR亚型增加(). 然而，这一增幅小于CDS转录本的相应增加()再次表明，大多数PACAP诱导的Bdnf公司转录本包含短的3′UTR亚型。
的表达式Bdnf公司随着活动的变化而变化。(A类和B类)高分辨率原位杂交Bdnf-CDS公司mRNA（绿色）在海马神经元中的表达第21部分。MAP2（灰色）标记树枝晶；DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺，20微米。用载体（A）或40µM处理神经元荷包牡丹碱（Bic）12小时（B）。(C类)平均值散点图对照细胞（A）或细胞原位杂交的荧光强度用荷包牡丹碱（B）治疗。au，任意单位；名称。，不重要。数据来自三个独立实验的50个细胞**P（P）<0.0088，Mann-Whitney检验。(D类和E类)杂交Bdnf-CDS公司如（A）和（B）所述；神经元用载体（D）或10 nM PACAP处理2小时（E）。比例尺，20微米。(F类)平均荧光强度散点图来自（D）和（E）。数据来自三个独立实验的100个细胞。**P（P）<0.0063，Mann-Whitney试验。(G公司和H（H）)表达式的条形图Bdnf信用违约互换或Bdnf-UTR公司长的治疗后荷包牡丹碱（G）或PACAP（H），通过qRT-PCR测定。数据为平均值±SEM来自三个独立的实验***P（P）< 0.0001,独立的t吨测验。(我)的散点图的稳定性Bdnf公司亚型（短，CDS；长，UTR）通过qRT-PCR测定。数据显示三个实验中有一个具有代表性独立实验；每个独立实验的数据如所示图S4C。
3′UTR亚型的差异可能导致mRNA的定位、翻译调控和半衰期提出mRNA亚型被转运并定位于树突考虑到mRNA运输到目的地的寿命，通常为数百距细胞体微米(34，35). 我们通过qRT-PCR进行了研究短期和长期的估计半衰期是否存在差异3′UTR亚型Bdnf公司游离海马神经元。在抑制转录后，长3′UTR异构体表现出半衰期约为短期测量值的一半Bdnf-CDS公司成绩单(和图。S4C系列). 正如对活性诱导基因所预期的那样两者的半衰期Bdnf公司亚型（CDS为6.8小时，3.2小时3′UTR小时长的)与半衰期相比很短其他（非活动诱导的）神经元mRNA，范围为16至24小时(36——39). 我们的数据表明，长3′UTRBdnf公司成绩单的半衰期比短的短3′UTR亚型，因此可能与以下假设不一致：被输送到枝晶。
讨论
大多数关于Bdnf公司mRNA定位依赖于外源性构建物的瞬时转染或病毒表达Bdnf公司3′UTR位于报告器下游分子。尽管这些技术可以突出不同的本地化模式对于不同的mRNA，它们也可以导致极高的转录物丰度，扭曲的本地表达模式。使用下一代测序和最新的高分辨率mRNA计数和原位杂交技术，我们重新检查这个问题，以确定内源性的Bdnf公司细胞体层和神经膜层的转录本成熟大鼠海马。我们的3′端测序数据表明Bdnf公司在大鼠海马显著低表达。这些数据通过三种独立的方法进行验证：qRT-PCR、直接mRNA检测使用nCounter NanoString和原位杂交。使用获得的结果这些技术是相互一致的，并且代表了独立的因为两种杂交方法（NanoString和原位杂交）用探针杂交到Bdnf公司mRNA。我们的数据表明Bdnf公司非常低，主要局限于体细胞隔间。树突中极低或缺失的信号意味着基本（非模拟）条件下，局部翻译的可能性有限Bdnf公司mRNA。我们观察到神经活动增强（荷包牡丹碱治疗）或PACAP刺激增加了Bdnf公司转录本，主要位于神经元细胞附近身体。其他人观察到Bdnf公司转录物对高频刺激诱导的可塑性的反应，钾致去极化或癫痫；这些抄本也是主要在细胞体和近端树突内或附近观察到(14——16，20).
如先前研究中所观察到的(17——21，23)，长和短3′UTR亚型Bdnf公司mRNA存在于大鼠海马，但我们发现短3′UTR亚型是主要的Bdnf公司转录本-它的丰度大约是长亚型。其他研究表明，长3′UTR亚型用于树突定位的港口信号(21). 我们的数据专门关注内源性转录物而非外源性表达的报告结构支持这一说法。事实上，在未受刺激的神经元中Bdnf公司远端树突中的转录物（短亚型和长亚型）罕见或缺失，这两种转录亚型在近端非常稀少，但不是远端，树突。这些数据与之前报告的0.8海马长/短亚型比例；在这份报告中据报道，3′UTR的表达量比突触神经体(21). 这里用生化方法分离突触神经小体，并用半定量PCR计算Bdnf-CDS公司成绩单和长3′UTR；用于突触神经体反应的总RNA的比例为比用于细胞体反应的低20倍，可能导致与非线性放大相关的伪影。在这里，我们使用了多个定量技术表明，长3′UTR不是优先定位于或集中于突触神经膜。我们还测定了3′UTR长亚型的半衰期和Bdnf-CDS公司通过抑制培养海马的转录神经元。我们从这些数据推断，短3′UTR亚型是与长亚型一样稳定。这种半衰期的差异与假设长3′UTR亚型靶向树突。
这里，我们展示了可以同时使用高分辨率技术以高灵敏度定位任何内源性转录物。我们的结果与最近发表的一项研究一致，该研究表明BDNF蛋白位于突触前致密核心小泡中，在明显处未被检测到突触后小室数量(7). 在对比，Orefice等最近报道了病毒BDNF结构的过度表达可以增加在树枝晶(40). 在未经刺激的细胞中，我们找不到什么证据Bdnf公司神经元外mRNA定位索马塔。这些数据表明，在基础条件下，BDNF蛋白翻译是最有可能发生在mRNA所在的体细胞隔室中。什么时候？BDNF过表达，可能在其他隔室中检测到(40)也有可能生理刺激导致高转录物丰度，因此树突中存在mRNA和/或蛋白质。
材料和方法
利用MATLAB实现自动信号检测
使用40倍物镜拍摄随机场叠加图像。仅限在分析中使用了能够很好识别过程的神经元。数据使用MATLAB脚本进行收集，以自动识别细胞并测量荧光强度。在最大强度投影中，神经元使用DAPI通道检测到。为了创建遮罩，将阈值应用于DAPI信号，然后用系数1.6（任意）展开，以及平均值测量原位泪点的强度。
组织显微切割和RNA分离
来自4周龄成年雄性大鼠的海马切片（500 mm）如前所述准备(41).从每个切片上手动显微解剖CA1细胞体和神经膜如前所述(22). 总RNA根据制造商说明。从25片切片中，我们得到大约5片每一个躯体和神经膜隔室的总RNA微克。
定量逆转录聚合酶链反应
用脱氧核糖核酸酶（DNase）I处理RNA并用RNeasy清洗MinElute清洁工具包（Qiagen）。RNA（500 ng）被反转录QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）。用SYBR进行qRT-PCR绿色（Applied Biosystems），反应设置和循环参数为QuantiTect引物分析（Qiagen）推荐：Bdnf公司（QT00375995），凸轮2a（QT02479988），Rnr1号机组（QT00199374），以及Vgf（Vgf）（QT00493556）。定制底漆用于Bdnf公司3英尺UTR长的（向前，5′-GCTCCATGTCGGTGGTTTAT-3′；反向，5′-AACAGAGACGGAAACAGAACG-3′）。qRT-PCR在StepOnePlus上运行实时PCR系统（应用生物系统）。
荷包牡丹碱或PACAP处理细胞
海马神经元以40万个细胞的密度在60mm的培养皿，用10 nM PACAP或40µM荷包牡丹碱处理2小时持续12小时。对于对照（载体），用水处理细胞。细胞是根据制造商说明。
用转录抑制剂治疗细胞
海马神经元以40万个细胞的密度在60mm的培养皿，用放线菌素D（8µM）鸡尾酒处理，5,6-二氯-1-β-D类-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB；100μM）和雷公藤甲素（1μM）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，用于0，2，4、6、8和10小时。抑制剂混合物用于最大限度地提高转录抑制。在每个时间点采集细胞，RNA根据制造商的说明。为了确定mRNA的稳定性，对每个获得的时间点。mRNA半衰期根据指数衰减计算与获得的时间点拟合的曲线。半衰期是在三个独立的实验中测定，平均半衰期为计算。
使用nCounter NanoString对基因表达进行数字分析
每个mRNA由两个长度为50-nt的探针检测：靶特异性捕获探针和与荧光连接的报告探针条形码(26). 所有探针都是经过设计的针对编码区域。总RNA（100 ng）（DNase I–处理和使用RNeasy MinElute试剂盒、Qiagen清洗）用于探针杂交。数据由n计数器数字分析仪处理，如所述(22).
3′端排序
GATC制备3′片段互补DNA文库Biotech AG，并使用Illumina HiSeq 2000进行了深度RNA测序。总RNA通过超声波破碎。Poly（dT）引物用于提取含有聚（A）的碎片。凝胶分离后，碎片大小为300至500nt用于测序衔接子的连接。单次读取有一个101nt的长度，并与大鼠基因组对齐（组装2012年3月/rn5）使用Bowtie(43). 连续A或T在比对期间，基因组上的不匹配被解释为含有聚（A）的读数，并进一步用于识别解理位点。聚（A）信号六聚体的识别和3′UTR的预测异构体是用自定义编写的Perl脚本完成的。为了可视化使用了加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器(44). 数据用DESeq R标准化包装(45). 原始3′端测序数据在补充材料联机(数据文件S1).
致谢
我们感谢I.Bartnik和N.Fuerst为美丽的海马神经元。基金：E.M.S.从Max获得资金普朗克学会、欧洲研究委员会（高级研究员奖）、DFG CRC902、DFG CRC 1080和高分子复合物卓越集群，歌德大学。
脚注
贡献者作者贡献：T.J.W.、S.T.D.和E.M.S.设计实验。T.J.W.、B.N.-A.和S.T.D.进行了实验。G.T.公司。编写了数据分析程序。G.T.、T.J.W.和L.K.分析了数据。L.K.、S.t.D.和I.J.C.提供了科学专业知识。T.J.W.和E.M.S.写道论文。
竞争利益：作者声明他们没有相互竞争的利益。
数据和材料可用性：包含原始来自的3′端测序数据Bdnf公司基因是提供为补充的材料。
参考文献和注释
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