典型霍奇金淋巴瘤微环境中FOXP3、CD68和CD20的表达对预后的预测

摘要

简介

典型霍奇金淋巴瘤（CHL）在淋巴瘤中是独特的，因为浸润的大部分不是恶性细胞（霍奇金和里德-斯特恩伯格细胞），而是炎症细胞，包括巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、成纤维细胞、浆细胞和肥大细胞。¹该病对大多数患者预后良好，常规化疗或放射治疗方案的长期缓解率超过80%。^2–4然而，仍有一部分患者的疾病对所有常规治疗无效，^5,6许多长期存活的患者都会受到过度毒性治疗的后期影响。⁷建立晚期疾病的临床预后指标，如国际预后因素项目的初始预后评分（IPS）⁸很少用于修改治疗。风险适应疗法将改善对该疾病的管理，但这需要为有利和不利风险患者确定可靠的生物标记物。这些生物标记物还可以提供对疾病分子生物学的深入了解。

恶性细胞对细胞外信号的依赖程度可能至少与其自身突变基因组产生的内源性信号一样。⁹巨噬细胞似乎在肿瘤支持中起着主要作用，¹⁰先前的研究表明巨噬细胞浸润增加会产生不利影响。^11–14肿瘤主导型CD4⁺T细胞在病理生理学中也很重要，但缺乏功能数据。¹对实体瘤免疫浸润的研究发现，不良结果与FOXP3、，¹⁵调节性T细胞（Tregs）的标记物，一种负责抑制异常免疫反应的亚群。体内Treg缺失导致肿瘤退化，¹⁶表明Tregs的存在抑制了对肿瘤的有效免疫反应。^17,18然而，在滤泡性淋巴瘤和CHL中，发现相反的情况，浸润增加与预后改善相关。^19–26旁观者B细胞和其他T细胞亚群的作用更具争议性，尽管有证据表明B细胞功能的微环境标记物与良好结果相关。²⁴爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）的作用尚不清楚，尽管它与该病有明确的相关性。在20%至30%的病例中，EBV存在于恶性细胞中，与混合细胞亚型和某些种族和年龄组的疾病有关。²⁷免疫组织化学（IHC）和基因表达谱（GEP）数据表明EBV可能影响微环境。^24,27

基于组织芯片/免疫组织化学（TMA/IHC）的研究转化为临床研究受到实验再现性和有效性的限制。这包括未能应用一致的方法、有限的队列规模、不适当的统计方法（尤其是最佳切点分析）、未能验证独立患者队列中的发现，甚至专家组织病理学家也存在固有的错误，他们无法计算大面积区域内的大量细胞，从而得出关于异质微环境的结论。将浸润程度分类为高、中或低会导致大量数据丢失和观察者之间的不一致。图像分析软件可以通过统计大区域内的大量事件来克服其中一些问题，但它也有自己的局限性。

本研究旨在检测CHL的免疫微环境，尤其是验证三种CHL微环境表达的生物标记物，这些生物标记物在最近的研究中具有预后意义：巨噬细胞标记物CD68、，¹²调节性T细胞标记物FOXP3，^22–25和B细胞标记CD20。²⁴我们还评估了CD3、CD4和CD8-非特异性T、T辅助物和细胞毒性T细胞标记物。10到20个高功率场（HPF）当量（2到3 mm²)使用图像分析软件进行评估，并作为连续变量报告。这种方法解决了以往IHC工作的主要局限性，即肿瘤评估的有限区域、分类数据丢失和观察者之间的可变性。

患者和方法

结果

CD68表达的预后意义

使用X-Tile软件确定了CD68密度低、中、高的三个预后组，其切点分别小于5%、5%至15%和大于15%(图1)，CD68最低的有利组⁺密度。低、中、高三组的OS差异显著(P（P）=0.02），5年OS分别为89%、80%和65%。FFTF也有显著差异(P（P）= .001). FFTF在晚期（73%、63%和33%；P（P）=0.03）和早期疾病（92%、70%和20%；P（P）= .01).

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图1。

CD68的表达和结果。典型霍奇金淋巴瘤中（A）CD68低表达和（B）CD68高表达的典型例子（放大×20）。通过辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺（HRP-DAB）免疫染色显示CD68的表达。根据CD68低表达（<5%）、中等表达（INT；5%至15%）或高表达（>15%）的区域，患者的（C）一线治疗失败时间和（D）总生存期（OS）。FFTF，无一线治疗失败。

FOXP3表达的预后意义

整体CD3无显著相关性⁺，CD4⁺，或CD8⁺细胞浸润对预后有影响。然而，我们确认FOXP3细胞密度可区分预后组。通过使用X-Tile定义的小于125、125至500和大于500个核/HPF的切点，预后良好组的FOXP3最高⁺密度(图2). 操作系统(P（P）=0.002）和FFTF(P（P）=0.006）在低、中、高三组中差异显著，5年生存期分别为68%、80%和94%。两种晚期患者的预后显著性均保持不变（FFTF：48%、60%和72%；P（P）=0.04）和早期疾病（FFTF:57%、67%和100%，P（P）= .04).

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图2。

FOXP3表达和结果。典型霍奇金淋巴瘤（放大×20）中（A）FOXP3低表达和（B）高表达的典型例子。辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺（HRP-DAB）免疫染色显示FOXP3的表达。根据FOXP3表达细胞的低（<125/hpf）、中（125-500/hpf）或高（>500hpf）数量，（C）一线治疗失败的时间和（D）患者的总体生存期（OS）。FFTF，无一线治疗失败。

CD20表达的预后意义

CD20总表达无预后意义。然而，发现非滤泡CD20表达会影响生存率。通过使用X-Tile软件，1700个单元/mm的切点²（250个细胞/HPF）定义了非滤泡CD20低和高的两个预后组⁺电池密度(图3). 非滤泡CD20高表达患者的OS得到改善(P（P）=0.003），5年时87%对70%，10年时84%对52%，20年时76%对43%(图3C） ●●●●。两组之间FFTF无显著差异（64%v（v）57%;P（P）=.27）或DSS（90%v（v）74%;P（P）= .09).

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图3。

CD20的表达和结果。典型霍奇金淋巴瘤中CD20的（A）低和（B）高非滤泡表达的典型例子（放大×20）。通过辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺（HRP-DAB）免疫染色显示CD20的表达。（C） 基于低（<250个细胞/hpf[高倍视野]）或高（≥250个细胞/hpf）CD20-表达细胞的患者总生存率。

结合CD68和FOXP3的综合预后评分

接下来，我们试图确定CD68、FOXP3和非滤泡CD20的表达是相关变量还是自变量。非滤泡CD20和FOXP3的表达之间存在显著相关性（数据未显示），尽管FOXP3和CD68之间没有显著相关性(P（P）= .684; 附录图A1，仅在线）。接下来，我们确定这两个标记物的综合评分是否提供了额外的预后信息。98名患者的FOXP3和CD68都有合适的核心。根据每个标记物的风险组，将患者分为良好、中等或较差风险组合FOXP3/CD68评分（FOX/Mac），如附录图A2所示（仅在线）。根据FOX/Mac对良好、中等和较差风险的分类，FFTF的结果存在显著差异(P（P）<.001），5年期FFTF分别为93%、62%和47%；决策支持系统(P（P）=0.03），5年DSS为93%、82%和63%（未显示数据）；和操作系统(P（P）=0.002），5年期运营成本分别为93%、82%和59%(图4A和​和4B）。4B） ●●●●。早期和晚期患者的统计显著性均保持不变，早期患者的5年FFTF分别为100%、72%和25%(P（P）=0.005）和92%、62%和50%的晚期患者(P（P）= .008;图4C和​和44D） ●●●●。

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图4。

Kaplan-Meier生存分析通过合并FOXP3和CD68表达的综合评分进行分层（FOX/Mac）。使用FOXP3表达式的切点推导FOX/Mac如附录图A2所示（仅在线）图2和CD68如所示图1（A）基于整个队列FOX/Mac评分的一线治疗失败时间。（B） 基于整个队列FOX/Mac评分的总生存率（OS）。（C） 仅根据早期疾病患者的FOX/Mac评分判断一线治疗失败的时间。（D） 仅晚期疾病患者一线治疗失败的时间。FFTF，无一线治疗失败。

讨论

在CHL中，生物标记物的签名得到了可靠的验证，具有强大的预测能力，并且具有临床实施的成本效益，但仍然很难实现。由于有缺陷的统计分析和未能验证研究结果，很少有生物标志物被转化为临床实践。本研究在一个新的患者队列中验证了最近提出的三个预后生物标志物，并且，据我们所知，这是第一次将自动图像分析系统结合起来，以生成应用于多变量分析的连续变量，它消除了数据分类的潜在数据丢失，并检查了每个生物标记物表达的剂量效应。这项研究包括对分类数据的单独分析，这些数据与它要验证的研究相比较，更适用于手工评分和临床翻译。对于CD68、FOXP3和CD20生物标志物中的每一种，先前研究中提出的预后相关性得到了证实。

在分类分析中，非滤泡CD20表达预示着优越的OS，而在连续数据分析中不保留剂量效应。在分类分析中，CD68高表达可预测所有生存指标的不良结果，但在连续变量分析中仅对OS显示剂量效应，在多变量分析中不显著。在这两个独立的统计分析中，FOXP3的高表达是最佳预后的最可靠预测因子。作为一个连续变量，该标记物显示出在单变量和多变量分析中均显著的剂量效应。在适用于手动评分或临床应用（高、中、低渗透）的简化评分系统中，它保留了作为分类变量的预测能力。结合FOXP3和CD68的综合分类评分能够区分早期和晚期疾病风险特别低和良好的患者。基于FOXP3浸润细胞绝对数量和患者年龄作为连续变量的预后指数比单独考虑临床因素的指数能够更好地预测OS和DSS。

对各种生物标志物染色的TMA可用于表征CHL微环境，更好地理解疾病病理生理学，并测量患者异质性以预测结果。许多已发表的关于IHC的研究受到实验和统计方法的限制，因此不足以转化为临床实践。从GEP中得出的CHL微环境的结论受到所代表组织的异质性的限制，不同的组提出了不同的实验和统计方法产生的不同的预后GEP模式。^12,24,32这些发现的大规模验证或临床应用因技术费用和缺乏一致性发现而变得困难。发现生物标记物可以预测预后仅仅是对相关性的描述，暗示但并不能有力地证实具有功能重要性的生物机制。例如，FOXP3表达带来的益处可能表明Tregs直接抑制CHL中的恶性B细胞或抑制微环境中支持肿瘤的T细胞。或者，它可能是肿瘤生物学或宿主免疫反应的另一个方面的替代标记物，有助于消除治疗后的残留疾病。它也可能只是代表一个非特异性T细胞激活标记。CD20表达的有利影响可能表明正常B细胞有助于抗肿瘤反应或代表对治疗更敏感的恶性细胞前体。我们发现CD20表达对OS有影响，但对FFTF无影响，这表明正常B细胞在CHL中具有复杂的作用，包括与宿主免疫的相互作用、治疗性远期效应、晚期复发、挽救和总体宿主适应度。巨噬细胞在肿瘤促进中的作用在生物模型中得到了更有力的证明，^10,11但还需要进一步的功能研究来证明单个生物标记物的病理生理重要性。缺乏具有代表性的CHL体内或体外模型仍然存在问题，这是正在进行的研究的重点。

尽管存在这些局限性，相关的IHC生物标记物数据，适当生成，经过严格的统计检验，并得到广泛验证，可能有助于CHL的临床决策。通过显示早期治疗反应，功能成像显示出作为预后工具的巨大潜力，³³但是，预处理预后生物标记物很少，也没有一种常规用于指导治疗。本研究通过检测每名患者的预处理淋巴结衍生组织的程度，并通过分析检测/验证方法用于确定切入点的使用，以及在多变量中独立作为连续变量，验证并确认了最近提出的预后生物标志物分析以证明剂量反应性并避免数据分类中的数据丢失。我们建议仅使用广泛可用的IHC标记物CD68和FOXP3，结合所描述的切点，即可得出一个简单的预后评分，该评分可能具有临床可译性。为了进一步验证这些发现，我们在两个新的独立患者队列中发起了国际合作，并在三个不同的实验室中使用预定义的切点以及自动和手动计数方法。

附录

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图A1。

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FOXP3和CD68表达的差异。CD68表达百分比与表达FOXP3的细胞数的线性回归分析显示无显著相关性(P（P）= .684; F=0.1666）。

图A2。

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根据每个标记的得分推导FOXP3/Mac综合得分，显示（A）患者的分布，其切点由实线和（B）定义的扇区表示，这些切点转化为风险组（P=较差风险，Int=中等风险，G=良好风险）。

脚注

参考文献