人类BDNF基因：作为精神疾病生物标志物的外周基因表达和蛋白水平

摘要

BDNF与易患精神疾病

神经营养素脑源性神经营养因子（BDNF）是中枢神经系统中研究最多、最具特征的神经营养素之一，因其在发育和维持正常脑功能中的重要性而备受关注。已经证实，BDNF通过结合和激活位于突触前和突触后膜上的Trk受体大家族成员之一的肌钙蛋白受体激酶B（TrkB）介导神经元的存活和分化。BDNF与TrkB的结合导致受体细胞内域酪氨酸残基的二聚化和自磷酸化，随后激活细胞质信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C-γ和磷脂酰肌醇-3激酶。¹除了神经营养作用外，BDNF–TrkB信号在突触发育的不同阶段参与蛋白质的转录、翻译和运输，并与不同脑区的几种形式的神经可塑性有关。这一点尤其重要，因为越来越多的证据表明BDNF在包括精神疾病在内的脑相关疾病的病理生理学中发挥作用。²事实上，BDNF表达的变化在抑郁症、精神分裂症（SZ）、双相情感障碍和焦虑症中得到了广泛的研究，大量数据表明BDNF的表达发生了变化，BDNF-功能受损。^三,4,5,6,7BDNF通过作用于神经可塑性、炎症或下丘脑-垂体-肾上腺轴功能等生物机制，也可能是这些病理脆弱性的共同风险因素，这些生物机制在所有这些精神疾病中都发生了改变。

人BDNF基因的结构和转录变体

人类BDNF基因位于11号染色体p13-14区，跨度约为70 kb。该基因具有复杂的结构，因为它由5′端的11个外显子（I–IX，加上Vh和VIIIh）和9个功能启动子组成，这些功能启动子专门用于组织和大脑区域，即外显子I、II（含转录本IIa、IIb和IIc）、III、IV、V（含转录物Va、Vb、Vc和V–VIII–VIIIh，VI（含转录本VIb、VIb–IXabd和VIb–Ⅸbd）、VII（含转录物VIIa和VIIb）和IX（含抄本IXabd与IXabcd；图1).⁴⁰虽然BDNF基因包含九个外显子，但编码序列位于外显子9，有八个上游外显子编码调控区域和细胞类型特异性表达的启动子。⁴¹其中，外显子IV的特征最为广泛，因为该外显子包含启动子元件，调节活性依赖性BDNF的表达。

在单独的窗口中打开

图1

人BDNF基因结构。图中显示了人类BDNF基因的结构；该基因包含11个外显子（I-IX，加上Vh和VIIIh），这些外显子结合成许多不同的转录物。编码DNA序列（CDS）位于外显子IX。还报道了选择性剪接位点和CpG岛。BDNF，脑源性神经营养因子。

每个5′外显子都可以通过选择性剪接产生一个特定的转录物或亚型，其特征都是在3′端存在一个共同的编码区。该3′编码区位于外显子IX内，包含编码前BDNF蛋白的共同序列。因此，通过使用替代启动子和剪接机制，可以生成不同的BDNF转录物，所有这些转录物都编码相同的前BDNF蛋白产物。

事实上，BDNF最初是作为前体蛋白在内质网中合成的（前体蛋白-BDNF；~27 kDa）；⁴²然后将信号肽裂解产生前BDNF，即神经营养素的前体形式，由129个氨基酸的前结构域和118个氨基酸组成的成熟结构域组成，²然后被转运到高尔基复合体，在那里它被分为组成或调节分泌途径。水泡前BDNF要么在细胞内被蛋白水解裂解以生成成熟的BDNF（mBDNF），要么作为前BNNF分泌，然后在细胞外水平裂解以生成mBDNF。囊泡前BDNF可通过内蛋白酶（如弗林蛋白酶）在细胞内转化为mBDNF，或通过前蛋白转化酶在分泌颗粒内转化为mBDNF。或者，前BDNF可以被其他因子如纤溶酶和基质金属蛋白酶在细胞外切割。水泡分泌可能涉及前BDNF和mBDNF，分泌的mBDNF-的量取决于转化酶的类型和活性。⁴³

在不同的发育阶段和出生后的生活中，卵裂效率以及前BDNF与mBDNF的比率是不同的；具体来说，在新生儿和青少年阶段，可以检测到前BDNF和mBDNF，而在成人阶段，mBDNF-占主导地位。²前体形式或前神经营养素，包括前BDNF，激活p75受体，而不是mBDNF激活的TrkB。p75受体是肿瘤坏死因子受体家族的一员，编码细胞质死亡域，可在配体结合后启动细胞凋亡。⁴⁴

制备了一只前BDNF敲除小鼠，在其内源性启动子和其他调节元件的控制下，检测前BDNF的作用。⁴⁵在这个体内在模型中，前BDNF的表达负向调节海马树突复杂性和脊椎密度。这一发现表明，前BDNF起作用体内作为调节海马结构、突触传递和突触塑性效应的生物活性因子，与mBDNF不同。这些结果，再加上出生后发育中大脑中前BDNF的高水平表达，表明这种配体可能是塑造青春期神经回路和突触可塑性的关键调节器，青春期效应也可能在成年期间保持。⁴⁵

BDNF结构的另一个复杂程度是由于位于外显子IX内的两个选择性聚腺苷酸转录停止位点的存在，这两个位点产生两个不同的mRNA群体，其具有短（约0.35 kb）或长（约2.85 kb的）3′非翻译区域（3′UTR）。²这两组转录物的多样性与不同的神经元分布有关。事实上，短3′UTR BDNF mRNA变体仅限于海马神经元的细胞体，而长3′UTR-mRNA也见于树突，⁴⁶表明长3′UTR BDNF mRNA和局部树突状翻译的特异性树突状运输系统。

BDNF转录物IV和IX在人类血液样本中含量最高

BDNF不仅在大脑中表达，除其他组织外，在外周血细胞中也能检测到。⁴⁷在血液中，特别是在精神疾病的情况下，血液被认为是评估疾病生物标志物的替代性和有用的外周组织，BDNF基因表达研究不仅提供了研究总BDNF水平的机会，而且提供了研究不同转录物的调制的机会。对BDNF转录物的分析可能为BDNF表达调控机制提供新的见解，并可能揭示与特定精神疾病相关的更具体的改变。事实上，尽管BDNF mRNA总量的减少与包括抑郁症和SZ在内的几种精神疾病有关，^13,26,30特定BDNF转录物的调节可能是疾病特异性的，或者更重要的是，可能是治疗反应的更好预测因子。然而，到目前为止，还没有关于人类血液中不同BDNF转录物的表达以及精神疾病比赛中BDNF的转录物变化的数据。

BDNF转录物在人外周血和海马中的表达

我们决定将BDNF转录物在外周血细胞中的表达与脑样本进行比较。为此，我们使用实时PCR研究了人类血细胞和海马中主要BDNF亚型（转录物I、IV、Va、Vb、Vh、V–VIII–VIIIh、VIb、VIb–IXabd、VIIb、IXabd和IXabcd）的mRNA水平。人类海马的RNA取自Clontech（意大利米兰Diatech Lab Line），而人类血液样本取自四名对照志愿者的PaxGene试管，这些志愿者签署了我们当地伦理委员会批准的知情同意书。使用PAXgene miRNA Kit（意大利米兰齐亚根）从外周血细胞中分离出RNA，并对一组RNA样本进行BDNF转录表达的定性分析。

然后使用Biorad qPCR Mix（Bio-Rad）在384孔实时PCR系统（Bio-Rad）上运行稀释的RNA样品。如所示图2，我们的结果表明，外显子IV和IX（即转录物IV、IXabd和IXabcd）在两种组织中的表达水平最高，如低Ct值所示。相反，其他转录物，即Va、Vb、V–VIII–VIIIh、VIb–IXabd和VIIb，在外周血中的表达水平较低，如较高的Ct值（>40个PCR周期）所示，而大脑样本的表达水平较高（所有Ct值均<38个PCR循环）。

在单独的窗口中打开

图2

BDNF剪接变体在人类海马和外周血中的表达分析。该图显示了通过实时PCR获得的总BDNF mRNA和不同BDNF剪接变体的Ct值，如在人类血细胞（蓝色条）或人类海马（红色条）中测量的值。BDNF，脑源性神经营养因子。

据我们所知，这些数据首次证明BDNF外显子IV和IX可能直接参与外周水平BDNF总表达的调节。这些转录物可能有助于BDNF在几种精神疾病中的改变，也可能被成功的药物治疗所调节。^11,13,14,31BDNF外显子IV的高表达尤其令人感兴趣，因为其启动子区域在表观遗传调控方面得到了很好的研究，这可能会维持其表达的长期变化（有关BDNF DNA甲基化的详细信息，请参阅下一段）。

BDNF的表观遗传调控：DNA甲基化和microRNA

DNA甲基化

在精神疾病中导致BDNF改变的确切机制目前仍不清楚。BDNF基因位点的表观遗传变化可能提供了基因与环境之间的联系，也可能解释BDNF表达和功能变化的持久性。表观遗传学是指基因表达和特定表型的改变，而不涉及DNA序列的变化。在表观遗传机制中，DNA甲基化可能代表了已被更详细研究的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化在很大程度上与CpG二核苷酸（也称为CpG岛）相关，甲基基团被添加到胞嘧啶残基中。^48,49由于CpG岛倾向于在启动子区域内或附近聚集，甲基化可能是在不同条件下调节选择性BDNF启动子转录的机制之一。BDNF启动子IV在与BDNF表达改变相关的DNA甲基化变化的竞赛中代表了最佳的研究启动子。⁵⁰

到目前为止，关于精神疾病背景下BDNF外显子IV甲基化水平的知识有限，大多数可用数据都是在脑样本中获得的。例如，与对照组相比，自杀受试者Wernicke区BDNF启动子IV的DNA甲基化显著增加，有趣的是，这种高甲基化模式与BDNF转录物IV的低mRNA水平相关。⁵¹据报道，BDNF启动子区域DNA甲基化水平的增加与老年人前额叶皮层BDNF蛋白水平的降低有关。⁵²此外，与蛋氨酸（Met）携带者相比，缬氨酸/缬氨酸纯合受试者的前额叶皮层中也发现较高的DNA甲基化水平，这表明BDNF基因型与DNA甲基化之间存在关联。⁵³表观遗传变化与DNA序列变异相关的概念可能是精神疾病遗传关联研究不一致的部分原因。事实上，多态性可以通过表观遗传过程对基因功能产生影响，这表明除了遗传和环境影响之外，还有一条共同的途径，也是基因与环境相互作用的潜在机制。这表明表观遗传学和基因关联数据之间的整合可以将候选多态性和单倍型对疾病易损性的影响分层，并可以识别与精神疾病相关的易损性特征。

除了DNA甲基化之外，组蛋白修饰还代表了一种有趣的表观遗传机制，它影响组蛋白周围DNA的缩合，并调节转录调节剂对功能区的可及性。很少有研究检测BDNF基因启动子组蛋白修饰在人类中的作用。在死后的脑组织中，BDNF的转录上调（发生于胎儿到儿童和/或年轻成人阶段）显示伴随着组蛋白甲基转移酶H3K4三甲基化（启动子I和IV处活性染色质的标记）的增加。⁵⁴在抑郁症患者中，两项研究表明抗抑郁药可能通过启动子IV H3K27甲基化状态的改变来调节BDNF的表达；例如，与没有服用抗抑郁药史的患者相比，服用抗抑郁剂的患者死后脑组织中H3K27甲基化降低。⁵⁵对治疗无效抑郁症受试者的血细胞进行的一项前瞻性研究显示，在西酞普兰治疗8周后，有应答者的H3K27甲基化水平下降，但无应答者的甲基化水平没有下降。⁵⁶有趣的是，H3K27甲基化与血清BDNF水平和治疗效果呈负相关。只有西酞普兰治疗反应阳性的受试者表现出较高的BDNF和较低的H3K27甲基化，尽管在治疗期之前，未来有应答者和无应答者之间的H3K27甲基化没有差异。⁵⁶

所有这些研究都表明BDNF启动子处的DNA甲基化可能预示着可能的抗抑郁反应。

BDNF第四外显子启动子区DNA甲基化分析

在这里，在我们的综述中，我们还提供了外显子IV启动子区域的DNA甲基化图谱，外显子是外周血中表达最多的外显子之一，也是表观遗传调控方面研究最多的BDNF区域。我们使用亚硫酸氢盐焦磷酸测序方法，包括23个CpG位点，从BDNF基因的核苷酸（nt）27723095到核苷酸27723658，跨越转录起始位点。从我们用于表达BDNF转录物的相同对照受试者中获取DNA样本，并按照制造商的说明使用Gentra Puregene Blood试剂盒（Qiagen）分离DNA。基因组DNA用EZ DNA甲基化金试剂盒（Zymo Research）处理，亚硫酸氢处理的DNA用PSQ HS96焦测序系统进行PCR-焦测序。考虑到该方法的局限性（PCR扩增子350 bp，避免CpG的引物，目标序列40 bp），这些分析旨在覆盖尽可能多的CpG位点。然后，我们将甲基化程度表示为甲基化胞嘧啶（%5-甲基胞嘧啶）的百分比。我们的数据表明，BDNF外显子IV区域在血细胞中甲基化水平较低。的确，正如我们在图3，15个CpG位点的mC小于5%；5个CpG位点具有5–10%的5 mC；只有三个CpG位点显示大于10%5mC。有趣的是，甲基化水平最高的三个CpG位点位于距离转录起始位点最远的位置。

在单独的窗口中打开

图3

对照组受试者外显子IV的DNA甲基化谱。该图显示了外显子IV启动子区域内23个CpG位点的甲基化情况。甲基化程度表示为甲基化的胞嘧啶百分比（%5-甲基胞嘧啶）。15个CpG位点具有<5%5 mC，5个CpG-5 mC到10%的位点，只有3个CpG>10%5 mC的位点。

BDNF作为精神疾病的外周生物标志物

疾病生物标记物可以定义为特定分子的生物变化，这些分子对疾病具有诊断或预测价值，可以评估患者对特定治疗的反应性。^83,84生物标记物可以在任何生物医学背景下找到，有助于精神疾病的鉴别诊断，而精神疾病通常表现出重叠的症状。¹¹为了实现这一目标，生物标记物的识别可以改进和促进疾病亚型的分类，并可以控制药物的反应，从而将患者分层为更均匀、临床上不同的亚群。⁸⁵

到目前为止，全基因组关联研究尚未发现BDNF基因的常见变异与精神疾病之间存在任何显著关联。这可能是因为有证据表明，精神障碍是一种复杂的疾病，涉及不同脆弱性基因中的几种常见变异，每种变异的影响都很小。此外，这些疾病的特点也是遗传因素和环境因素之间的复杂相互作用。与此相一致，一些研究结果现在报道了Val66Met SNP与环境因素，特别是儿童逆境，在影响海马体形成方面的相互作用，^86,87或者导致更容易自杀⁸⁸抑郁症患者。此外，几项研究报告了BDNF-Val66Met与Serotonin Transporter 1或Catechol-O-methyltransferase功能SNP在缓解抑郁易感性方面的遗传上位性。^89,90,91

根据BDNF与几种精神疾病，特别是抑郁症的相关性，^{11,12,13,92,93}这种神经营养素被认为是一种有价值的生物标志物，可用于特定的精神疾病以及治疗反应。

不幸的是，尽管分析方法很敏感，但健康人的脑脊液BDNF水平已经达到检测极限。⁹⁴此外，脑组织中BDNF的分析仅限于尸检，这是一个很大的局限性，因为对死后组织的研究受到一些伪影的影响，这些伪影与药物、死因、濒死状态和死后间隔有关。^95,96因此，为了有可能研究活体BDNF，在过去十年中，许多研究已经研究了外周血中神经营养因子的基因表达和蛋白质水平，这可能提供显著的优势，可以通过微创技术大量获得。^11,97

有趣的是，当首次在抑郁症患者和对照组的外周血中检测BDNF时，Karege等。据报道，与对照组相比，无药抑郁症患者的BDNF血清和血浆水平降低。^98,99这些数据随后被不同的小组复制，包括我们自己的小组，^13,100这一致表明抑郁患者的血浆或血清BDNF水平降低，并可能在有效的抗抑郁治疗后恢复正常。^{三,11,12,101}有趣的是，在最近的一项荟萃分析中，Polyakova等。^三与健康人相比，不仅抑郁症患者，而且双相情感障碍患者的血清和血浆BDNF水平降低。事实上，循环BDNF水平的改变并不是抑郁症的特异性改变，正如在其他精神疾病中也发现的那样。^30,84另一项最近的荟萃分析表明，慢性精神分裂症患者的血清BDNF水平降低^31,102以及第一次发作的精神病患者。¹⁰³这些结果可能并不令人惊讶，因为压力不仅是抑郁的风险因素，也是SZ和其他精神疾病的风险因素。压力能够降低BDNF水平。⁴⁷因此，外周血BDNF的减少可能是常见的病理生理机制的基础，其特征是神经元可塑性降低，这可能与一些精神疾病相同。

鉴于脑BDNF跨越血脑屏障，¹⁰⁴可以合理假设血液中BDNF基因的表达和蛋白质水平与大脑中的类似。数据表明，在大鼠神经发育过程中，血清BDNF和皮层神经营养素水平呈正相关，这一假设得到了支持⁹⁸以及BDNF血清含量与神经元完整性标志物N-乙酰天冬氨酸皮质水平之间的正相关。¹⁰⁵然而，血液中高浓度的BDNF可能不仅来源于大脑，还来自其他外周来源。在血液中，BDNF主要储存在血小板/血小板中，但不合成。^{98,99,106,107}这可能解释了血清与血浆中测定的BDNF水平之间约200倍的差异，这可能是因为凝血过程中BDNF从血小板释放到血清中。⁹⁹然而，血小板可作为不同来源BDNF的储存室，因此是调节BDNF稳态的活性因子。¹⁰⁶有趣的是，血小板释放BDNF的缺陷已被证明发生在抑郁症患者身上。⁹⁹

与对照组相比，抑郁症患者白细胞中BDNF mRNA水平也显著降低。¹⁰⁰我们的研究组证实了这些结果，与对照组相比，抑郁症患者血液中BDNF mRNA表达降低，血清BDNF水平降低。¹⁴重要的是，我们还报道了抗抑郁治疗能够将BDNF水平恢复到控制值，更重要的是BDNF的水平增加与症状改善之间确实存在相关性，这表明可能需要调节BDNF才能获得积极的临床结果。¹⁴此外，我们还发现白细胞BDNF mRNA水平和血清BDNF蛋白水平在基线检查和抗抑郁治疗期间存在相关性，这表明抑郁患者BDNF蛋白质水平的变化可能至少部分是，与白细胞而不仅仅是血小板合成和分泌BDNF有关。^99,108

重要的是，与蛋白质水平相比，外周血BDNF mRNA的表达可能更准确地反映BDNF生理学的核心机制。⁴⁷为了支持这一假设，外周血细胞的mRNA图谱与在不同脑区观察到的mRNA重叠，^109,110,111这表明血细胞可能为包括精神疾病在内的不同脑疾病的发病机制提供有价值的信息，并可能导致识别用于诊断评估和个性化治疗的创新生物标志物。^112,113

虽然外周血BDNF基因表达和蛋白水平经常被认为是几种精神疾病，尤其是抑郁症的生物标志物，但其局限性仍然存在，应予以讨论。不幸的是，大多数已发表的研究都是异质的，显示出非常小的影响规模。此外，根据许多作者的研究，外周血BDNF的改变对于特定的精神疾病来说还不够特异。未来的研究应按照多学科方法进行设计，从而考虑BDNF表达和甲基化蛋白水平。

为了检验影响血清BDNF水平的潜在决定因素（抽样特征、社会人口统计学变量、生活方式指标和慢性病），Bus等。¹¹⁴对目前没有精神或神经疾病的人群进行了一项大规模、明确的队列研究。作者确定了血清BDNF水平的八个独立决定因素：（1）采血时间，（2）储存时间，（3）采样前的食物摄入，（4）城市化，（5）年龄，（6）性别，（7）吸烟状态和（8）饮酒行为。根据这些发现，作者建议，未来对人类血清BDNF水平的研究应考虑并纠正所有这些变量。虽然影响大小通常较小，需要在随后的临床样本中测试临床相关性，但作者还建议，将吸烟者、过度饮酒者和不遵守试验前禁食方案的受试者排除在临床研究之外，并保持储存时间有限的重要性。

另一个有趣的与BDNF变化相关的混杂因素，如Molendijk所示等。,¹¹⁵抑郁患者和健康对照组的血清BDNF浓度的明显季节性变化：春季和夏季BDNF的浓度增加，而秋季和冬季BDNF水平下降。正如作者所报告的那样，这些结果提供了强有力的证据，表明血清BDNF浓度在一年中有系统地变化，在设计和解释BDNF研究时应予以考虑。

结论

一些证据表明，BDNF可能是不同精神疾病发病机制中的关键因素。虽然这种关系的确切机制尚待完全确定，但可能涉及表观遗传因素，如DNA甲基化和miRNAs。此外，BDNF外显子IV和IX代表外周血中最丰富的转录物，表明它们在外周水平的BDNF调节中起着关键作用。在这些基础上，对这些转录物的分析可能会对病理条件下以及药物治疗期间BDNF调节的机制提供新的见解。

重要的是，正如我们在这篇综述中所述，外周血或血浆中BDNF基因表达和蛋白水平一直被发现在几种精神疾病中失调，包括重度抑郁障碍、SZ、BD和焦虑障碍。因此，外周血BDNF水平不能被视为特定临床表现和精神症状的生物标志物。反过来，BDNF剪接变异体可以代表更特异的外周生物标记物，用于精神疾病的鉴别诊断。确实，特定的BDNF亚型受特定因子调节，并参与差异途径；因此，它们可以反映特定信号的变化，并可能代表与鉴别诊断相关的有用生物标记物，但这需要进一步研究。然而，我们的主要假设是，在几种精神疾病中观察到的BDNF水平降低可能代表一种跨诊断生物标记物，即神经可塑性降低和压力相关应对机制能力降低的指标，这些特征在所有这些精神疾病中都有改变。

脚注

工具书类