ALCAM在神经炎症和血脑屏障稳态中的双重作用

ALCAM KO小鼠出现更严重的活性EAE，与浸润CNS的炎症前白细胞显著增加相关。

为了评估ALCAM在EAE发病机制中的作用，使用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）在WT和ALCAM KO小鼠中诱导活性EAE_35–55完全弗氏佐剂（CFA）。与我们根据以前的出版物所预期的相反(11,24)，ALCAM KO小鼠出现了更严重的临床症状[曲线下面积（AUC）：WT，86.48±6.80；ALCAM KO，117.6±7.21]，表现出缓解减弱，通常发病更早（在其WT窝友出生前1天）(图2A类). 用重组人MOG诱导的其他活性EAE实验证实了这些结果(图S2A类). 此外，这些观察是在两个不同的动物设施中进行的，使用了独立繁殖的ALCAM KO小鼠及其WT窝友，证明了结果的确定性。尽管在整个疾病过程中，两组腹股沟引流淋巴结中发现的免疫细胞的绝对数量几乎相同，但诱导后9天（dpi），ALCAM KO动物的脾细胞绝对数量显著增加(图2B). 另一方面，渗入ALCAM KO小鼠中枢神经系统的免疫细胞的绝对数量最高出现在12dpi，比其WT同窝小鼠早3d(图2C类). 在那些CNS浸润免疫细胞中，IFNγ⁺，IL-17⁺和干扰素γ⁺/白介素-17⁺流式细胞术检测发现，与WT动物相比，ALCAM KO动物的CD4和CD8 T淋巴细胞进入CNS的时间更早，数量更多(图2D类). 此外，CD4的数量⁺CD25型⁺FOXP3公司⁺在ALCAM KO和WT CNS的整个疾病过程中发现调节性T淋巴细胞相似(图2E类)这表明，在ALCAM KO小鼠中观察到的疾病严重程度增加并不是由于免疫调节系统缺陷所致。最后，也是重要的一点是，我们没有观察到外周细胞因子产生的差异(图S2B)这表明，ALCAM KO动物中枢神经系统中致脑淋巴细胞的增强和早期募集并不是由循环激活的外周免疫细胞数量增加引起的。

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图S2。

(A类)重组人MOG免疫C57BL/6 WT和ALCAM KO小鼠的平均累积临床EAE评分。显示的数据是每组42只WT和45只ALCAM KO小鼠的平均值±SEM，是n个=3个独立实验。AUC：重量，54.88±2.29；ALCAM KO，64.07±2.59*P（P）≤ 0.05. (B)CD4百分比⁺或CD8⁺从ALCAM KO和WT小鼠脾脏和LNs中分离的T淋巴细胞在–MOG后不同时间点表达IFNγ和/或IL-17_35–55诱导活性EAE。显示的数据是每个时间点三只动物的平均值±SEM。

虽然EAE主要是一种CD4 T淋巴细胞驱动的疾病，但髓细胞在疾病的形成和缓解期也起着关键作用。因此，我们通过流式细胞术评估了中枢神经系统中M1（促炎）与M2（抗炎/组织修复）单核细胞/巨噬细胞的比率。正如不断增加的临床评分所预期的那样，ALCAM KO小鼠在疾病高峰期（12 dpi）和慢性期的M1比M2比率更高(图2F类). 总的来说，在12dpi时采集的ALCAM KO和WT动物脊髓材料的原位免疫荧光共聚焦显微镜证实了这些结果（得分分别为3.0和2.5）。CD4和F4/80的免疫染色以及泛胺素证实，与WT动物相比，ALCAM KO EAE小鼠中枢神经系统中辅助性T淋巴细胞和巨噬细胞的数量显著增加(图2G公司和H（H）).

BBB-EC上缺乏ALCAM会增加EAE疾病的严重程度。

不同的CAM（即ICAM-1和VCAM-1）可以补偿KO动物中缺乏特定CAM的情况(32–34). 因此，我们选择通过流式细胞术比较在休息或刺激条件下（TNF和IFNγ）WT和ALCAM KO小鼠CNS ECs原代培养物上其他CAM的表达。虽然我们确认一些CAM在炎症时上调，但我们无法证明ALCAM KO EC中存在这种代偿机制(图3A类). MCAM、Ninjurin-1和CD62E，先前显示参与特定免疫细胞类型向中枢神经系统的募集(14,15,20,35,36)ALCAM KO和WT小鼠BBB-EC（MBEC）在休息或刺激条件下均无显著差异(图S3).

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图3。

BBB-EC上缺乏ALCAM会增加EAE疾病的严重程度。(A类)通过流式细胞术评估在静息或刺激（刺激；TNF和IFNγ）条件下从WT和ALCAM KO小鼠分离的MBEC原代培养物上CAMs（ALCAM、PECAM-1、ICAM-1、VCAM-1、ICAM-2和CD34）的表达。n个=使用四种原代培养物的4个独立实验。(B)用MOG过继转移的WT和ALCAM KO小鼠的平均累积EAE临床评分_35–55–重新激活WT脾细胞。所示数据代表n个=3个独立实验，每组20只动物。(C–E类)过继转移EAE实验中WT或ALCAM KO动物中枢神经系统浸润免疫细胞的特征，转移后12天（如所示B). (C类)从受体小鼠的中枢神经系统分离出的免疫细胞的绝对数量。(D类和E类)表达表面标记CD4、CD11b、CD11c和CD8的CNS浸润免疫细胞的百分比以及ALCAM的百分比⁺、CD44hi、干扰素γ⁺和IL-17⁺在前面的表面标记上选通的细胞。显示的数据是每组3-4只动物的平均值±SEM，代表了三个转移实验。(F类)用MOG过继转移的WT和ALCAM KO小鼠的平均累积EAE临床评分_35–55–重新激活ALCAM KO脾细胞。所示数据代表n个=3个独立实验，每组26只WT和20只ALCAM KO小鼠。(G–I型)移植后12天过继移植EAE实验中浸润WT或ALCAM KO动物中枢神经系统的免疫细胞特征（如所示F类). (G公司)从受体小鼠的中枢神经系统分离的免疫细胞的绝对数量。(H（H）和我)表达表面标记CD4、CD11b、CD11c和CD8的CNS浸润免疫细胞的百分比以及ALCAM的百分比⁺、CD44hi、干扰素γ⁺和IL-17⁺在先前表面标记上门控的细胞。显示的数据是每组四只动物的平均值±SEM，以及三个转移实验的代表性数据*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001.

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图S3。

粘附分子CD62E、Ninjurin-1和MCAM在从WT和ALCAM KO小鼠分离的MBEC原代培养物上的表达，用TNF和IFNγ（刺激）刺激或在静息状态下，通过流式细胞术进行评估。所示数据为平均值±SEMn个=使用四种原代培养物的4个独立实验*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01.

然后，我们通过向WT和ALCAM KO小鼠注射WT MOG-活化的脾细胞来执行被动（过继转移）EAE(图3B). ALCAM KO接受者比其WT同龄人早2天出现第一症状，在疾病高峰期和随后的缓解期表现出更高的临床评分（AUC：WT接受器，21.43±1.94，ALCAM KO接受剂，38.06±5.03）。ALCAM KO患者的发病率也略高于WT患者，分别为100%和95%。此外，细胞移植后12天，ALCAM KO受体中CNS浸润免疫细胞的绝对数量较高，证实了临床评分(图3C类). 从这些免疫细胞中，CD4的百分比⁺ALCAM KO中的T淋巴细胞较高，而CD8的百分比⁺WT受体的T淋巴细胞较高(图3D类). 正如预期的那样，ALCAM的百分比⁺ALCAM KO动物的白细胞较低，因为只有供体细胞表达该蛋白。然而，它表明只有大约20%的CD4⁺T淋巴细胞和CD11b⁺ALCAM KO CNS中的单核细胞来源于供体细胞(图3D类). 虽然两个受体组CD4和CD8 T淋巴细胞的百分比不同，但除IFNγ外，IFNγ或IL-17阳性细胞的百分比相似⁺CD4细胞⁺T淋巴细胞(图3E类). 总的来说，这意味着分泌更多促炎细胞因子的CD44hiCD4⁺第12天，ALCAM KO的中枢神经系统中存在T淋巴细胞，而CD8 T淋巴细胞则相反。最终，该转移实验允许我们假设BBB-EC上缺乏ALCAM可能会破坏BBB的稳定性，从而解释在MOG诱导的活性EAE中观察到的EAE严重程度增加。

然后，我们进行了反向转移实验，将ALCAM KO脾细胞注射到ALCAM KO幼稚受体或其WT同窝仔中。ALCAM KO受体的发病稍早，与WT受体相比，动物出现更严重的EAE评分（AUC：ALCAM WT受体，60.85±8.89，ALCAM KO受体，90.67±10.69）(图3F类). ALCAM KO小鼠的疾病发病率也较高，为83%，而WT小鼠为72%。尽管ALCAM KO受体在12dpi后CNS浸润免疫细胞的绝对数量没有显著增加，但可以观察到明显的趋势，尽管存在很大的差异(图3G公司). 与WT-KO/WT转移实验类似，CD4的百分比更高⁺流式细胞术可以在ALCAM KO受体的CNS中观察到T淋巴细胞，而CD8的百分比较小⁺出现T淋巴细胞(图3H（H）). 因为ALCAM⁺中枢神经系统中存在的白细胞只能来源于受体，实际上没有ALCAM⁺如预期，在ALCAM KO动物中检测到信号(图3我). 最后，ALCAM KO受体CD4 T淋巴细胞IFNγ或IL-17阳性或CD44高水平表达的百分比较高(图3J型). 在CD8上进行选通时获得了类似的结果⁺T淋巴细胞，但IFNγ除外，其在两组中的表达水平相同(图3J型). 总的来说，这个转移实验证实了我们的假设，即BBB上的ALCAM表达有助于保持其完整性。

ALCAM KO动物的BBB更具渗透性。

接下来，我们在体内外测试了ALCAM KO BBB的完整性。使用跨内皮电阻（TEER）分析，我们首先证明了来自ALCAM KO小鼠的原代小鼠脑微血管内皮细胞（pMBMECs）的融合单层比WT对应物的渗透性显著增强（即阻力较小）(图4A类). 虽然TEER测量可以清楚地评估内皮屏障的完整性，但我们还决定在改良的体外Boyden小室实验中，使用BSA和10-kDa右旋糖酐作为渗透性标记物，以证实结果，在该实验中，MBEC的汇合单层生长在插入物上。这种示踪扩散分析表明，与WT细胞相比，ALCAM KO MBEC具有更高的渗透系数(图4B)当使用静息MBEC或用TNF和IFNγ刺激的MBEC时。接下来，我们想用体内方法确认这些体外数据。使用静脉注射的不同大小的荧光右旋糖酐标记物，我们测量了幼稚动物以及EAE小鼠在7和10 dpi时CNS中这些示踪剂的积累（以及间接的BBB通透性）。虽然幼年ALCAM KO动物的CNS血管的通透性并不比对照组WT同窝动物的强，但症状前期ALCAM KO EAE动物的CNS-血管对3kDa葡聚糖小分子标记物的通透率明显高于WT同胎动物的血管(图4C类); 大分子右旋糖酐标记物的血管通透性差异在10dpi时变得明显，与发病时间相对应(图4C类). 此外，与WT对照组相比，在1岁大动物的组织上进行的免疫荧光染色显示，ALCAM KO动物的CNS中IgG和纤维蛋白原沉积水平较高(图S4B和C类). 此外，通过增加GFAP的表达，观察到这些ALCAM KO动物中广泛的星形胶质细胞激活(图S4A类)可能是血液制品渗入缺陷BBB（包括纤维蛋白）时星形胶质细胞活化的反映。这些结果共同证明，ALCAM失调导致BBB通透性增加。

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图4。

ALCAM KO小鼠表现出TJ分子的紊乱，这转化为内皮细胞通透性的增加。(A类)从WT或ALCAM KO小鼠分离的pMBMEC融合单层的TEER值，相对于WT值表达（1.0）。所示数据为三次进行的七个独立实验的平均值±SEM。(B)10-kDa右旋糖酐和BSA在体外通过未经治疗或经TNF和IFNγ治疗的WT或ALCAM KO小鼠MBEC单层的渗透系数（刺激）。所示数据是每个条件下3-4个重复的平均值±SEM，代表n个=3个独立实验。(C类)在WT和ALCAM KO小鼠EAE期间的不同时间点通过静脉注射荧光标记的右旋糖酐（3和20 kDa）实现体内BBB通透性。数据以血液荧光强度的百分比表示，并通过荧光分光光度计进行测量。所示数据为每个条件下5–15次重复的平均值±SEMn个=3个独立实验。(D类)闭塞素免疫荧光染色（红色；左侧)，α-catenin（绿色；居中)和ZO-1（红色；赖特)在幼稚ALCAM KO和WT小鼠的脊髓切片中。细胞核，蓝色。（比例尺，20µm）数据代表每只动物和n个=每组4只动物。(E类)通过共焦显微镜评估原始ALCAM KO和WT脊髓切片中结合分子的最大像素强度分析。n个=每组25–65条血管。(F类)MBEC原代培养中结合分子的最大像素强度分析。n个=每组160–260个细胞结*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01, ***P（P）≤ 0.001.

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图S4。

(A类)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑白质(左侧)和浸润脑膜周围的脑实质组织(赖特). 组织切片染色GFAP（红色）、泛蓝（绿色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。(B)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑周边脑膜(左侧)，浸润脑膜周围的脑实质组织(居中)和脑白质(赖特). 组织切片染色以检测小鼠IgG（红色）、泛蓝蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。(C类)ALCAM KO的免疫荧光图像(顶部)和WT(底部)脑周边脑膜(左侧)和脑白质(赖特). 组织切片染色纤维蛋白原（绿色）、P120（红色）和细胞核（蓝色）。（比例尺，15µm）数据代表每只动物的四个截面。

ALCAM KO动物BBB处的连接分子表达发生改变。

为了解释ALCAM KO中BBB通透性增加的原因，我们评估了连接分子的表达。使用免疫荧光共焦成像，我们根据最大荧光强度评估了TJ和AJ分子的组织及其表达水平。对幼稚动物脊髓切片的分析表明，ALCAM KO小鼠中TJ蛋白clodin和ZO-1以及AJ蛋白α-catenin的表达降低(图4D类). 我们进一步证明，在ALCAM KO幼年动物脊髓切片的BBB水平上，claudin-5、p120和ZO-1也在原位下调，而PECAM-1和β-catenin的表达相似(图4E类). 同样，我们比较了MBEC培养物中连接分子的表达。使用相同的方法，体外显示α-/β-catenin、claudin-5、ZO-1和VE-cadherin的表达降低，而PECAM-1和ICAM-1的表达具有可比性(图4F类). 虽然我们也分析了EAE动物的脊髓，但结果因临床评分而异。此外，大量血管周围浸润的存在、免疫细胞对连接分子的破坏以及脱髓鞘病变中碎片的存在使分析变得更具挑战性。

主动EAE疾病诱导和评分。

EAE是在6-9周龄雌性C57BL/6小鼠中诱导的，如先前发表的(14,15). 简而言之，用200μg s.c.的MOG免疫动物_35–55（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；Alpha Diagnostic International）或100μL CFA乳剂（4 mg/mL）中的重组人MOG结核分枝杆菌; Fisher Scientific）。在第0天和第2天，腹腔注射百日咳毒素（500 ng PTX，Sigma-Aldrich）。使用的评分系统如下：0，正常；1、尾巴软；2、缓慢的右侧反射；2.5，行走困难/共济失调；3、一侧后肢瘫痪（单侧肢体麻痹）；3.5，后肢单肢松解和另一后肢严重无力；4、双后肢瘫痪（副瘫痪）；4.5，后肢截瘫和前肢无力；5、奄奄一息（需要牺牲）。一名对转基因组不知情的研究人员对小鼠进行了评分。

用200µg MOG在8周龄雌性小鼠体内诱导B.E.实验室中的活性EAE_35–55在IFA（LabForce；Santa Cruz Biotechnology）中补充4 mg/mL干燥结核分枝杆菌（H37RA；Difco/BD Biosciences/BD Clontech）。在免疫后第1天和第3天，每只小鼠腹腔注射300 ng甲状旁腺素（List；LuBioScience）。体重和临床严重程度每天评估两次，评分如下：0，健康；0.5，肢尾；1、后腿无力；2、后腿截瘫；后腿截瘫和失禁。

转移EAE。

如前所述执行传输EAE(14). 简言之，除PTX（500 ng）仅在第0天注射外，如上所述诱导了活性EAE。在第7天，杀死小鼠，并从LN和脾脏中回收白细胞，如之前公布的那样(58). 分离的细胞在添加10%（vol/vol）FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸、Hepes、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的RPMI中培养90小时。在MOG存在的情况下进行细胞的再活化_35–55、rhTGF-β、rmIL-6、rmIL-23和rmIL-12（研发系统）。在第2天将含有rmIL-23（初始浓度的500%）的新鲜完整培养基（初始体积的20%）添加到所有培养物中。然后收集细胞，在Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中清洗，然后进行流式细胞仪分析。我们注射了25×10⁶所有受体雌性C57BL/6动物腹腔注射的白细胞总数。受体小鼠在转移后第2天接受单剂量的PTX腹腔注射（200ng）。使用的评分系统与上述相同。

MBEC/pMBMEC。

小鼠脑实质毛细血管内皮细胞（MBEC）的原代培养物由10至15 WT或ALCAM KO 7-9周龄雌性C57BL/6小鼠制备。在不灌注的情况下分离大脑，并切除脑膜/脉络丛。在机械Dounce均质机中以低速将薄壁组织切碎并均质。然后在37°C下，将匀浆在含有0.7 mg/mL II型胶原酶（沃辛顿生化公司）和39 U/mL DNase I（沃辛斯顿生化公司）的DMEM中消化75分钟。通过1000×离心去除髓磷脂克在20%BSA–DMEM（Sigma-Aldrich）中保持20分钟。然后在37°C下用1 mg/mL胶原酶-dispase（Roche）和39 U/mL DNase I在DMEM中的混合物将剩余的颗粒摇晃1 h。用33%连续Percoll梯度离心1000×克持续10分钟。将微血管置于涂有5μg/mL IV型胶原（Sigma-Aldrich）的六孔培养皿上。MBEC培养在补充了20%（vol/vol）FBS（Sigma-Aldrich）、1 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（Roche）、100μg/mL肝素（Sigma Aldric）、1.4μM氢化可的松（Sigma-Aldrich）和1×抗生素抗真菌溶液（Invitrogen）的DMEM中。在前3天内，每24小时更换一次培养基。在培养的前48小时，向培养基中添加嘌呤霉素（10μg/mL）（Sigma-Aldrich）。72小时后，在培养基中保持4μg/mL嘌呤霉素。培养4-6天后形成融合单层。MBEC培养物表达血管内皮细胞钙粘蛋白。未检测到α-平滑肌肌动蛋白、胶质纤维酸性蛋白或神经元核蛋白的免疫反应性，证实分别没有污染平滑肌细胞、星形胶质细胞和神经元。为了刺激内皮细胞，在实验程序开始前24小时，将小鼠重组TNF（3 ng/mL）和IFNγ（60 ng/mL）（R&D系统）添加到培养基中。

如前所述，在B.E.实验室中分离和培养pMBMEC(9,59).

流式细胞术分析。

如前所述进行细胞外和细胞内染色(14). 简单地说，在细胞内细胞因子染色（ICS）之前，用1μg/mL离子霉素和20 ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）在2μg/mL短纤维蛋白A（均来自Sigma-Aldrich）的存在下激活细胞5小时。在表面抗原染色后，细胞被固定，并在室温下在4%（wt/vol）多聚甲醛和0.1%（wt/vol）皂苷的HBSS中渗透10分钟，然后进行细胞内染色。从LN、脾脏和CNS分离的小鼠免疫细胞被标记为以下针对表面标记物的抗体：CD3、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD25、CD45、CD54/ICAM-1和CD62E（来自BD Biosciences）；CD6和CD44（来自eBioscience）；CD31/PECAM-1、CD34、CD102/ICAM-2、CD106/VCAM-1和CD146（来自Biolegend）；CD166/ALCAM（研发部FAB1172P）；和Ninjurin-1（由BD Biosciences定制）。对于小鼠细胞因子的细胞内染色，使用了以下针对小鼠的抗体：IL-17、GM-CSF、TNF和IFN-γ（来自BD Biosciences）以及GzB和穿孔素（来自eBiosciency）。使用eBioscience固定/渗透试剂盒结合抗FOXP3抗体（eBioschience和BD Biosciens）进行核内染色。使用合适的荧光染料匹配的同种型抗体评估非特异性背景染色。在同一天处理细胞，对BD LSR II进行分析，并使用BD FACSDiva软件（BD Bioscience）分析数据。

M1-M2单核细胞/巨噬细胞的流式细胞术分析策略。

CD45、CD11b、Ly6C阳性细胞^你好CD11c和CD43（BD Biosciences）、NK1.1和IL-10（BD生物科学和Biolegend）以及CD206（Biolegeng）均为阴性，被认为是M1单核细胞/巨噬细胞或“经典激活”的促炎细胞。CD45、CD11b、CD43、CD206和IL-10阳性细胞和CD11c、NK1.1、Ly6C阴性细胞^你好IL-12被认为是M2单核细胞/巨噬细胞或“交替激活”的抗炎细胞。

体外T淋巴细胞增殖测定。

使用Miltenyi Biotec磁珠和磁柱，CD4⁺从WT症状前活跃EAE动物的排泄LN和CD11b中分离出T淋巴细胞（阴性选择）⁺从WT和ALCAM KO小鼠的脾脏中分离出单核细胞（阳性选择）。使用活性染料5,6-羧基荧光素二醋酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记T淋巴细胞，并在WT或ALCAM KO单核细胞存在下培养4d。使用细胞因子混合物和在免疫细胞体外复活期间使用的培养基来诱导被动EAE。流式细胞术检测T淋巴细胞增殖和细胞因子产生。

CNS材料和细胞培养的免疫染色。

如前所述，对快速心内灌注后从小鼠获得的CNS标本（脑和脊髓）的冰冻切片进行了研究(60–62). 首先，通过Luxol Fast Blue（LFB）和Hemoxilin and eosin（H&E）染色，确定EAE病变，即与血管周围免疫细胞浸润相关的脱髓鞘区域。选择活动病灶附近的切片进行免疫组织荧光。在丙酮中固定10分钟后，将切片转移到乙醇中5分钟，在PBS中水合，并用次级抗体宿主的10%种特异性血清封闭。在3%血清中稀释的初级抗体在室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜。用PBS吐温20（0.05%）洗涤后，在室温下培养次级抗体45分钟。然后使用含有Topro-3（Invitrogen，1:400）的Mowiol试剂安装切片。每个实验都包括阴性对照（仅与二级抗体孵育）。对于免疫细胞荧光，将MBEC胰蛋白酶化并转移到涂有IV型胶原的Ibidiμ-载玻片VI 0.1中。一旦细胞汇合，用70%乙醇固定5分钟，然后用PBS吐温20（0.05%）渗透5分钟。随后的染色程序同上。使用了以下主要抗体：兔抗层粘连蛋白（1:2000，Dako）、鼠抗CD4（1:70，BD Bioscience）、大鼠抗F4/80（1:80，Biolegend）、兔抗闭塞素（1:50，Invitrogen）、兔对抗α-连环蛋白（1:40，Invit罗gen），兔抗克劳丁-5（1:100，Invitorgen）和山羊抗p120（1:30，Santa Cruz），兔抗–ZO-1（1:70，Invitrogen）、兔抗–β-catenin（1:150，Invit罗gen），大鼠抗–VE-cadherin（1:10，BD Bioscience），鼠抗–PECAM-1（1:300，BD生物科学），鼠防–ICAM-1（1:100，eBioscision），兔抗纤维蛋白原（1:1500，Innovative Research）。使用徕卡共焦显微镜SP5平台（徕卡微系统）进行荧光采集。使用徕卡LAS AF和ImageJ（NIH）软件进行图像处理和分析。

逆转录聚合酶链反应。

RT-PCR按照之前发布的方法进行(11). 简单地说，使用RNeasy Mini Kit从WT和ALCAM KO MBEC的原代培养物中提取总RNA，并根据制造商的说明使用QuantiTect逆转录试剂盒（均来自Qiagen）将其转录成cDNA。PCR使用ALCAM和GAPDH特异性引物。

免疫沉淀。

MBEC匀浆由T75烧瓶中的P0单层制备而成。用室温PBS冲洗细胞三次，然后刮除并转移到PBS中的15 mL试管中。细胞通过400×离心沉淀克在室温下保持10分钟。去除上清液，并用移液管将每个T75烧瓶的200µL冰镇RIPA缓冲液（ThermoFisher Scientific）均匀化细胞颗粒。将匀浆转移到1.5-mL Eppendorf试管中，在冰上培养20分钟，然后在13000×克在4°C下放置10分钟，以沉淀细胞核。上清液收集在新的预冷1.5-mL Eppendorf管中。根据制造商的说明，使用BCA蛋白质测定试剂盒（PIERCE）测定匀浆的蛋白质浓度。

为了免疫沉淀ALCAM，按照制造商的说明，将50µL Dynabeads蛋白G（ThermoFisher Scientific）偶联到10µG多克隆山羊抗鼠ALCAM（R&D Systems，AF1172）或10µG无关山羊IgG（R＆D Systems）。为了避免Ig的偶联后洗脱，按照制造商的说明，用BS3[双（磺基琥珀酰亚胺）琥珀酸]交联剂（ThermoFisher Scientific）将其共价连接到珠子上。将总共50µL的所得抗ALCAM Dynabeads或不相关的IgG对照品与200µg MBEC匀浆在4°C温和旋转培养过夜。然后用20（0.05%）之间的PBS清洗珠子四次。将上清液完全去除，并将40µL 1×SDS负载缓冲液（含2.5%β-巯基乙醇）添加到珠子中，并在重新悬浮后在室温下培养15分钟。将小球在95°C下煮沸5 min，然后在13000 rpm下离心2 min。收集上清液并在SDS/PAGE中迁移，转移到PVDF膜上，并用相应的抗体进行免疫染色。

免疫印迹。

如前所述进行免疫印迹(11,63). 简单地说，用标准SDS/PAGE分离MBEC裂解物或BBB血管裂解物，并用以下抗体分析免疫印迹：山羊抗ALCAM（0.25μg/mL，AF1172，R&D Systems）；兔抗ZO-1（1:125，Invitrogen）；兔抗ZO-2（1:125，Invitrogen）；兔抗扣带蛋白（1:500，Thermos）；兔抗TARA（1:500，Thermos）；小鼠反电子素1C（1:500，Abnova）；小鼠抗β-肌动蛋白（1:20000，Sigma-Aldrich）；鼠标抗TPM（1:500，Sigma-Aldrich）；兔抗闭塞素（1:250，Invitrogen）；兔抗艾兹林（1µg/mL，Abcam）；和兔抗合成酶-1（1:500，Bios）。辣根过氧化物酶结合二级抗体（Dako）和ECL系统（Amersham Biosciences）用于检测特异性结合，抗β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）用作负荷控制。使用Bio-Read-Gel-Doc系统获得的数字图像进行带强度分析。

TEER测量。

pMBMECs形成的汇合单层的阻隔性能(59)根据制造商的说明，通过阻抗TEER测量（CellZscope R、Nanoanalytics）评估在过滤器插入物上生长的ALCAM KO或WT小鼠（孔径0.4-μm，直径8.36mm；ThinCertTM、Greiner Bio-One、Vitaris AG）。

MBEC对示踪分子的体外渗透性。

分离MBEC并在六孔板中培养至90%汇合。然后，使用在PBS–EDTA（2 mM）中稀释的0.25%胰蛋白酶，快速分离细胞，并以4×10的密度将其置于明胶/胶原IV涂层、孔径为3μm的Boyden室中⁴每个孔的细胞数。细胞在3-4天后达到汇合，此时更换培养基，用于补充20%FBS的DMEM培养基。2 h后，将荧光素-异硫氰酸标记的BSA（FITC-BSA，66.5 kDa，Invitrogen）和Alexa 647-标记的葡聚糖（10 kDa、Invitrogen）以50μg/mL的速度添加到上腔。分别在0和1小时从每个上下室中采集50μL等分样品。实验条件制备为三份。示踪剂的渗透性通过荧光多模板阅读器（Biotek，Synergy 4）进行量化，从而可以计算每个荧光标记的渗透系数。

体内BBB渗透率。

通过在不同时间点测量小鼠中枢神经系统中级联蓝标记葡聚糖（3kDa，Invitrogen）和葡聚糖-TRITC（20kDa、Sigma-Aldrich）来评估体内BBB通透性。向小鼠静脉注射生理盐水、0.9%氯化钠（含1 mg右旋糖酐-级联蓝和1 mg右旋糖酐-TRITC）。然后，15分钟后，通过心内穿刺获得200μL的血液，并将其放置在EDTA涂层的输血管（Sarstedt）中。随后，立即用冰镇盐水灌注小鼠。然后取下大脑和脊髓，放在1毫升避光的冷PBS中。对CNS样品进行称重，然后使用注射器和缩小尺寸的针头进行均质化。用1 mL 60%三氯乙酸沉淀CNS和血液蛋白。通过离心法去除沉淀物。使用荧光多模平板阅读器测量荧光（Biotek，Synergy 4）。使用深色透明的Cornstar 96-well板，在上清液样品中测量右旋糖酐-半胱氨酸蓝（557nm激发，575nm发射）和右旋糖苷-TRITC（390nm激发，420nm发射）。中枢神经系统组织中所含染料的数量表示为同一动物血液中荧光强度的百分比，根据中枢神经系统重量进行标准化。

我们感谢Joshua A.Weiner博士和Cornelia Halin教授（苏黎世ETH苏黎世药物科学研究所）慷慨捐赠活化白细胞粘附分子（ALCAM）KO小鼠；Urban Deutsch博士负责转基因小鼠群体的管理；以及Claudia Blatti在实验性自身免疫性脑脊髓炎实验（EAE）方面的技术援助。这项研究得到了加拿大多发性硬化症协会（MSSOC）（向A.P.）和瑞士国家科学基金会133092号拨款以及ProDoc细胞迁移和瑞士MS协会（向B.E.和R.L.）的运营拨款的支持。M-。A.L.持有Que bec-Santé基金会的奖学金。C.L.、M.C.、E.G.和O.S.-L.持有MSSOC的奖学金和研究金。A.P.获得Quebec-Santé基金会高级学者奖，并担任加拿大多发性硬化症高级研究主席（一级）。