神经成像生物标记物预测血管性认知障碍小鼠模型的脑结构连接变化

摘要

血管危险因素被认为是血管性认知障碍发展的病理起点。¹有许多血管性认知功能障碍亚型，具有多种放射学特征，从微出血和腔隙性梗死到弥漫性白质高信号。白质高强度的进展是认知能力下降的高度预测因素。²当作者报告大脑灌注不足30天后胼胝体疏松和变性时，双侧颈动脉狭窄的小鼠模型引起了关注。^三一项后续研究报告称，低灌注小鼠表现出认知缺陷，特别是桡臂迷宫中的空间工作记忆损伤。⁴使用相同的模型也报告了类似的缺陷，但有一种更微妙的病理学，包括降解的髓鞘碱性蛋白的少量积累和髓鞘相关糖蛋白在几种白质结构中的分布变化。⁵另一组观察到，低灌注小鼠胼胝体中的氟髓磷脂染色消失，基质金属蛋白酶-9增加，这可以通过自由基清除剂加以预防。^6，7神经影像学是否能检测到这一范围的病理变化尚不清楚。使用扩散张量成像（DTI）在白质中观察到分数各向异性（FA）降低，⁸随着6个月的低灌注，这种情况变得更加明显。⁹尽管我们报告了其他几个定量DTI参数的变化，但我们的研究小组未能观察到低灌注小鼠的FA降低。¹⁰在我们手中，这个模型在行为和组织学上都是温和的，这可能反映了模型的内在可变性，或者啮齿动物表现出高度的恢复和补偿。因此，本研究的目的是双重的。首先，我们旨在通过改良的手术方法提高老年小鼠低灌注的严重程度，以改善表型。第二，我们的目标是识别退化的神经成像生物标记物，并将重点放在DTI数据的图论上，以预测认知衰退。

方法

实验由Landesamt für Gesundheit und Soziales批准，并根据德国动物福利法案和机构指南进行。将20只雄性C57/BL6 J小鼠（在8周龄时购得，德国查尔斯河）置于温度（22±2°C）、湿度（55±10%）和光照（12/12小时光/暗循环）受控的环境中。出乎意料的是，有1只动物因为健康状况不佳和体重大幅下降，在按照我们的动物许可随机化之前需要进行人道安乐死。其余动物随后在9至13个月龄之间随机接受低灌注（n=12）或假灌注（n=11）。将定制的非磁性外科级微线圈（内径160μm；爱尔兰利默里克Shannon Coiled Springs microcoil）缠绕在其中一条颈动脉周围，可诱导低灌注。假手术使用直径更大的微丝（500μm）进行，微丝不会收缩血管。肌肉和腺体被引导回原位，缝合伤口在恢复前使用局部麻醉剂。20小时后，对另一条颈动脉重复同样的操作。这种延迟是一种重要的改进，在使用较小的微线圈时不会导致较高的死亡率。所有的实验者都是盲人，所有的分析都是盲的。在手术前和手术后24小时以及手术后1周和4周对小鼠进行成像，以使用动脉旋转标记来估计脑血流量（CBF）。术后5-7周进行DTI、磁共振波谱和血管造影检查。新的物体识别测试在手术前1周和手术后4-5周之间进行。6周时，在Morris水迷宫中训练动物，并对组织进行免疫组织化学处理。详细方法见在线数据补充。

结果

低灌注恢复后CBF缺乏并伴有脑血管和海马退行性变

假手术组的CBF在所有时间点保持稳定，但低灌注组在手术后24小时内下降了一半以上。在1周内，低灌注组的CBF开始增加；它继续增加，但在4周时仍与假发显著不同（图​（图1A1A和​和1B，1B、 时间F（2.3，43.3）10.212的主效应；P（P）=0.0001; F（1,19）组36.977；P（P）=0.0001; 和相互作用F（2.3，43.3）10.240；P（P）=0.0001). 这表明，低灌注小鼠的大脑正在对CBF的减少进行自动调节。7周时的血管造影（图​（图1A）1A） 显示威利斯圈的折磨加剧，这可能是CBF恢复的部分原因。然而，威利斯血管环的总体大小在各组之间没有显著差异（图IA在线数据补充). 心室与大脑的比率没有显著差异（在线数据补充)，但低灌注小鼠的海马体积有所减小，尽管这没有达到显著性（图​（图1C；1C类；学生未成对t吨试验t（19）2.068；P（P）=0.053).

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图1。

脑血流（CBF）和低灌注脑的形态学变化。A类代表性CBF图和血管造影重建显示低灌注小鼠的Willis环扭曲度增加。B类假手术组（n=10）和低灌注组（n=11）的CBF随时间变化（平均值±SD）。C类两组海马体积百分比。

利用磁共振波谱测量纹状体中的代谢物浓度（图​（图2），2)，但在任何代谢物中没有显著的浓度差异（图​（图22B） ●●●●。

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图2。

脑代谢物浓度对低灌注的反应。A类，低灌注小鼠纹状体的代表性光谱。B类，假小鼠和低灌注小鼠的代谢物浓度（mmol/L）（平均值±SD）。Ala表示丙氨酸；γ-氨基丁酸；Glc、葡萄糖；谷氨酰胺；谷氨酸；GPC，甘油磷酸胆碱；谷胱甘肽；肌醇；Lac、乳酸（假[n=5]和低灌注[n=6]）；N-乙酰天冬氨酸；PCh，磷酸胆碱；还有牛磺酸。

通过弥散指数测量，低灌注脑几乎没有病理学证据，但经历了实质性的网络重组

从DTI数据中选择23个大脑区域中的7个进行分析：前连合、胼胝体和内囊，以及可能受到低灌注影响或被认为与认知能力下降有关的灰质：海马体、纹状体、扣带皮层和丘脑。FA、平均扩散率、轴向扩散率和径向扩散率值在2个白色和1个灰质结构中进行了描述（图​（图3A三A至​到3D）。三D） ●●●●。FA和轴向扩散率降低与组织退化和轴突退化相关，而平均扩散率和径向扩散率增加与组织完整性丧失和脱髓鞘相关。¹¹各组之间在任何结构上都没有显著差异，表明白质几乎没有受损。

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图3。

低灌注对弥散张量成像（DTI）指数的影响。每组2只代表性动物的定量分数各向异性（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散率（AD）和径向扩散率（RD）图（校准条对应于定量值）。A类，FA；(B类)医学博士；(C类)AD；和(D类)两组的RD（平均值±SD）。

尽管如此，低灌注小鼠的胼胝体重建似乎减少了（图​（图4）。4). 图论整合了所有DTI轨迹，并确定了网络级的变化。各组之间的总体效率没有显著差异（图​（图4A），4A） 这表明脑网络交换信息的整体能力受到灌注不足的影响最小。然而，在功能分离的几个指标上，发现了显著的群体差异。低灌注组的模块性显著降低（未配对学生t吨试验t（17）3.028；P（P）=0.014; 图​图4B），4B） ，这意味着减少了高度互联的结构子组的数量。有趣的是，低灌注组中几个较低水平的聚类参数显著较高：及物性（Student unpairedt吨试验：t（17）-4.706；P（P）=0.0007; 图​图4C），4C） ，聚类系数（Mann–WhitneyU型测试：U型=9,z（z）=−2.939;P（P）=0.007; 图IIA在线数据补充)和本地效率（学生未配对t吨试验：t（17）-3.410；P（P）=0.007；图​图4D）。4D） ●●●●。这3个参数也高度相关。传递性和聚类系数取决于三角形的存在（三组相连的大脑结构）。这反映了连接的三元组总数的增加，以及集群的普遍性，以及当删除任何给定节点时，小型子网运行能力的增强。在学位或分类方面没有发现显著差异（图IIB和IIC在线数据补充).

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图4。

图论揭示了低灌注脑的微结构网络变化。每组2只动物胼胝体的典型重建。A类，全球效率；(B类)模块化(C类)及物性，以及(D类)两组的局部效率。

将网络参数的逻辑回归模型拟合到数据中。反应变量为组分类，协变量为不同的网络参数。我们通过探索所有可能的模型来进行模型选择，并选择具有最小Akaike信息标准的1，这将惩罚具有太多参数的模型。最佳模型表明，全局和局部效率和程度可以准确地对两组小鼠进行分类。交叉验证（每次移除一只动物）表明，19只动物中仍有15只被正确分类。

在没有白质过度稀疏的情况下，在一些低灌注小鼠的海马中观察到反应性神经胶质瘤

我们没有观察到卢克索蓝染色显示白质稀疏（图​（图5）。5). 也没有证据表明白质结构中的星形细胞或小胶质细胞活性增加。然而，在2只低灌注小鼠的海马中存在一些反应性胶质增生和瘢痕。

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图5。

低灌注脑中的白质完整性和星形胶质细胞增生。每组代表性动物胼胝体的Luxol蓝、GFAP和Iba1染色组织切片（虚线勾勒出胼胝体[cc]。v表示心室。

低灌注减少了水迷宫中的空间学习，并且性能与网络分析措施相关

逃逸延迟在测试期间减少（图​（图6A，6A、 时间F（3.9,80）13.2的主要影响；P（P）=0.0001），小鼠向平台移动的距离减少（图IIIA在线数据补充; 时间F（6108）16.1的主要影响；P（P）=0.0001），表明两组都获得了范式。然而，灌注不足的小鼠表现出的逃逸潜伏期略长于假小鼠（图​（图6A，6A、 F（1,18）6.6组的主要作用；P（P）=0.01），并行驶更长距离以找到平台（组F（1,18）4.7的主要影响；P（P）=0.04），表示学习率降低。各组之间的游泳速度没有显著差异（图​（图6B，6B、 时间F（3.17,57.183）0.709无主要影响；P（P）=0.558或F（1,18）组1.049；P（P）=0.319），表明运动功能完好。在探针试验期间，在目标象限花费的时间没有显著差异（在线数据补充). 此外，在水迷宫中7天的总体表现与几个网络参数相关：度、全局和局部效率以及聚类系数（皮尔逊相关系数为0.052、0.282、0.285和0.364；P（P）=0.069).

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图6。

低灌注对空间学习和短期识别记忆的影响。A类、逃逸延迟和(B类)两组在Morris水迷宫位置任务中的游泳速度（平均值±SD）。C类，两组在术前和术后4周进行新物体识别（NOR）任务第二次试验时的辨别率（>0.5表示对新物体的探索增加）。

在新物体识别测试的第一次试验中，辨别率约为0.5，表明两组对这两个物体的探索程度相同。这既发生在手术前（0.49±0.03[假手术]和0.53±0.07[低灌注]），也发生在手术后4周（0.55±0.1[假手术]和0.59±0.1[低灌注]）。在第二次试验期间，辨别率增加（值>0.5=新物体探索更大），表明对新物体的偏向探索（图​（图6C）。6C） ●●●●。与基线相比，4周时shams的平均辨别率增加，低灌注组下降。然而，时间或小组没有显著影响（图​（图6C；6C类；F（1,17）0.0001；P（P）=0.983和F（1,17）0.5；P（P）分别=0.48）。这可能反映了随着时间的推移对测试环境的过度暴露。例如，第二次试验的歧视率在4周时差异很大（图​（图6C）6C） 因为一些动物很少探索（1只假动物没有进行探索[数据输入为缺失]）。事实上，与基线检查时（7.5±1.2[假手术]和8.2±2.6[低灌注]）相比，两组在4周时探索物体的总时间百分比下降（5.6±1.4[假手术][低灌注][和4.7±1.2[低灌注2]）。合并后，探索时间在4周时显著缩短（学生配对t吨试验t（19）4.0；P（P）=0.001).

讨论

本研究表明，在低灌注小鼠模型中，CBF随时间增加，这可能是因为威利斯环的扭曲度增加。尽管没有观察到脑萎缩（心室与大脑的比例），但低灌注小鼠的海马萎缩和2只小鼠的海马反应性星形胶质细胞增生。这与水迷宫中的空间学习障碍相结合。我们没有在具有基本组织学的低灌注动物中观察到白质稀少，尽管这并不奇怪，因为据报道，病理学更为微妙。由于图论在结构连通性数据中的应用表明，将大脑细分为具有高度互联结构的独特组的能力整体下降，再加上大脑结构簇之间的连通性增加，低灌注脑已明显重组。一些网络参数与水迷宫缺陷相关，其他参数则是预后的良好预测因素。

我们报告了CBF的下降，随着时间的推移而增加，这与我们之前的结果相当，¹⁰以及介绍该模型的文章中的发现：到30天，CBF恢复到手术前水平的10%以内。^三同样的结果也被报道，CBF在1个月时恢复到81.7%¹²低灌注后14天时达到80%。¹³之前的所有研究都使用由钢琴丝制成的直径为180微米的微线圈。我们发现该材料在植入后溶解（在线数据补充)并可以解释这些研究中报告的CBF恢复情况。然而，本研究使用了由非磁性外科级材料制成的直径较小的微线圈（160μm），该材料在实验结束时回收（在线数据补充)和使用180μm线圈时相比，低灌注组的CBF仍接近恢复（图V在线数据补充). 我们通过血管造影观察到威利斯环的扭曲度增加，这可能是CBF恢复的部分原因，因为这种侧支结构试图进行补偿。我们没有观察到威利斯圈的规模增加；因此，尽管这种现象可能在观察到的CBF增加中起到作用，但我们仍不能断定迂曲等于动脉生成。我们还通过在本研究中使用非磁性微线圈，显著减少了个体间的变异，并证实假CBF没有变化。至少在使用磁共振成像时，这种策略是必要的，因为由钢琴丝制成的磁性微线圈会干扰磁共振成像采集，从而影响CBF测量。

桡臂迷宫低灌注小鼠的空间工作记忆受损；在1之后，动物再次访问错误的数量增加^4，58个月灌注不足。¹²之前在水迷宫中没有观察到空间学习障碍，直到灌注不足延长到6个月。⁹与此相比，我们增加了低灌注的严重程度，因此可能更快地出现赤字。与普遍的假设一致，这些记忆缺陷可能是因为白质损伤。然而，也有可能是海马损伤导致了这些缺陷。在该模型中，我们观察到海马体积无明显减小，2只低灌注小鼠出现反应性星形胶质细胞增生。这与1份报告一致，该报告在最严重剥夺大脑半球（内径为160μm的微丝）的灌注不足程度不同时观察到这一现象。¹⁴其他研究组报告了低灌注后海马损伤。^12，15，16桡臂和水迷宫中的工作记忆具有很强的空间成分，对海马损伤特别敏感。我们选择新的目标识别任务来尽可能避免这种情况；这项任务需要完整的嗅周和前额叶皮质。^17，18与基线相比，4周后低灌注小鼠的新物体探索减少，但这并不显著。我们确实在4周时观察到整体探索的高度变异性（与基线相比），我们认为这是因为小鼠过度习惯于测试环境；实际上，他们在第二次曝光后花在探索物体上的时间更少。在未来，我们将避免重复接触这种测试。

在这个实验中，我们无法使用DTI指数检测到白质的变化，尽管之前有报道称在几个大脑结构中平均扩散率、径向扩散率和轴向扩散率（但FA没有变化）都有所增加。¹⁰另一组显示，1个月和6个月后，低灌注小鼠胼胝体和内囊中的FA降低，平均扩散率没有相应变化。^8，9我们的自动化分析策略可能导致了效果的缺乏。尽管花了大量精力修改地图集以反映我们的DTI数据，但较小的结构，如胼胝体，并没有始终很好地进行协同注册。此外，还进行了基本组织学检查，以观察白质的大体变化，并且，为了支持DTI指数数据，未观察到白质稀疏。很可能与白质相关的病理学太微妙，无法用DTI指数或卢克索蓝检测。事实上，在最初的研究中报告的白质稀少^三，4我们还没有复制^10，15或其他。^5，8，9后一项研究报告了一种更微妙的病理学，与白质结构中髓鞘完整性的缺氧破坏相一致。髓磷脂碎片（降解的髓磷脂碱性蛋白）少量堆积，髓磷脂相关糖蛋白染色呈不连续粒状外观。另一项研究报告称，尽管髓磷脂相关糖蛋白水平没有改变，但颗粒髓磷脂相关糖蛋白反映了细胞分布的丢失，这可能与轴突-胶质细胞相互作用的中断有关。¹⁹本研究的一个潜在局限性是，小鼠在9个洞箱中训练；虽然他们没有达到标准，但这可能是一种浓缩形式，保护他们免受更严重的低灌注过程的影响。事实上，当将较小（160μm）的微丝植入幼稚小鼠时，我们观察到了更明显的表型。

图论是一种流行的数学技术，它对大脑的复杂组织进行建模。这是一种利用神经成像技术研究人脑结构和功能连通性的新方法，并作为一种了解患病大脑的方法而越来越受欢迎。^20，21最近有一些报告对完整的啮齿动物大脑的连接体进行了检测。^22，23我们是第一批将此技术应用于小鼠大脑DTI数据的公司，也是第一批检测低灌注大脑变化的公司。全球效率是一个明确的衡量标准，反映了信息功能整合的潜力。²⁴它与连接密度密切相关，并且减少被认为是网络恶化的标志。全球效率的下降预测了小血管疾病患者痴呆的发展。²⁵虽然我们在本研究中没有观察到组间差异，但总体效率具有极强的可重复性，并且与局部效率和程度一起，能够使用logistic回归模型成功地对我们的组进行分类；因此，它是一种有价值的低灌注生物标志物。功能分离措施是指存在由高度互联的结构组成的子网络，因此假定这些结构参与专门的功能。模块化与系统的适应性密切相关，在低灌注组显著降低。这表明与众不同的子网络更少。本地效率估计本地子网与任何特定结构的连接程度。有趣的是，我们观察到低灌注组的局部效率增加，同时聚集系数和传递性增加（3个区域的较小子网络内的其他连通性度量）。据报道，小血管疾病患者也出现了类似的增加，这与认知能力呈负相关，并被解释为特定中心内组织微结构的微小变化。²⁶这项研究的结果可能反映了脑灌注不足部分的某种程度的补偿：紧密连接的结构增加了它们的连接，以应对较大功能子网络之间连接的整体下降。这种分析的一个局限性是，它高度依赖于连接的数量和密度。然而，各组之间的联系数量没有差异。低灌注小鼠缺乏萎缩也表明我们的结果具有生物学意义，尽管还没有得到充分解释。也有可能，随着这项技术越来越流行，使用更大的样本量或更多的数据，我们可以验证模型。高血压大鼠被认为是血管认知障碍的另一种动物模型，因为它表现出识别记忆缺陷和白质完整性降低，而没有明显的白质损伤。²⁷图论最近在自发性高血压大鼠中被首创，它揭示了整体和局部效率及模块化的降低。²⁸这表明，与我们在低灌注小鼠中观察到的子网络重组相反，自发性高血压大鼠的功能整合和分离总体下降。有必要进行更多使用这种分析的研究，以提高我们对不同类型病理学与网络改变之间关系的理解。还应注意的是，采集参数和后处理策略的差异，尤其是轨迹描记法，可能会产生不同的结果，这一点应始终仔细考虑。也有人建议，生成性网络模型，如指数图模型，可能是此处描述工作的有用替代方法。²⁹

我们使用老龄小鼠和增加低灌注严重程度的策略，由于观察到轻微的行为损伤，导致了更具再现性的表型。我们还成功地鉴定了几种用于该小鼠模型的新型神经成像生物标记物。准确的CBF成像可用于对各组小鼠进行分层，尤其是DTI提供了一些定量指标以及能够准确预测结果的有用网络参数。

资金来源

这项工作得到了德国研究基金会（DFG；Exc 257，NeuroCURE卓越集群）、联邦教育和研究部（BMBF；01EO0801，柏林中风研究中心）、赫尔曼和莉莉·席林基金会以及欧洲委员会（01EW1201，ERA-NET NEURON）的支持。

披露

没有。

补充材料

脚注

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