质膜上的分子吸收和内胚体货物分拣是多种细胞功能的关键事件，如信号传递、细胞-细胞连接维持、营养吸收和发育。内吞作用后，脂质和跨膜物质进入早期内体进行分选。回收或降解给定的货物分子，特别是信号分子和粘附分子的决定，是一个关键且调控良好的过程，在许多癌症中都会出错(1). 在分选内体中，在一个主要由内体外壳蛋白决定的过程中，可以通过输送到溶酶体、再循环到质膜或通过逆行分选再循环到高尔基体来选择货物进行降解。
逆转录酶是一种介导内体到高尔基体逆行循环的外壳复合体，由三聚体的空泡蛋白分选相关蛋白35（Vps35）、Vps26和Vps29（以前称为CSC）组成(2–4). 在酵母中，逆转录酶与分选连接蛋白（SNX）Vps5p/17p异二聚体紧密相关，但在其他生物体中，这种联系更为脆弱(5–9). 在秀丽隐杆线虫，SNX-1/SNX-6专性异二聚体似乎是与Vps5p/Vps17p关系最密切的SNX复合物(10,11). SNX-1和SNX-6包含脂质结合phox同源性（PX）和BAR结构域。Snx1 PX结构域结合早期内体脂质磷脂酰肌醇-3-磷酸[PI（3）P]，其BAR结构域能够识别膜弯曲并在体外诱导膜小管的形成(12,13). 对于许多依赖逆转录酶的回收货物，SNX-BAR产生的小管被认为是从内体运输到高尔基体的活性载体(14,15).
与SNX-1或逆转录酶组分的丢失类似，SNX-1结合伙伴RME-8的丢失会导致依赖逆转录酶的货物的错误分类(16–19). RME-8是蜗牛DNA AJ（J结构域）蛋白家族的成员，定位并激活Hsc70家族伴侣的ATP酶活性(19,20). 这种伴侣活性促进蛋白质复合物的组装和/或拆卸(20). 例如，J域蛋白辅助蛋白需要在新生的内吞囊泡从质膜释放后不久将其分解(21,22). 在秀丽隐杆线虫,果蝇属和哺乳动物一样，RME-8的缺失导致氯氰菊酯在内膜上积聚(16,17,23). 在哺乳动物细胞中，RME-8也被发现与WASH肌动蛋白成核复合体有关，RME-9缺失的细胞在装饰有Vps35和Vps26的膜小管上积累Snx1(16,17,24). 在秀丽隐杆线虫肠，rme-8型突变体在积累SNX-1的相同内体上积累氯氰菊酯(16). 内切体上的逆转录酶和网格蛋白之间的关系尚不清楚，可能涉及逆转录酶与内切体中介导货物降解的成分之间的调节，即运输所需的内切体分选复合物（ESCRT）。
未回收的跨膜货物被降解，这一过程由一系列ESCRT复合物（ESCRT-0，-I，-II，-III；参考文献中进行了综述。25–27). ESCRT-0由Hrs和STAM组成，是第一个通过每个蛋白质中包含的泛素相互作用基序识别降解产物的复合物(28–32). Hrs还包含一个关键的FYVE结构域，与Snx1的PX结构域一样，它识别磷脂PI（3）P并帮助将复合物靶向早期内体(33).
逆转录酶和ESCRT被认为至少有一部分寿命与同一内体的细胞质表面结合。Sönnichsen等人的早期工作表明，内体可以包含基本上不重叠的微结构域，每个微结构域都由不同的Rab-GTPase（Rab5、Rab4和Rab11）标记，这导致了这样一种观点，即内体膜是由物理上不同的功能域组成的镶嵌体(34). 将这一观点推广到降解机制，Raiborg及其同事使用GTPase缺陷的Rab5表达来放大内体，表明Hrs和网格蛋白一起形成了一个与EEA-1分离的独特ESCRT微结构域(32,33,35). 对这些研究的一个警告是，GTPase缺陷Rab5的表达，用于扩增内体，明显损害了内体的功能(36–38). 随后，我们和其他人提出，SNX-1与RME-8的相互作用可能对从富含ESCRT-0的结构域中分离富含逆转录酶的微结构域很重要(16,17). 这是一个很有吸引力的模型，因为具有相反功能的微结构域之间的调节对于维持内体再循环和降解之间所需的平衡非常重要。
因此，我们试图在体内测试逆转录酶和ESCRT-0微域之间的这种调节。我们利用自然非常大的（1-5）µm） 内胚体秀丽隐杆线虫体腔细胞直接显示降解和逆行分选机制之间的相互作用。我们发现，在体内，与逆转录酶相关的SNX-1和RME-8不仅从肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HGRS-1）中分离出不同的微域，而且对限制降解微域和维持对立功能微域的分离也很重要。我们通过活细胞成像和细胞分馏证明，在没有SNX-1和RME-8的情况下，HGRS-1在内膜上过度累积。我们还表明，人类SNX-1同源物（SNX1和SNX2）的丢失在HeLa细胞中产生了类似的效果，表明这种微域相互作用的进化保守性。
结果
秀丽隐杆线虫体腔细胞执行SNX-1–和RME-8–依赖性再循环。
要验证秀丽隐杆线虫体腔细胞作为逆行循环的模型，我们使用snx-1型发起人。该启动子广泛表达，但在体腔细胞中表达最强烈。然后，我们在野生型体腔细胞中成像每个GFP标记货物的稳态亚细胞定位，并分析snx-1型和rme-8型突变体。这些货物包括秀丽隐杆线虫MIG-14/Wls、人类CI-MPR和秀丽隐杆线虫TGN-38型().
SNX-1和RME-8对于秀丽隐杆线虫体腔细胞。在野生型中可见体腔细胞中表达的MIG-14:：GFP，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变背景。MIG-14标记内体、内点和质膜。请注意，在插入(A类–A类′′). 由GFP、人CD4-GFP细胞外结构域的一部分以及人CIMPR的细胞质和跨膜结构域组成的杂交模型逆转录酶货物的荧光显微照片，在野生型中表达，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)体腔细胞突变。hCIMPR-CD4-GFP标记内体、内点，在较小程度上标记体腔细胞质膜。请注意，在插入(B类–B类′′).秀丽隐杆线虫TGN38/46同源物TGN-38:：GFP在野生型体腔细胞中表达，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变体。TGN-38:：GFP对内体的标记不均匀，对内点的标记强烈，对质膜的标记较弱(C类–C类′′). （比例尺：5µm）在相同的图像采集条件下，野生型与突变型背景下每种货物的平均强度的量化(D类和E类). MIG-14、hCIMPR和TGN-38与高尔基体标记AMAN-2共表达。Puncta（小箭头）与高尔基体标记AMAN-2:：RFP共定位（大箭头表示高尔基体与货物标记的内体相邻）(F类–H（H）′′). (我)三种货物结构的图示。所有实验均在25°C下进行。
在体腔细胞中表达的逆行货物MIG-14-GFP标记了质膜、内体和高尔基体(). 我们注意到，MIG-14-GFP在大型环状内胚体周围的分布通常不均匀，表明内胚体亚结构域富集(,插图). 虽然体腔细胞有大而圆的内胚体，但其高尔基体表现为分散的点状结构（即微突起），这是无脊椎动物细胞的典型特征。MIG-14可能富集于高尔基体的不同亚区，而不是甘露糖苷酶AMAN-2，因为它通常与AMAN-2突起相邻而不是直接重叠() (39,40).
我们将CI-MPR贩运报告基因表达为一种嵌合蛋白，该嵌合蛋白由人CI-MPRs的细胞内和跨膜结构域与人CD4、GFP的细胞外部分和分泌信号序列融合而成(). 这类似于哺乳动物培养细胞中使用的CI-MPR-GFP嵌合体，该嵌合体以类似内源性CI-MPR的逆转录酶依赖性方式运输，也类似于先前在秀丽隐杆线虫(41,42). 哺乳动物细胞中的CI-MPR-GFP定位于质膜、内胚体、离开内胚体的Snx1修饰小管和高尔基体(4,12). 与MIG-14-GFP类似，我们发现hCI-MPR-GFP在标记体腔细胞质膜、体腔细胞典型的大环状内体和高尔基点状体的蠕虫中表达().
TGN-38在体腔细胞中表达，最显著的标记是高尔基点状细胞，在较小程度上是内胚体，类似于蠕虫肠道和其他生物体中的报道(43,44) (). 总之，这三种融合蛋白的定位模式秀丽隐杆线虫体腔细胞与回收逆转录物货物的预期一致。然而，重要的是秀丽隐杆线虫体腔细胞使标记的货物分子具有异常清晰的空间细节。
鉴于RME-8和SNX-1在货物逆行运输中的既定作用秀丽隐杆线虫在肠道和培养的哺乳动物细胞中，我们分析了snx-1型和rme-8型体腔细胞中所有三种逆行货物上的突变体。以前在中的工作秀丽隐杆线虫,果蝇属，哺乳动物细胞显示，当逆向循环途径被阻断时，MIG-14/Wls家族蛋白被错误地传递到晚期内体，并在溶酶体中降解(7,16,44–49). 哺乳动物细胞中的CI-MPR在逆转录酶缺失后也表现出类似的溶酶体错配(4,12,50). 哺乳动物Tgn38和秀丽隐杆线虫然而，当逆行循环受阻时，TGN-38在内胚体中积累(44,51,52).
为了测试这种细胞类型中逆行循环需求的保守性，我们分析了在循环突变背景中货物定位和强度的变化。为了均匀性，所有实验均在25°C下进行rme-8型(ts秒)突变体，除非另有说明。与其他细胞类型一致，我们发现snx-1型和rme-8型突变体、MIG-14-GFP和CI-MPR-GFP的总水平降低，TGN-38水平升高(). MIG-14-GFP水平降低snx-1型体腔细胞突变可能是由于ESCRT-0组分HGRS-1的缺失将MIG-14-GFP恢复到高水平而导致ESCRT途径的错误定位所致().
hCI-MPR标签野生型高尔基(A类和A类“”）和snx-1型(tm847（tm847）) (B类和B类''）突变体。大箭头表示内胚局部的hCI-MPR，在snx-1型(tm847（tm847）)突变体。小箭头表示hCI-MPR与高尔基体标记AMAN-2共定位，该标记存在于野生型和snx-1（tm847)突变体。TGN-38 GFP面板以较低比例表示，以显示捕获TGN-38的形态结构rme-8型(1023吨)和snx-1型(tm847（tm847）)突变体(C类–C类′′). MIG-14-GFP水平在snx-1型(tm847（tm847）)HGRS-1缺失突变体。表达MIG-14 GFP野生型的体腔细胞(D类和D类'）或snx-1型(tm847（tm847）) (E类和E类′）用载体处理后(D类和E类)或HGRS-1 RNAi(D类'和E类′). (F类)MIG-14 GFP水平的量化D类–E类′. （比例尺：5µm）
我们还注意到，在snx-1型突变体定位于高尔基体，可能代表新合成的hCI-MPR-GFP或残余逆行循环。内体中hCI-MPR的丢失意味着到达内体的货物路线错误且降解().
综上所述，这些结果表明，不同种类的逆行货物在秀丽隐杆线虫体腔细胞的回收方式与之前在其他秀丽隐杆线虫细胞类型和其他生物(16,44,50,52,53). 我们得出结论，体腔细胞是研究逆行贩运的有效体内模型。
HGRS-1定位于逆转录酶相关蛋白的不同内体微区。
长期以来，人们一直假设普通内体的限制膜上不同功能域的分离(32,34,54). 先前描述的分子相互作用表明，逆转录酶相关蛋白SNX-1和RME-8可能调节ESCRT，以维持内体内循环和降解功能的平衡(16–19,23,55). 为了更直接地探索这一想法，我们利用体腔细胞的天然非常大的内体，直接可视化RME-8/SNX-1和ESCRT-0组分HGRS-1/Hrs的空间关系。
我们使用表达荧光标记HGRS-1（Hrs）的低拷贝数转基因标记降解ESCRT结构域，并以等效荧光标记SNX-1和RME-8为代表标记逆行循环结构域。在对体腔细胞进行的双标记实验中，结合对单个内胚体限制膜的线扫描，我们分析了逆转录酶和ESCRT结构域的关系。我们观察到HGRS-1定位于早期内体的不同区域，通常位于内体面向细胞内部的一侧(和). 结合伙伴RME-8和SNX-1在HGRS-1缺失的区域富集，通常在朝向细胞表面的内体区域富集(). 此外，我们发现VPS-35（一种核心逆转录酶蛋白）和HGRS-1之间存在类似的空间关系，这两种蛋白定位于共同内体上的不同区域(′′). 与它在支架降解结构域中的既定作用一致，网格蛋白与体腔细胞中的HGRS-1微结构域广泛共定位(′′). 这些数据表明，在共同的内体上，功能不同的蛋白质存在物理上不同的微域。
逆转录酶相关蛋白RME-8和SNX-1特异性标记与ESCRT-0蛋白HGRS-1互补的内体微结构域。图片显示了表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的完整活动物体内的体腔细胞，这些细胞被允许从体腔摄取Cy5-BSA 10分钟(A类–A类′′). 显示一个内体周围像素强度的线扫描（如A〃所示，插入)显示HGRS-1和SNX-1在Cy5-BSA填充的内体上的互补定位(A类′′′). 柠檬酸：：RME-8和tagRFP:：HGRS-1标记不同的微域(B类–B类′′). 内体限制膜的线扫描(B类′′,插入)表示HGRS-1和RME-8的互补本地化(B类′′′). 用GFP标记的内源性VPS-35微域与柠檬酸不同：：HGRS-1(C类–C类′′). 内体行扫描C类′′,插入(C类′′′). Citrine:：HGRS-1和CLIC-1:：tagRFP在内体上的离散微结构域中共定位(D类–D类′′). 内体行扫描D类′′,插入(D类′′′). （比例尺：5µm）相关线扫描右侧内胚体成分定位的图示(E类). (F类)内体成分共定位的量化A类–D类.
HGRS-1和SNX-1微区在相关货物中富集。(A类–A类′′）MIG-14:：tagRFP（伪绿色）沿内胚体外围的强度峰值与GFP:：SNX-1（伪红色）一致。(A类〃′）内吞体周围的双色线扫描(A类′′,插入). (B类–B类′′）MIG-14:：GFP和tagRFP:：HGRS-1显示互补微区富集。(B类〃′）内吞体周围的双色线扫描(B类′′,插入). (C类–C类摄入5分钟后，Cy3-BSA富含柠檬酸：HGRS-1标记的微域。(C类〃′）内吞体周围的双色线扫描(C类′′,插入). （比例尺：5µm）(D类)面板的图示显示在右侧。(E类)相关货物和内体成分共同定位的量化A类–C类.
HGRS-1和SNX-1定位代表内切体上的功能相关域。
接下来，我们研究了内体上空间上不同的结构域是否与相关货物相关。如果这些域对货物分拣具有重要功能，我们预计逆行货物会在SNX-1/RME-8标记域中富集，但不会在HGRS-1标记域中。事实上，我们观察到内体上SNX-1的强度峰值与MIG-14的强度峰值共存(′;用于图示）。正如预期的那样，回收货物MIG-14的峰值与ESCRT成分HGRS-1的峰值呈负相关(′′).
如果这些域在功能上相关，我们还希望降解绑定货物与降解机器协同定位。为了观察从早期内体到晚期内体和溶酶体的降解运输，我们跟踪了BSA的摄取。注入假体腔的荧光标记BSA被体腔细胞主动内吞，可能通过清道夫受体。然后，BSA通过RME-8-GFP标记的内体到达溶酶体(19,56). 注入蠕虫假体腔后，标记的BSA在5分钟内出现在体腔细胞内体中，随后很快集中在早期内体中的离散亚区，然后在注射后约20分钟出现在晚期内体中(19,57–59). 与标记功能降解域的HGRS-1一致，我们观察到从假体腔摄取后5分钟，HGRS-1和降解结合的Cy5-BSA之间存在稳定的共定位(′′). 这些数据表明，SNX-1和HGRS-1标记的互补域代表功能和动态排序域。
SNX-1和RME-8限制降解域。
考虑到J结构域蛋白在蛋白质复合物分解中的作用，我们假设SNX-1可能通过RME-8和Hsc70来限制ESCRT亚结构域的生长(20). 如果SNX-1和RME-8确实限制了降解性ESCRT亚结构域的组装，我们预计HGRS-1在没有SNX-1或RME-8的情况下会在内体上过度累积。为了验证这一假设，我们用三种不同的方法测量了HGRS-1在内切体上的积累：YFP:：HGRS-1对内切体限制膜的覆盖率，YFP::HGRS-2的荧光强度，以及内源性HGRS-1秀丽隐杆线虫通过分级测定的裂解物().
HGRS-1内体占位由SNX-1、SNX-6和RME-8控制。(A类–A类''和B类–B类′′）在野生型和snx-1型突变背景。野生型和snx-1型突变株(C类). 裂解和超速离心后，通过Western blot测定内源性HGRS-1的膜结合，以从野生型细胞液中分离膜，snx-1型(tm847（tm847）)、和rme-8型(第1023页)突变菌株。分数显示在车道上方。在每条车道上装载等效样本。100P与上清液的比率和18P与上清的比率显示在这两个部分下面。在rme-8型和snx-1型突变体中，18P和100P组分比野生型含有更多的HGRS-1。RME-2是一种跨膜卵黄受体，仅与膜组分分离(D类). (E类–K（K）)黄嘌呤：HGRS-1野生型图像，snx-1型(tm847（tm847）),snx-6型(tm3790型),rme-8型(第1023页),snx-3型(tm1595型)、和vps-35版(胡68)在25°C下具有相同暴露和缩放条件的突变菌株。(L（左）)野生型和突变背景中黄嘌呤的定量：HGRS-1强度。（比例尺：5µm）
通过使用差示干涉对比（DIC）显微镜帮助定义内体边界，并使用盲法系统，我们对YFP:：HGRS-1占据的内体百分比进行了评分。我们发现HGRS-1在snx-1型(tm847（tm847）)缺失突变体(). 此外，我们发现YFP:：HGRS-1在snx-1型(tm847（tm847）)和rme-8型(1028吨)突变体(，以量化)，但总YFP:：HGRS-1蛋白水平没有增加()，表示HGRS-1在膜上的组装程度更高snx-1型和rme-8型突变体。此外，SNX-6（一种专性SNX-1结合伙伴）的缺失也导致了HGRS-1在内体上的类似积累().
HGRS-1强度不受SNX-1或RME-8过度表达的影响，总蛋白水平在snx-1型和snx-3型突变体。仅表达柠檬酸：：HGRS-1的体腔细胞(A类)或在SNX-1:：tagRFP或tagRFP:：RME-8在场的情况下(B类和C类). (D类)柠檬酸水平：HGRS-1来自A类–C类量化。野生型RME-8与柠檬酸和tagRFP标记的转基因的水平测量。肌动蛋白被用作加载控件(E类). 野生型表达GFP:HGRS-1的动物，snx-1型、和snx-3型对突变体进行裂解，在SDS/PAGE上运行，并探测GFP。肌动蛋白被用作加载控件(F类). (G公司)量化F类（比例尺：5µm）
为了测试对内源性HGRS-1的影响，我们将秀丽隐杆线虫通过超速离心将其分解为细胞质和膜组分。在18000×克[18,000 ×克含有较大膜结构的颗粒（18P），其次是100000×克[100,000 ×克颗粒（100P）]含有较小的剩余膜，最后剩下100000×克含有可溶性细胞质的上清液（100S）。我们通过Western blot比较颗粒组分和细胞质组分中内源性HGRS-1的相对含量，使用跨膜受体RME-2作为膜分离到颗粒组分的保真度的测量。在snx-1型和rme-8型突变体，在小（100P）和大膜（18P）级分中发现的HGRS-1与在胞质级分中发现的HGRS-1的比率与野生型对照相比增加。颗粒/细胞质HGRS-1的比率记录在18P和100P组分以下综上所述，我们的结果表明SNX-1、SNX-6和RME-8在限制HGRS-1在早期内体上的组装方面起着重要作用。
SNX-1和RME-8功能的丧失对HGRS-1细胞膜积累的强烈影响并不是相互作用的。RNAi敲除HGRS-1后，RME-8:：GFP内体结合没有改变，仅导致内体定位SNX-1:：GFP略有增加(). YFP:：HGRS-1表达菌株中的RNAi证实了HGRS-1在体腔细胞中的敲除效率(). 与在没有SNX-1或RME-8的情况下HGRS-1在内体上的积累不同，情况并非如此。我们分析了RME-8或SNX-1表达增加对HGRS-1内体结合的影响，但没有发现显著影响(). 这些结果表明SNX-1/RME-8与ESCRT的相互作用可能在功能活动水平上受到调节，并支持这些可视化域在功能上相关的观点。
HGRS-1对限制RME-8或SNX-1内体结构域并不重要。用空载体RNAi对照处理表达GFP:：SNX-1的菌株(A类)或hgrs-1型RNA干扰(A类′). 表达GFP:：RME-8的菌株经空载体RNAi对照处理(B类)或hgrs-1型RNA干扰(B类′). 用空载体RNAi对照处理表达GFP:：HGRS-1的菌株(C类)或hgrs-1型RNA干扰(C类′). 在对照组和对照组中定量了GFP:：SNX-1、GFP:。hgrs-1型RNA干扰(D类). （比例尺：5μm）
SNX-1/RME-8保持不同微区的分离。
接下来，我们试图确定在没有SNX-1或RME-8的情况下，逆行结构域和降解结构域是否保持分离。在表达YFP:：HGRS-1和tagRFP:：RME-8的菌株中，我们观察到在snx-1型突变，通过共定位分析和沿内体周长的线扫描测量(、和;用于图示）。同样，我们发现SNX-1和HGRS-1的分离在rme-8型(1028吨)突变体(). 综上所述，这些结果表明，功能性RME-8和SNX-1是维持内体上独立结构域所必需的。
RME-8和SNX-1控制微区分离。表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：RME-8的菌株显示互补微域(A类–A类′′′). (B类–B类′′′)snx-1型(tm847（tm847）)表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：RME-8的突变体显示出正常分离域的重叠增加。(C类–C类“”“）表达tagRFP:：HGRS-1（假绿色）和GFP:：RME-8（DNAJ-HPD-AAA）（假红色）的体腔细胞显示正常分离区域的重叠增加，以及内体成分HGRS-1和RME-8的形态学改变。(D类–D类“”）野生型体腔细胞中的柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1显示互补的微域定位。(E类–E类′′′)rme-8型(第1023页)表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的突变体腔细胞在温度变化后18小时显示出正常分离区域的重叠增加。(F类–F类“”）在温度变化后30小时，内体不再可识别，柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1显示正常分离结构域的重叠增加。(G公司–G公司“”）表达柠檬酸：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的菌株snx-3型(tm1595型)蠕虫显示野生型互补定位。(H（H）)内胚体微结构域的重叠被量化。(我)左侧面板内体微域定位的图示。（比例尺：5µm）
作为第1023页的等位基因rme-8型HGRS-1对温度敏感，其积累模式因在限制温度下花费的时间而异(). 然而，这并不影响SNX-1和HGRS-1之间重叠的程度(). 在限制温度下18–24小时后，HGRS-1在内体周长周围均匀堆积；然而，30小时后，HGRS-1在内体上以不规则的模式积聚（比较与。). 这种不规则的HGRS-1定位米-8 ts突变体与表达RME-8的菌株的定位惊人地相似，在该菌株中，我们将DNAJ结构域催化氨基酸HPD（氨基酸1353-1355）突变为AAA（比较与。) (60–62). 我们发现，体腔细胞中DNAJ突变的表达增加了正常分离的HGRS-1和RME-8结构域之间的重叠()并模拟了温度变化中后期时间点的内胚体形态ts秒等位基因rme-8型(). 这些结果表明，RME-8作为一种J结构域同系物对Hsc70的催化活性对RME-8在微结构域分离中的作用至关重要。
由于内体扁平网格是一个潜在的RME-8靶点，已被提议与ESCRT-0结合并组织ESCRT结构域，因此我们还分析了网格蛋白重链的温度敏感突变体中微结构域分离的变化(54,63–65). 我们发现tagRFP-SNX-1和柠檬烯-HGRS-1在甲烷-1(1025吨)限制温度下的突变体，与氯氰菊酯在维持微区分离中的作用一致().
当体腔细胞中没有RME-8时，网格蛋白会积聚，网格蛋白的丢失会破坏微区分离。表达柠檬碱：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的菌株显示互补微域(A类–A类′′′).甲烷-1(1025吨)表达黄嘌呤：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1的突变体在夜间转移到非允许温度，显示出正常分离域的重叠增加(B类–B类′′′). 黄嘌呤：：HGRS-1和tagRFP:：SNX-1重叠的量化甲烷-1(1025吨)突变背景(C类). 氯菊酯轻链（Clic-1）：：tagRFP以野生型和rme-8型(第1023页)具有相同暴露和缩放条件的突变菌株在指定时间内转移到25°C(D类–D类′′). 野生型和突变背景中CLIC-1:：tagRFP的量化(E类). （比例尺：5µm）
并非所有逆转录酶相关蛋白对结构域维护都很重要。
逆转录蛋白VPS-35/Vps35和逆转录相关蛋白SNX-3/Snx3是许多不同生物逆行循环的关键成分。在秀丽隐杆线虫已发现，SNX-3和VPS-35调节逆行货物MIG-14、I型TGF-β受体SMA-6和TGN-38的正确分类(7,44,66). 我们的上述结果表明，逆转录酶相关蛋白RME-8和SNX-1限制了HGRS-1降解结构域的大小，我们还研究了VPS-35和SNX-3在维持降解结构域中的作用。我们发现HGRS-1在内胚体周围的分布在假定的空突变体中没有改变vps-35版和snx-3型与野生型相比(). 此外，我们发现snx-3型突变体显示YFP-HGRS-1和tagRFP-SNX-1结构域正常分离(). 这些结果表明，只有一个逆转录酶相关蛋白亚群有助于维持内体上空间上不同的结构域。
人SNX-BAR蛋白质Snx1和Snx2对微区分离很重要。
为了检测SNX-1家族蛋白在限制内体内ESCRT-0结构域中的保守性，我们在HeLa细胞中使用siRNAs来敲低人类SNX-1同源物Snx1和Snx2的表达，通过免疫荧光检测对内源性Hrs和RME-8定位的影响(53). HeLa细胞中的内切体比体腔细胞中的小，因此这些内切体上的结构域通常表现为肩部定位() (67). 如果需要SNX1和SNX2来保持RME-8和Hrs微结构域的分离，我们预计siRNA去除SNX1和SNX2将导致Hrs和RME-8在内体上的共定位增加。虽然远离细胞核的内体似乎没有改变，但在Snx1/2缺失后，我们经常观察到靠近细胞核的内体内RME-8和Hrs的重叠较大(和). 鉴于高尔基体是核周结构，这种内体可能是内体到高尔基体运输中最活跃的内体之一。
SNX-1在HeLa细胞微区分离中的作用是保守的。内源性Hrs和RME-8的共焦显微镜显示，在对照细胞的核周区域存在肩对肩定位。箭头表示Hrs和RME-8免疫染色并列(A类–A类′′′). 在SNX1/2 siRNA条件下，RME-8和Hrs标记的结构域在核周区的放大结构中共存。箭头表示扩大的内体对共定位RME-8和Hrs呈阳性(B类–B类′′′). d风暴(C类′–H（H）′）与外荧光(C类–H（H）)用对照干扰siRNA转染内源性Hrs和RME-8的图像(C类–E类和C类′–E类′）和SNX1/2 siRNA(F类–H（H）和F类′–H（H）′). 箭头表示RME-8和小时，它们是接近的和/或同位的。SNX1/2 siRNA显著增加了Hrs和RME-8相互作用的最近邻分析强度(我). 线扫描的量化如所示E类′ (J型)和H（H）′ (K（K）).
针对Snx1或Snx2探针的HeLa细胞裂解物的Western blot表明有效的敲除。
为了进一步研究超出衍射极限的Hrs和RME-8标记区域的性质，使用传统荧光团对免疫荧光样品进行了直接随机光学重建显微镜（dSTORM）(68). 由于STORM数据中的图像代表单个分子位置和定位不确定性的重建，因此图像中信号的重叠并不是确定分子是否共定位的最佳方法。相反，我们使用最近邻分析，通过使用“强度”度量来确定每个点源与其最近邻的距离(69,70). 支持微畴混合假说，我们发现，在Snx1/2耗尽后，RME-8和Hrs之间的相互作用强度显著增加[3.33(n个=3），而1.13(n个=3）用于控制；P（P）< 0.02,t吨测试；). 这些结果表明，在Snx1/2基因敲除后，Hrs和RME-8之间的距离更近，表明Snx11/2在防止内切体逆行结构域和降解结构域的混合中起着保守的作用。
讨论
越来越多的证据表明，内体是由跨膜物质、脂类和外周膜蛋白组成的功能域镶嵌体(71). 这些结构域是分离的，但又是动态的，随着时间和空间的变化而变化，即随着内体的成熟，其结构和功能发生变化。例如，来自早期/分选内体液泡区的不同小管含有不同的Rab、SNX，因此不同的货物会被运送到不同的目的地(34,71–73). 除了不同涂层的小管外，我们对空泡区结构域分离的理解也在发展。一种提议的内体微域类型围绕内体扁平网格旋转，最初在30多年前通过细胞免疫荧光被描述为斑块，后来通过免疫电镜发现含有Hrs、STAM和货运蛋白（参考文献。32,35,74–76; 参考文献中审查。77). 最近的研究表明，该结构域通过ESCRT-0组分Hrs的支架作用参与跨膜货物降解，而Hrs反过来又集中了泛素货物(32,35,78–80).
内体微区研究系统的开发。
免疫电镜分析是揭示贩运机械内吞体下定位的关键，但受样品固定引起的伪影和敏感性问题的限制(77). 光学显微镜通常不能提供足够的分辨率来研究微结构域之间的相互作用，除非通过人工手段扩大内体，这也会损害内体的功能。此外，高分辨率显微镜通常使用破坏组织的强大光源(81,82). 在这里，我们开发了一种系统，可以在活体、完整的动物体内直接观察逆转录酶和ESCRT-0微结构域，利用高内吞活性体腔细胞的天然大内体秀丽隐杆线虫。我们证明秀丽隐杆线虫体腔细胞在逆行循环中非常活跃，并且在逆转录酶相关循环和ESCRT相关降解结构域中表现出显著的空间分离。此外，我们发现SNX-1和RME-8限制了降解域并将其与逆行域分离，从而深入了解了支持稳健和平衡货物分拣的机制。最有可能的是，与ESCRT-0同时存在其他微域，该系统为未来的研究提供了一个强大的平台。
RME-8/SNX-1的特定角色。
我们确定的微结构域似乎代表了功能结构，因为它们在适当的回收或降解物中富集，它们的正确分离取决于逆转录酶相关蛋白SNX-1、SNX-6和RME-8，以及RME-8 J-结构域的完整性(和). 在缺乏这些逆转录酶相关蛋白的情况下，HGRS-1结构域在内胚体周围扩散，更多的HGRS-1从细胞质募集到膜上，而去除HGRS-2对SNX-1或RME-8在内胚体内的分布影响最小(). 然而，限制降解分拣区的作用并不是由所有逆行分拣组件共同承担的，因为VPS-35和SNX-3不影响HGRS-1区，尽管需要进行适当的货物回收，并且与VPS-35一样，显示互补的微区定位(和). 此外，SNX-3丢失后，微区分离也不会受到干扰，进一步证明多种机制有助于正确的货物分拣(). 当SNX-1或RME-8不存在，或者RME-8 DNAJ结构域发生突变时，微结构域混合。有趣的是，混合并不完全，这表明存在其他机制来保持域分离。
RME-8/SNX-1与降解域的比较。
先前的研究表明，在没有SNX-1、RME-8或Hsc70/HSP-1的情况下，氯氰菊酯的动态性较差，并在内体上积累。此外，如果没有这些组件，逆行货物MIG-14、StxB和CI-MPR的分拣就会中断(16,17). 体腔细胞中也存在膜相关的网格蛋白过度积累(),果蝇属RME-8缺失后哺乳动物细胞，提示氯氰菊酯可能是直接靶点(83–85). 除了有助于识别降解货物外，Hrs还将氯氰菊酯招募到内体中，而氯氰菊酯被提议用于支架ESCRT和降解货物，这一功能可能有助于定义降解亚结构域(32,54,78,86). 此外，我们的数据表明，功能性氯氰菊酯的减少也会导致正常分离的HGRS-1和SNX-1微区的混合(). 氯氰菊酯的损失和积累与微结构域维护缺陷相关，这表明内体氯氰菊酯在指导竞争复合物的正确位置和组装程度方面具有指导意义。
此外，果蝇属已知哺乳动物Snx1蛋白在体内和体外与Hrs结合，Hrs也被报道与逆转录体成分Vps35相互作用(17,55). 因此，逆转录聚合酶和ESCRT之间的直接相互作用也可能在我们观察到的调节相互作用中发挥作用。这些相互作用可能发生在内体的液泡区，而不是小管。尽管SNX-1具有良好的膜微管化活性，但在小管上未发现其结合伙伴RME-8。这些结果与SNX-1和RME-8共同作用于内体的液泡区以限制降解微域的想法一致。
我们还注意到，HGRS-1不仅过度累积，而且在RME-8 DNAJ结构域发生突变或在延长时间后似乎也会聚集rme-8型(ts秒)限制温度下的突变体(和). 高尔基体微突起通常与体腔细胞内体相邻，而体腔细胞中的内体非常大()，可能缩短内体到高尔基体的运输距离，并使逆转录体小管的可视化变得困难。因此，体腔细胞中RME-8功能长期受到干扰后的聚集形态可能类似于哺乳动物细胞中观察到的异位小管形成。在RME-8耗尽后，可以观察到分选成分的积累，如WASH和FAM21，以及Snx1和逆行货物装饰内胚小管(17,24,87). 这可能表示通过氯氰菊酯和ESCRT产生的间接影响，也可能表示RME-8刺激的Hsc70伴侣蛋白在内体上的活性的其他直接靶点，如Freeman等人(24).
我们的数据表明，逆转录酶交叉调节ESCRT，以维持给定内体内每种活性的适当平衡。ESCRT和逆转录酶途径驱动相反的内体功能，这些功能必须以某种方式共存；因此，了解内体上ESCRT和逆转录酶结构域的分离可能与了解内体功能特别相关。我们认为，逆转录酶相关蛋白和ESCRT之间的拮抗关系对于维持内体内反向分选活动的平衡非常重要。这些活动对于重新平衡诸如货物载荷分布变化和细胞生理学变化等活动以跟上细胞环境的步伐可能特别重要。
SI材料和方法
RNA干扰。
通过喂食法进行RNAi(89). 喂食构造来自Ahringer库(90)或通过PCR从小原幸二（日本三岛国立遗传研究所）提供的EST克隆制备，然后亚克隆到RNAi载体L4440(89). 同步化蠕虫在15°C的RNAi平板上孵化，直到F1处于L2/L3阶段，然后在指定的时间内移动到25°C并成像。
HeLa细胞培养和转染。
HeLa细胞与含有丙酮酸钠和我-37°C和5%（vol/vol）CO条件下添加10%（vol/vol）FBS的谷氨酰胺2使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）对HeLa细胞进行瞬时转染。将SNX1（M-017518；Dharmacon/Invitrogen）和SNX2（M-07520）的SMARTpool siRNA寡核苷酸（100 pmol）转染HeLa细胞两次，间隔24小时。转染后，在收获用于生化分析之前，将细胞再培养1天。在BCA分析后，在每次应用抗体之间剥离后，将等量的蛋白质（20μg）通过4–12%（wt/vol）的Bis-Tris PAGE在相同的膜上进行连续的蛋白质印迹。
HeLa细胞的共焦成像。
为了进行免疫染色，用4%（wt/vol）多聚甲醛在室温（RT）下固定培养细胞20分钟，用PBS溶液洗涤三次，每次5分钟，然后在0.4%皂苷（编号S4521；Sigma）、5%（vol/vol）正常山羊血清（编号G9023；Sigma-）和2%（wt/vol）BSA（编号A2153；Sigma-PBS）的PBS溶液中培养1小时。固定培养物与一级抗体在PBS溶液中与2%（wt/vol）BSA和0.4%皂苷在4℃孵育过夜。细胞在RT下用PBS溶液清洗四次，每次5分钟，用二级荧光抗体（Invitrogen）在含有2%（wt/vol）BSA和0.4%皂苷的PBS溶液中以1:400稀释培养30分钟，用PBS液重新冲洗，然后用Fluoro-Gel防褪色贴装介质（EMS）贴装以进行成像。使用Olympus FV1000油浸式60×物镜（1.3 N.A.）和顺序采集设置获得共焦图像。从标本的顶部到底部取了八到十个截面，并做出了最亮的点投影。
STORM/PALM成像。
STORM/PALM设置在奥林巴斯IX73上，LED激发光源包含405-nm、470-nm和590-nm激发波长。使用Andor Zyla 4.2 sCMOS相机，使用奥林巴斯60×1.3 N.A.UPlanSApo物镜获取512×512像素图像。发射光路径中包含一个旋转圆盘，以阻挡聚焦光并保留来自单个光学平面的荧光。使用红外焦点锁定系统（零漂移校正）确保z（z）轴。通过使用ImageJ的StackReg插件的平移设置，使用软件校正图像中的XY漂移。使用50nm荧光珠测定系统的分辨率。作为分辨率测量，在～20 nm处测量单珠的全平均值和半平均值。
将样品安装在含有[50 mM Tris®碱、pH 8.0、10 mM NaCl、10%（wt/vol）葡萄糖、100 mM单乙醇胺（MEA）、40μg/mL过氧化氢酶和0.5 mg/mL葡萄糖氧化酶]的成像缓冲液上。MEA被用作硫醇化合物，以促进染料的光开关。过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶使用氧气清除剂系统减少光漂白(91). 在470 nm处将激发光调节为0.2–1 mW，在590 nm处调节为0.2-1 mW以获得荧光团的稀疏子集。在物镜后面测量激发光的强度。连续采集流媒体图像，曝光时间为10–15 ms。平均而言，每个视野采集了1000到5000张图像。闪烁事件通过帧间单个像素区域的荧光变化来识别。从单个焦平面采集图像。使用QuickPALM进行质心测定和图像重建(92). 为了确定STORM数据中粒子之间的空间相关性，使用Mosaic Interaction analysis ImageJ插件进行了最近邻分析(70). 简而言之，使用空间相关性量化对象之间的交互潜力，并量化交互的强度和规模。
质粒和转基因菌株。
为了构建在蠕虫体腔细胞中表达的荧光蛋白（FP）融合转基因，我们使用snx-1型启动子和多位点网关对标记N或C末端的反应。感兴趣基因的PCR产物首先通过BP反应（Invitrogen）克隆到Gateway进入载体pDONR221中。然后，携带感兴趣序列的pDONR221质粒与psnx-1-FP或psnx-1单独pDONR结合(4,1)向量和FP-let-858或unc-54–3′UTR pDONR(2,三)向量，并重组为目的向量pCFJ150[编号19328(93); 通过使用LR克隆酶II+（Invitrogen）反应添加基因。通过微粒轰击法获得了所有这些质粒的低拷贝整合转基因株系(94,95). GFP标记的VPS-35是通过使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑创建的(96).
膜分离。
通过漂白使蠕虫同步化，在线虫生长培养基（NGM）上以15°C培养至L2/L3阶段，然后转移至25°C培养36小时。用M9缓冲液将幼成虫从平板上冲洗下来，造粒，然后再悬浮在500μL裂解缓冲液中[20 mM Hepes，PH8.0，20%（wt/vol）蔗糖，10%（vol/vol）甘油、2 mM DTT、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂（目录号1183580001；罗氏）]。然后使用Mini-Beadbeater-16（BioSpec）和0.5 mm氧化锆/硅珠（BioSspec产品目录号11079105z）对蠕虫进行破坏。为了完全溶解蠕虫，在冰上使用五个30秒脉冲，间隔5分钟。尸体和细胞核通过1000×离心去除克在4°C下保持5分钟。以18000×克持续20min，分离成颗粒和可溶性部分，然后在100000×克持续1h，然后再次分离成可溶部分和颗粒部分。在与作为上清液回收的相同体积的裂解缓冲液中重建颗粒。
秀丽隐杆线虫西方分析。
将蠕虫同步培养在NGM平板上。将每个基因型的50只年轻成年动物手工挑选到10μL裂解缓冲液[100 mM Tris，pH 6.8，8%（wt/vol）SDS，20 mMβ-巯基乙醇]中，并在37°C下孵育1小时。用10%（wt/vol）SDS/PAGE分离提取的蠕虫蛋白，并用硝酸纤维素印迹。封闭后，用秀丽隐杆线虫-特异性HGRS-1抗体(80).
秀丽隐杆线虫显微镜和图像分析。
将活蠕虫安装在10%（wt/vol）琼脂糖垫上，垫上0.1微米聚苯乙烯微球（编号00876–15；Polysciences）(97). 使用配备数字CCD相机（Rolera EM-C2；QImaging）的Axiover 200M显微镜（Carl Zeiss MicroImaging）获得多波长荧光图像，使用MetaMorph 7.7软件（Universal Imaging）进行捕获，然后使用AutoDeblur X3软件（AutoQuant Imaging）解卷。利用MetaMorph7.7共定位函数进行共定位分析，从而对每个通道中的强度进行阈值化，并分析共定位的平均面积。在相同的采集参数下，通过使用阈值图像，MetaMorph 7.7也对平均强度测量值进行了分析。重要性由学生衡量t吨测试。在不考虑基因型的情况下，对黄嘌呤：：HGRS-1内体占位进行成像和分析。
