伪狂犬病病毒（PRV）是一种猪α疱疹病毒，是α疱疹病毒亚家族的成员，包括人类和动物病原体，如水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和HSV-2、牛疱疹病毒1和5型以及马疱疹病毒1、4型(23). 尽管PRV的自然宿主是成年猪，但PRV是泛嗜性的，感染鸟类胚胎和广泛的哺乳动物物种，人类和其他高阶非人类灵长类物种除外。
PRV通常在成年猪的PNS神经节中建立潜伏感染，但很少侵入这些动物的中枢神经系统（CNS）(8). 成年猪之间的病毒传播主要通过直接粘膜接触进行。野生型PRV感染的常见后遗症包括呼吸道疾病、体重减轻以及怀孕母猪和母猪的不育(31). 相反，PRV感染对新生仔猪和非本地宿主（如奶牛、狗、啮齿动物和其他易感动物）是致命的。在这些动物中，感染会导致严重的、无法控制的瘙痒，最终导致疯狂的自残行为，历史上被描述为“疯狂的瘙痒”。感染强毒株PRV后几天内死亡。这些动物的死亡原因传统上被认为是致命的脑炎。
感染PRV-Bartha等减毒活疫苗株的成年猪通常很少出现感染症状。此外，大多数减毒PRV毒株在非本地宿主（如啮齿动物）中的毒力明显较低(8). 尽管PRV-Bartha表型减弱，但在非本地宿主中仍具有神经侵袭性，并可导致大规模脑感染。神经侵袭性和毒性降低的综合特性使神经解剖学家能够利用PRV-Bartha和重组Bartha菌株作为许多实验动物神经连接的示踪剂(10).
一些证据表明，PRV-Bartha具有神经侵袭性，但只能在神经元回路（从突触后神经元到突触前神经元）的逆行方向传播(8,20). 野生型病毒沿着顺行方向（从突触前神经元到突触后神经元）传播需要PRV US公司9、gE和gI蛋白(4,12). 这些基因在PRV Bartha菌株中被删除(三,14,16,18,19,22). U型S公司9、gE和gI基因产物不需要逆行传播。此外，在PRV强毒株中，gE和gI蛋白在促进PRV感染的特征症状和快速死亡方面起着重要作用(32).
我们使用了之前描述的其他甲疱疹病毒PRV接种的侧翼划痕方法(24,25). 小鼠侧面感染模型模拟了一种自然发生的α疱疹病毒感染，感染是在上皮组织中开始的，随后病毒传播到PNS，有可能进一步发展为CNS的结构。支配皮肤的神经元通路在小鼠中具有很好的特征。此外，皮肤的固有细胞防御机制和固有免疫反应也很强大。这些特征使得相对容易地评估病毒基因产物在毒力中的作用。此外，与涉及头部和颈部组织的感染模型不同，颅神经不能直接从侧面皮肤感染，这一特性可以更好地评估神经侵袭性。
我们报告说，感染小鼠右侧一个部位的强毒株PRV会导致接种部位的皮肤以及相应的皮肤受到疯狂的抓挠和咬伤。皮肤的自发性创伤最终导致感染部位出现剧烈但极其精确的皮肤损伤。感染野生型PRV的小鼠变得越来越虚弱，在感染后约75小时死亡，没有可检测到的行为异常，表明中枢神经系统病理学和大脑中几乎检测不到的病毒数量。相反，接种减毒株PRV-Bartha的小鼠侧翼表现出明显不同的特征。尽管这些动物最终会死亡，但它们的存活时间几乎是感染野生型PRV的动物的三倍。尽管病毒在皮肤和相应的神经节中复制，但在感染过程中，它们不会引起瘙痒，也不会产生任何皮肤损伤。感染PRV-Bartha的小鼠在～140小时前仍无症状，此时出现明显的神经异常，如共济失调。这些动物大约在220小时后死亡，脑组织中有大量病毒。该模型根据感染菌株的毒力描述了两种不同的致死模式。重要的是，PRV-Becker和PRV-Bartha之间的巨大差异使我们能够仔细剖析特定PRV编码基因的功能，这些基因对致病至关重要。
材料和方法
病毒株。
PRV Becker是一种毒性实验室菌株。等基因株PRV-91（gE-null）、PRV-98（gI-null）和PRV-160（US公司9-null）（删除gE、gI和US公司9个基因）(4,7,30)（参考表). 减毒疫苗株PRV-Bartha的基因组编码一些突变，包括唯一短链（US公司)PRV基因组的区域，包括编码U的基因S公司9、gE、gI和US公司2（在别处详细描述[三,14,16,18,19,22]). 用于这些研究的另外两种强毒株PRV-Kaplan和PRV-NIA3已在别处描述(13). 利用PK15（猪肾）细胞对所有PRV菌株进行繁殖和斑块分析。
表1。
| 应变 | 基因型 | 参考文献 |
|---|
| PRV-Becker公司 | PRV野生型 | 13 |
| PRV-Kaplan公司 | PRV野生型 | 13 |
| NIA3公司 | PRV野生型 | 13 |
| PRV-160型 | 9美元为空 | 4 |
| PRV-91型 | gE为空 | 7 |
| PRV-98型 | gI为空 | 30 |
| PRV-Bartha公司 | Δ（gI-gE-Us9，Us2），gC，U的点突变我21，克 | 三,14,16,18,19,22 |
| PRV-158型 | PRV-Bartha恢复Us9、gE和gI | 17 |
| PRV-BaBe公司 | Δ（gI-gE-Us9，Us2）与PRV-Becker等基因 | 7 |
抗血清。
用于免疫组织化学分析的PRV特异性兔抗血清RB133（稀释1:7000）如前所述(7).
小鼠侧面感染方案。
普林斯顿大学动物福利委员会和研究与项目管理办公室批准了这些研究的实验方案。动物使用协议完全符合美国实验动物护理认证协会制定的法规和《动物福利法》（公法99-198）的规定。用6-7周龄雌性C57BL/6/J小鼠（Jackson Laboratories）进行小鼠侧面感染实验。抵达普林斯顿大学后，这些5至6周大的小鼠被允许在普林斯顿大学生物安全二级动物饲养设施中适应1周，然后实验开始。在习服期和整个实验过程中，将小鼠保持在恒定的环境温度和光周期条件下（光照12小时，黑暗12小时）。用于小鼠侧面接种的方案改编自Simmons和Nash描述的方案(25)弗里德曼和同事(24,29). 每只小鼠重约17克，通过腹腔（i.p.）注射100μl总体积的过滤消毒14.3毫克/毫升氯胺酮和1.8毫克/毫升木聚嗪，将其稀释成磷酸盐缓冲盐水（PBS；Gibco）进行麻醉。麻醉后，将动物置于左侧卧位；从椎旁窝区域，即从侧面颅骨到臀部的凹陷区域去除毛发。夹毛后，将脱毛膏（Nair）涂抹于右侧腹部2分钟。然后用柔软干净的纱布和大量的水将奶油洗掉。大约48小时后，通过腹腔注射如上所述制备的氯胺酮和甲苯噻嗪对小鼠进行再麻醉。
麻醉后，一滴10μl的接种液含有106将悬浮在病毒培养基（Dulbecco改良Eagle培养基加2%胎牛血清[Gibco]）中的PRV PFU应用于无毛的右侧椎旁窝区域。为了便于病毒的吸附，用无菌的25号针头在四个不同的方向（水平方向10次、垂直方向10次，右对角线10次，左对角线上10次）轻轻刮伤皮肤40次，破坏了液滴下面的角质层。
在整个实验过程中，每隔6到8小时仔细观察一次小鼠。标准化检查表能够准确记录关键实验参数，包括动物的整体行为、接种部位的皮肤外观以及相应的皮肤、食欲、瘙痒、步态障碍和感染后的死亡时间。
麻醉研究。
从感染后40小时开始并持续到60小时，每2-4小时用上述剂量的氯胺酮-甲苯噻嗪混合物麻醉PRV Becker感染的小鼠。在感染过程中，当未经治疗的动物疯狂抓挠时，这种治疗有效地使动物失去意识或显著镇静1至2小时。
从组织中回收感染病毒。
对于斑块形成分析，在接种后36、72、96、168和236小时在二氧化碳室中安乐死动物后，立即从小鼠身上采集组织。从小鼠身上解剖出的组织包括：两个8毫米圆形皮肤穿孔，分别位于接种部位和同一皮肤节区的腹侧次级部位、同侧背根神经节（DRG）、脊髓、后脑以及左右大脑半球。每个数据点感染三只小鼠，并将类似的组织汇集在预先称重的无菌Eppendorf管中。称量组织样品，添加500μl Dulbecco改良Eagle培养基（2%胎牛血清），通过将Eppendorf管浸入液氮中快速冷冻组织，然后在−80°C下保存，直到测定滴度。为了计算每克组织中的病毒PFU数量，将样品加热至37°C，并使用无菌一次性杵（Kontes）均质。通过将试管浸入液氮并快速解冻至37°C，对组织匀浆进行两次额外的快速冷冻循环。匀浆在3000×克将澄清的上清液转移到新鲜的Eppendorf管中，并在PK15细胞单层上测定相应组织中的相对PFU滴度。
在另一项实验中，切除了以下器官：肺、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、肾上腺、胃（排空内容物）、卵巢、子宫和膀胱。将三组小鼠的相同器官按照上述方法进行混合和制备，另外一步是使用电动组织研磨机粉碎组织（用100%乙醇消毒，并在每个样品之间冲洗）。
组织灌注、切片和免疫组织化学。
在感染后的不同时间，通过经心灌注15 ml冰镇4%（wt/vol）对甲醛-PBS丸，处死小鼠并放血。5分钟后，再灌注15 ml冷的对甲醛-PBS溶液，如上所述。仔细解剖大脑，并将其置于4%副甲醛-PBS中，温度为4°C，持续24小时。随后，通过连续浸泡24小时，将大脑置于无菌过滤的10、20和30%（wt/vol）蔗糖（罗氏）中，并在4°C PBS中稀释。冠状切面（～40μm厚）用冷冻切片机制作灌注组织。按照Card和Enquist的描述对切片进行处理和染色(5).
结果
致命PRV侧面感染的明显症状。
与Simmons和Nash描述的HSV皮肤病变相反(25)由于病情轻微，出现带状疱疹样皮损，PRV引起的皮肤损伤不是水疱性的，而是明显的组织损伤。感染强毒PRV-Becker株约40小时后症状明显。主要特征是严重的瘙痒症，导致动物疯狂地抓和咬右翼区域，翻滚，不愿意在右后肢上承受重量。瘙痒加剧，直到动物将全部精力集中在抓挠和咬伤病毒接种部位和感染部位周围精确的带状区域（严格位于右侧（同侧））。瘙痒发生后不久，皮肤呈现粉红色和光泽。如图所示，这种外观逐渐发展为严重的、红斑的、结痂的皮肤损害。病变局限于一个或多个重叠的皮肤膜，据预测，这些皮肤膜覆盖了原发感染部位的感觉神经元区域。感染PRV-Becker病毒的动物平均死亡时间为76.4小时，标准偏差<5小时（图。). 临近死亡时，这些动物不再表现出瘙痒的迹象，对外界刺激没有反应，以驼背的姿势坐着，眼睛迟钝凹陷，毛皮蓬松粗糙。死前，这些老鼠奄奄一息，表现出极度的呼吸。
（A） 在强毒力PRV小鼠侧面感染中观察到的红斑皮肤损伤的发展和进展。按照材料和方法中的描述，用PRV-Becker感染小鼠。描述了小鼠在24、48、60和72小时的典型图像。（B） 200小时PRV-Bartha感染小鼠的代表性图像。
感染PRV株的小鼠感染后的死亡时间。通过侧面划痕感染小鼠，然后按照材料和方法进行观察。用每种菌株接种一组七只小鼠的样本。每个条形图的阴影区域表示症状明显的时间段。水平线表示标准偏差。
与强毒株相比，PRV-Bartha病毒显著减弱。（i） 平均生存时间。
将三种不同的野生型强毒株PRV的存活时间与减毒疫苗株PRV Bartha的存活时间直接进行比较。感染这些研究中使用的三种毒株Becker、Kaplan和NIA3的小鼠的平均存活时间分别为76.4、79.1和74.6小时（图。). 这些菌株的标准偏差小于6小时。相比之下，感染PRV-Bartha的小鼠平均存活220.7小时，几乎是感染毒株的动物存活时间的三倍。随着存活时间的增加，感染特定菌株的群体的首次死亡和最后死亡之间的范围通常会增加。在这两个极端情况下，感染PRV-Kaplan和PRV-Bartha的时间标准偏差分别为2.3小时和38.3小时。
（ii）LD50.
50%致死剂量（LD50)计算基于Reed和Muench的方程式(21). LD公司50PRV-Bartha为7.4×105PFU和LD50PRV-Becker为1.47×104PFU（表). PRV-Becker感染小鼠的平均存活时间从82.0 h增加到10 h6PFU，10时为90.4小时5PFU用于接种。感染PRV Bartha的动物的平均存活时间没有显著差异，接种剂量为107PFU的平均存活时间为217.6小时，剂量为106PFU导致平均存活时间为215.8小时。
表2。
劳埃德50侧翼模型中PRV-Becker和PRV-Bartha的值
| 应变 | 劳埃德50（PFU） | 平均存活时间（h）一(n个) |
|---|
| PRV-Becker公司 | 1.47 × 104 | 86.6 (14) |
| PRV-Bartha公司 | 7.4 × 105 | 221.2 (12) |
PRV-Bartha不会引起瘙痒。
感染PRV强毒株NIA3和Kaplan的小鼠表现出的特征性皮损和瘙痒与PRV-Becker的小鼠一样严重（表). 与此形成鲜明对比的是，感染PRV-Bartha病毒的动物在感染期间的任何时候都没有出现瘙痒，也没有出现皮肤损伤（图。). 从大约140小时开始，PRV Bartha感染的动物确实表现出行为异常，如共济失调、步态障碍和震颤。
表3。
| 应变 | n个一 | 病变严重程度（%）b条
|
|---|
| 严重 | 中等 | 轻度 | 无损伤 |
|---|
| PRV-Becker公司 | 25 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| 卡普兰 | 7 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| 镍3 | 7 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| PRV-158型 | 7 | 100 | 0 | 0 | 0 |
| PRV-98（gI空） | 7 | 42.9 | 14.3 | 28.6 | 14.3 |
| PRV-160（Us9空） | 21 | 14.3 | 42.9 | 42.9 | 0 |
| PRV-91（gE空） | 25 | 8 | 28 | 56 | 8 |
| PRV-BaBe公司 | 7 | 14.3 | 28.6 | 28.6 | 28.6 |
| PRV-Bartha公司 | 25 | 0 | 0 | 0 | 100 |
对选定的PRV-Becker突变体进行分析，可以指定PRV毒力相关的PRV基因。
PRV-Bartha的基因组包含编码gC、U的基因的点突变我21和gM，以及删除了U中的几个千碱基对S公司区域。U中的删除S公司Bartha基因组的区域删除了U的编码序列S公司9蛋白，以及gE、gI和US公司2种蛋白质(三,14,16,18,19,22). 为了在我们的研究中确定这些基因对毒力的相对贡献，我们用Becker等基因株PRV-160（US公司9-null）、PRV-91（gE-null）和PRV-98（gI-null），它们携带编码U的基因缺失S公司分别为9、gE和gI。这三种病毒蛋白，US公司在其他动物模型系统（如啮齿动物眼睛模型）中进行研究时，9、gI和gE对PRV的发病机制有显著影响（参考文献综述9). 侧面感染PRV-98（gI-null）、PRV-160（US公司9-null）和PRV-91（gE-null）导致轻度至中度病变（表)平均存活时间分别为100.7、104.1和114.9小时（图。). 缺少这三个基因中任何一个的突变株感染对症状的影响不大。结果的趋势表明，gE的缺失导致动物的生存时间最长，症状减轻程度最高。
为了了解gE、gI和U的联合作用S公司根据PRV毒力，各组小鼠感染PRV-158（PRV-Bartha和US公司区域恢复）或PRV BaBe（一种与具有US公司删除PRV-Bartha）（表). 接种PRV-158后，平均死亡时间为92.7小时，所有小鼠都出现严重的皮肤结痂，症状与PRV-Becker感染相关。与PRV-Becker相比，PRV-158感染小鼠的症状出现时间延迟了约24小时。PRV-BaBe感染小鼠平均157小时死亡，约三分之二的小鼠出现瘙痒和轻度至中度皮肤损伤（表). 其余三分之一的PRV-BaBe感染小鼠表现出与PRV-Bartha感染小鼠相当的表型，因为它们在死亡前表现出CNS异常，并且没有皮肤损伤或瘙痒。这些结果表明，编码U的基因缺失S公司PRV-Bartha中的9、gE和gI在很大程度上解释了其衰减，但不是全部。
PRV感染小鼠两侧的皮肤红斑损伤是自残造成的。
PRV-Becker感染小鼠侧翼的单侧病变呈精确的皮肤切片模式（图。). 我们假设这些损伤可能归因于两种可能的原因：（i）皮肤中的病毒复制导致坏死，或（ii）自残行为，如病毒感染刺激下咬伤和抓挠皮肤侧面。为了区分这些可能性，将小鼠感染PRV-Becker病毒，并定期对其中一组小鼠进行全身麻醉。麻醉期间，麻醉动物不能对侧翼区域造成创伤。如果损伤是由于皮肤中的病毒复制引起的，那么未经治疗的小鼠的损伤应该与麻醉小鼠的损伤相同。然而，如果损伤是由于自残造成的，与意识感染动物相比，麻醉动物的损伤会显著减轻。
结果是明确的。在感染后的后期（如60小时），麻醉小鼠的侧面损伤明显轻于未麻醉小鼠（图。). 有趣的是，尽管这些动物在麻醉后恢复时表现出镇静和嗜睡，但它们不可避免地立即开始抓挠和咬皮肤。这说明了图中所示的轻度病变。，右侧面板。这种行为突显了内部刺激的强度，驱使动物撕咬侧翼皮肤。我们得出结论，红肿反映了自残，并不代表皮肤中病毒复制的影响。重要的是，无论动物是否被麻醉，PRV-Becker感染动物的平均死亡时间约为76小时。很明显，自残和严重损伤对死亡时间几乎没有影响。观察到PRV-98（gI-null）、PRV-160（US公司9-null）和PRV-91（gE-null）感染动物表明gI、US公司9和gE蛋白可能在启动或延长导致自残的有害刺激中起关键作用。
小鼠侧翼在60小时时模拟感染或感染PRV-Becker病毒的图像。模拟感染小鼠未接受麻醉（无治疗）。PRV-Becker感染的小鼠要么不麻醉（不治疗），要么通过静脉注射氯胺酮和甲苯噻嗪（氯胺酮/甲苯噻唑嗪），每隔40到60小时定期麻醉一次。
在侧面感染小鼠的皮肤上和皮肤内检测到PRV。
感染本研究中使用的每种强毒和弱毒PRV毒株的小鼠的皮肤表面都检测到感染病毒（数据未显示）。每个菌株在皮肤内也都有复制（图。). 由于PRV-Bartha在接种地点复制（图。)尽管完全没有病变（图。)我们的结论是，仅在皮肤内复制不足以引起任何类型的损伤。
感染组织中感染病毒随时间的滴定。用每种PRV菌株感染小鼠，并按照材料和方法中所述处理组织。每个时间点每个菌株接种三只小鼠。处死小鼠，并在36和72小时从接种每种病毒的小鼠中收集组织。96小时，接种PRV-160（US公司处死9 null）、PRV-98（gI null），PRV-91（gE null）和PRV-Bartha，并采集组织进行病毒分离。分别在168小时和210至236小时从感染PRV-Bartha的小鼠中采集两个单独实验中的四只小鼠的组织。必须忽略接种后超过死亡时间点的菌株。
感染PRV-Becker病毒的动物死亡时大脑中的感染性病毒很少。
PRV首先在接种部位复制，然后通过支配皮肤的感觉和运动神经末梢传播到PNS。在HSV小鼠侧面模型中，感染随后从神经节扩散到皮肤节内的次级皮肤部位（带状传播）(24,25). 为了比较强毒株、突变株和弱毒株的传播情况，在接种后每隔一段时间选择不同的外周组织和CNS组织进行感染病毒的滴度测定。切除的组织包括在主要接种部位的8毫米皮肤穿孔，在同一皮肤节内的次要部位的8 mm皮肤穿孔，合并同侧DRG、脊髓、脑干组织、左半球和右半球。小脑组织的数据不包括在内，因为在不污染脑干的情况下，很难切除小脑。然而，所有其他组织都很容易去除，不会污染其他组织的残留物。
感染强毒株PRV-Becker、PRV-Kaplan和PRV-NIA3的小鼠的组织滴度（PFU/g组织）相似（图。). PRV-NIA3是第一个在脊髓中检测到的毒株（图。). 与PRV-Becker和PRV-NIA3相比，PRV-Kaplan在次级皮肤部位的传播速度稍慢。在36小时收集的样品中，这些毒力菌株产生的滴度高于选定的突变菌株。然而，到72小时，与突变菌株相比，皮肤中受毒力病毒感染的组织的滴度降低。在72小时时，感染强毒株的小鼠濒临死亡，并且在DRG和脊髓中检测到大量的感染性病毒。脑部样本几乎没有感染病毒。
某些内脏器官内发现PRV-Becker病毒载量高。
对感染晚期（分别为70和192小时）感染PRV-Becker或PRV-Bartha的小鼠内脏器官中回收的感染病毒进行比较，得出以下结果（表)：在心脏和肺部检测到少量PRV-Becker病毒，没有从肝脏、脾脏或胃中发现感染性病毒。从肾脏、肾上腺、胰腺、卵巢、膀胱和子宫组织中分离出大量PRV-Becker病毒滴度。感染通过以下途径到达这些器官：（i）通过从腰椎或胸椎脊髓沿交感神经元顺行传播，（ii）通过肠系膜下神经节从腰椎节段流出的副交感神经元，或（iii）通过内脏总传入（GVA）逆行传播连接腰脊髓、膀胱、肾上腺和肾脏的通路。啮齿动物的这些感染途径具有很好的特征(26).
表4。
| 器官 | 恢复（日志10[PFU/g]），共：
|
|---|
| PRV-Becker，70小时 | 192小时PRV-Bartha |
|---|
| 心脏 | 0.8 | 2 |
| 肺 | 0.2 | <0.4 |
| 肾脏 | 4.9 | 0.2 |
| 肝脏 | <−0.5 | <−0.4 |
| 肾上腺（两个） | 7.6 | 3.5 |
| 卵巢 | 7 | <2.0 |
| 脾脏 | <0.7 | <0.7 |
| 胰腺 | 3 | <0.5 |
| 胃 | <0.5 | <0.5 |
| 膀胱和子宫 | 5.3 | 1.4 |
相比之下，PRV-Bartha感染小鼠的唯一组织是肾上腺，即使感染病毒的滴度也不高。PRV-Bartha可能仅通过GVA途径内的逆行传播到达该组织。值得注意的是，内脏器官仅由GVA神经元稀疏支配，这进一步解释了检测到的PRV-Bartha水平较低的原因(26).
PRV感染减弱揭示了神经侵袭和毒力的反向关系。
感染性PRV-Bartha颗粒的组织分布与强毒株的分布有明显差异。与感染gE-null、gI-null或U的组织相比，感染PRV-Bartha的组织中的滴度降低S公司9-接种后同等时间的空突变体。此外，PRV-Bartha进入每种组织类型的时间延迟。如PRV-91（gE-null）和PRV-160（US公司如预测的那样，如果感染的DRG没有顺行传播回皮肤，则在二级皮肤部位未检测到PRV-Bartha。相反，在第二皮肤部位检测到PRV-98（gI-null），表明缺乏gI仅对受感染DRG的顺行传播产生轻微影响。PRV-Bartha感染小鼠的存活时间比任何其他感染都长，在这些晚期感染小鼠表现出严重的神经异常。在这些时候，脑组织中检测到的感染性PRV-Bartha病毒的数量超过了濒临死亡的毒力感染小鼠大脑中检测出的水平，高达5个数量级。
感染PRV-160的小鼠的组织滴度（US公司9-null）、PRV-91（gE-null）和PRV-98（gI-null）具有可比性。相对于毒株，这三个无效突变体在皮肤和神经组织中的进展较慢。96小时后，感染PRV-160（US公司9-null）、PRV-91（gE-null）或PRV-98（gI-null）已接近死亡，且可从大脑中回收大量感染性病毒滴度。PRV-160（U）从皮肤传播到PNS和CNSS公司9-null），PRV-91（gE-null）、PRV-98（gI-null）和PRV-Bartha相对于毒株延迟。我们观察到神经侵袭性与毒力呈负相关：当毒力（通过损伤评分和死亡时间衡量）降低时，病毒在中枢神经系统内的传播更为广泛。
PRV-Bartha通过传出而非传入途径传播到大脑。
皮肤由著名的感觉（传入）和运动（传出）通路支配。通过传入回路进入大脑需要病毒的顺行传播，而通过传出回路的运动需要逆行传播。
75小时时，当PRV-Becker感染的动物处于疾病的最后阶段时，将动物处死并通过经心灌注的方式灌注多聚甲醛。随后采集大脑进行免疫组织化学分析。在77小时和166小时时，也将PRV-Bartha感染小鼠的大脑取出进行比较（图。和). 约75至77小时，感染PRV-Becker或PRV-Bartha的小鼠的大脑中检测到少量病毒抗原（图。). 这与图中显示的组织滴度数据一致。在一些PRV Becker感染的小鼠的后脑切片中，可以在脑干中检测到少量病毒抗原，但在小脑中检测不到。中脑或前脑切片未检测到抗原。PRV-Becker感染动物75小时时脑干中的感染区域包括外侧巨细胞旁核（图。和). 75至77小时时脑干中感染性PRV-Becker病毒的数量比同等时间点的PRV-Bartha病毒数量大，此时几乎没有病毒到达大脑。
感染PRV Becker和PRV Bartha的小鼠脑切片的免疫组织化学检查。显示了感染PRV-Becker病毒75小时（垂死期）、PRV-Bartha病毒77小时和166小时（垂死期）小鼠后脑（A）、中脑尾侧（B）和中脑吻侧（C）的等效抗PRV染色切片。使用Adobe Photoshop软件颠倒黑白图像的颜色，因此病毒抗原显示为白色。图中放大了用矩形划分的区域。.
图中显示了抗PRV染色切片的放大区域。（用矩形划分的区域）。这些包括75小时感染PRV-Becker和166小时感染PRV Bartha的小鼠的后脑（A）、尾侧中脑（B）和吻侧中脑。Adobe Photoshop中的图像被反转，因此病毒抗原显示为白色。缩写：LPGi，外侧巨细胞旁核；DM，下丘脑背内侧核；LH，下丘脑外侧区；VMH，下丘脑腹内侧核。
在感染PRV-Becker病毒的一些濒死阶段的动物的大脑中几乎检测不到病毒抗原。相比之下，所有感染PRV-Bartha病毒的濒死动物的大脑的许多区域都含有丰富的病毒抗原（图。和). 大脑的感染区域对应于主要传出（运动）中枢，这些中枢定义了通往皮肤的降血清素-类脂镇痛通路。这些包括脑干中缝大核（RMg）和中脑导水管周围灰质（PAG）。前脑的初级运动皮层也含有PRV Bartha抗原。这些结果支持了我们的假设，即PRV-Bartha只能在神经元回路中逆行传播(20).
94小时时，当小鼠感染PRV-98（gI null）、PRV-91（gE null）或PRV-160（US公司9 null）处于疾病晚期，免疫组化检测到相当数量的病毒抗原（图。). 检测到病毒抗原的区域对应于RMg、PAG和下丘脑背内侧核。这些区域所含的病毒抗原少于感染PRV-Bartha病毒的大脑在疾病后期所观察到的病毒抗原。在所有分析的大脑小脑中均未检测到病毒抗原。
感染PRV-98（gI null）、PRV-91（gE null）和PRV-160（US公司94小时（晚期发病率）。Adobe Photoshop中的图像被反转，因此病毒抗原显示为白色。切片边缘的强烈白色外观是组织染色的伪影。缩写：LPGi，外侧巨细胞旁核；DM，下丘脑背内侧核。
通过PRV追踪两种神经侵袭模式。
DRG中接收皮肤结构输入的感觉神经元将轴突投射到脊髓背角。相反，脊髓腹角的运动神经元将轴突投射到皮肤上。我们假设强毒株PRV能够通过传入和传出途径从脊髓传播到大脑，因此脊髓传出和传入中枢都含有病毒抗原。相反，PRV-Bartha只会通过传出途径传播，导致只感染脊髓传出中枢。
我们使用免疫组织化学分析方法，检查感染PRV-Becker（72小时）和PRV-Bartha（96小时）小鼠脊髓的腰椎和胸椎区域的连续切片。所选部分如图所示。选择这些时间点是因为恢复的病毒大致相等（105PRV-Becker感染小鼠72小时和PRV-Bartha感染小鼠96小时的PFU/g）。在腰椎区域，接受原发感染神经节直接神经支配的脊髓部分，抗原主要在PRV-Becher感染小鼠的背角（感觉输入部位）检测到。PRV-Becker感染小鼠的腰椎脊髓切片中也可以检测到腹角（运动输入部位）的染色。PRV-Bartha感染的腰椎脊髓切片中，传出柱（中间外侧细胞柱）被强烈染色，背角内的一些神经元被染色。据推测，PRV-Bartha病毒通过中间神经元逆行传播，从运动神经元传播到腰椎区域的感觉中枢。
从72小时感染PRV-Becker的小鼠或96h感染PRV-Bartha的小鼠身上采集的腰椎（A）和胸椎（B）脊髓切片的图像。切片被PRV抗原染色，呈深棕色。左右背角和腹角被标记为方向。
为了验证PRV-Becker病毒沿传出和传入途径传播，以及PRV-Bartha病毒仅通过传出途径传播，还对胸椎脊髓切片进行了分析。PRV-Becker抗原在背核（或包含传入侧支的“Clarke柱”）和中间外侧细胞柱内检测到。这表明，传播发生在顺行和逆行两种方式。然而，PRV-Bartha抗原仅在中间外侧细胞柱中检测到，表明向大脑的传播仅通过逆行传播发生。
讨论
Simmons和Nash描述的经典HSV小鼠侧面感染模型描述了感染后2天接种部位的一个原发性病变，然后在感染后约4天沿皮肤出现继发性病变（带状疱疹）(25). 原发性病变是由宿主对病毒复制的反应引起的。然后HSV侵入支配皮肤的感觉神经元（DRG的神经元）。起源于脊髓腹角的运动神经元投射到皮肤上也受到感染。同样，交感神经节的运动神经元也受到感染，交感神经节是与支配皮肤的DRG不同的外周神经节。在最初的侧面感染模型中，HSV在初次感染时传播到DRG感觉神经元，然后传播回受感染DRG神经元支配的所有皮肤部位（DRG支配的皮肤部位）。由此产生的继发性病变是水泡状的，使人想起带状疱疹病变（带状疱疹），因此称为“带状疱疹”。根据菌株和接种剂量，30%至60%的HSV感染小鼠能够存活下来(29).
在目前的PRV感染模型中，感染结果截然不同。主要区别如下。野生型PRV感染动物表现出明显的周围神经病变，由于剧烈抓挠和咬伤受感染的皮肤，导致自残。即使麻醉阻止了自残，动物仍然会与表现出暴力抓挠行为的警觉动物同时死亡。最初，我们认为水疱性病变（如果存在）完全被戏剧性的皮肤损伤所掩盖。然而，情况并非如此，因为在没有自残的情况下，没有任何严重的损伤是明显的，尽管有证据表明病毒在皮肤中复制。
神经侵袭和CNS直接感染的对比。
PRV株可以从宿主外围的一个部位传播到中枢神经系统，被描述为神经侵袭性。涉及头部、颈部和内脏结构（眼、耳、口、鼻或腹膜感染）的感染模型会使颅神经受到感染(1,2,6,28). 一些脑神经元位于大脑和脊髓中，并将轴突从中枢神经系统外发送至周围部位。这些神经元的轴突末端可以直接从外围感染，导致感染在单个神经元内传播到CNS。类似地，其他颅神经的神经元将感觉信息传递给大脑（例如，三叉神经、视神经和嗅觉神经）。这些神经元的胞体位于中枢神经系统外，并将轴突投射到中枢神经系统。在某些情况下，细胞体可能受到感染，病毒可以直接传播到大脑中（例如，视网膜神经节细胞和嗅觉神经元）。
如果通过大脑中存在病毒抗原或感染性病毒来测量神经侵袭性，则测量结果可以反映两种不同类型或组合的神经感染：颅神经中的初级神经元感染或感染从外周神经节向中枢神经系统的跨神经元传播。这些特性是独特的，因为前者反映了单个神经元内部的运动以及通过单个突触进入中枢神经系统的运动。后者不仅需要神经元内的长距离运动，还需要感染在几种特殊的细胞-细胞连接中传播。病毒突变体是否具有神经侵袭性的断言必须通过注意哪些类型的神经元受到感染来加以限定。在侧翼模型中，所有神经侵袭性的分配都要求感染从上皮细胞扩散到PNS，然后扩散到CNS。此外，考虑到感染从侧面传播到大脑所需的物理距离，PNS和CNS侵袭导致的表型暂时分离是可能的。因此，我们能够区分PRV的两种神经侵袭模式。
神经侵袭和致死的两种模式。
毒株PRV可以通过传出和传入途径进入中枢神经系统，而PRV-Bartha只能通过传出途径进入（图。). PRV-Becker通过内源性神经调节系统的上行感觉通路和相应的成对下行抑制通路进入中枢神经系统。PRV-Bartha仅通过传出途径进入中枢神经系统，如降5-羟色胺能-类脂镇痛途径，该途径通常用于调节疼痛感。这种镇痛途径从中脑PAG下降到脑干RMg核，进入脊髓背外侧索，最后到达表皮内的神经支配部位。PRV-Bartha感染后，这些区域中存在的病毒抗原正好对应于这种自主神经通路。PRV-Becker抗原偶尔也可以在感染的垂死阶段在5-羟色胺能-磷脂镇痛通路的神经元中检测到，但程度远低于PRV-Bartha。
PRV-Becker和PRV-Bartha在小鼠侧面瘢痕感染模型中的传播示意图。缩写：GVE，一般内脏传出；LPGi，巨细胞旁外侧核；DM，下丘脑背内侧核；LH，下丘脑外侧区；下丘脑腹内侧核；M、 运动皮层；Ce，中央杏仁核。
与PRV-Bartha相比，感染PRV-Becker病毒的小鼠的大脑内或从其大脑中分离出的感染性病毒很少。因此，我们认为致命的侧翼感染不会导致大脑感染死亡。在感染高度减毒的PRV-Bartha疫苗株的动物中，可能没有或减少其他触发毒性感染小鼠早期死亡的因素，从而导致更广泛的神经侵袭。侧翼划痕模型能够分离这些致命效应，并有可能识别所需的相应病毒基因。
我们发现PRV-Bartha通过传出途径侵入中枢神经系统，这证实了回路追踪研究的结果，该研究表明PRV-Barth在多种实验动物模型的神经回路中单向传播（逆行传播）(20). 我们还证明，PRV-Bartha的顺行传播缺陷适用于PNS神经元（包括DRG的假单极神经元）和CNS。这两种神经侵袭模式导致中枢神经系统中不同组的受感染神经元和两种不同的致死综合征。我们现在知道，这种歧视性神经侵袭的一般基础是基于至少三种PRV基因产物的功能：gE、gI和US公司9.gE基因或U基因缺失S公司9基因导致感染无法通过传入途径传播，而gI基因的缺失显著减少了这种传播。
由于感染症状大大减轻，避免了早期死亡，减弱的病毒传播到中枢神经系统，产生行为和运动异常的特征性延迟综合征，最终导致死亡。U型S公司9、gI和gE各自对毒力有贡献，但它们在神经侵袭中的作用与毒力的关系仍有待解释(4,15).
瘙痒是由PNS引起的，而不是CNS感染。
由强毒株PRV引起的感觉途径感染包括非本地动物的特征症状和早期死亡，该疾病的俗称为“伪狂犬病”。我们认为，瘙痒和快速致死的这些特征性症状反映了PNS的感觉臂感染，而不是大脑感染。感觉神经节的毒力感染很可能是由编码gE、gI和U基因的产物促成的S公司在强毒PRV综合征中起主要作用。
引起不受控制的抓挠和叮咬的有害刺激很可能来自受感染的DRG，因为病变定义了精确的皮肤团，并且在观察到瘙痒时，在该组织中检测到大量的感染性病毒。此时，大脑中未检测到病毒抗原或感染性病毒。Takahashi等人也提出了这一观点，他们认为与PRV相关的特征性瘙痒与小鼠前肢皮下感染后三叉神经节的侵袭有关(27). 瘙痒刺激至少部分由gE、gI和U介导S公司9种蛋白质，自从感染gE-、gI-和US公司9-null突变体导致瘙痒减轻，自残造成的损伤严重程度降低。
尽管HSV与gE、gI和U具有同源性，但为什么HSV小鼠皮肤感染基本上不存在瘙痒尚不清楚S公司然而，PRV引起的瘙痒让人想起水痘带状疱疹病毒再激活（带状疱疹）期间或临床上的带状疱疹时人类所经历的疼痛和瘙痒(11). 对PRV模型的分析可能有助于阐明瘙痒和带状疱疹后神经痛的根本原因，目前几乎没有可用的动物模型。
