内源性脑源性神经营养因子分泌的相应变化反映了长期增强和抑制的诱导

摘要

神经营养素，特别是脑源性神经营养因子（BDNF），在活动依赖性神经元可塑性中起着重要的调节作用(1,2,三,4,5). 这种行为的生理相关性是基于BDNF对突触强度活动依赖性变化的不同调节，如长期增强（LTP）和长期抑制（LTD）所反映的，这是学习和记忆的细胞范式(6). 海马LTP在两种BDNF中均严重受损(7,8,9)和TrkB(10,11)击倒小鼠。相反，通过阻断抗BDNF Abs或TrkB-IgG受体体促进视觉皮层LTD(12). BDNF基因敲除小鼠的海马中特别有趣的是(7)纯合子和杂合子动物的LTP减少程度是相同的，这表明BDNF必须有最低的临界浓度才能发挥其调节功能。腺病毒介导的BDNF在CA1区的再表达可以挽救LTP(8)或施用外源性BDNF(9). 已经对BDNF合成的调节进行了较为详细的研究(13,14,15,16,17)和分泌物(18,19,20,21,22,23,24,25,26,27). 有关BDNF分泌调节的研究是在还原系统中进行的，例如突触体(18)以及通过高钾去极化或外源性神经递质刺激BDNF分泌的分离神经元培养物(19,20,21,22,23,24). 最近利用海马神经元原代培养进行的研究专门用于研究电刺激参数与BDNF分泌之间的关系。然而，为了达到这个目标，BDNF的过度表达(25,26)或在非随机培养中长时间刺激(27)是测定BDNF分泌所必需的。这些实验适合评估BDNF分泌的基本机制，但所得结果可能与集成神经系统中遇到的情况有很大不同。因此，在最近的全面审查中(1,三,5)针对神经营养素在突触可塑性中的调节作用，强调在同一器官型神经元系统中同时测定内源性BDNF分泌和LTP和LTD记录是这一概念中缺失的一环。在这里，我们在鼻腔周围（PRh）皮层切片中满足了这一要求。

材料和方法

切片准备。实验在包括PRh、外侧内嗅皮层和海马在内的水平脑片上进行，这些脑片取自幼年（27至33天龄）雄性Sprague-Dawley大鼠。切片按照比尔基的描述进行制备(28)，室温下储存于人工脑脊液（126 mM NaCl/3 mM KCl/1.25 mM NaH₂人事军官₄/26 mM氯化钠_三/1 mM硫酸镁₄/2 mM氯化钙₂/10 mM葡萄糖），含95%O气体₂和5%CO₂pH值7.4。

免疫组织化学。在4°C下，将完整的切片固定在4%对甲醛中30分钟，进行免疫组织化学分析。用1%Triton X-100在PBS中渗透组织切片10分钟，并与鸡抗BDNF（Promega）、小鼠抗神经元核抗原（NeuN；Chemicon）或小鼠抗纤毛酸性蛋白（Sigma）原抗体在室温下稀释1:20培养1小时。将样品与驴抗鸡Cy5缀合物（The Jackson Laboratory）、山羊抗兔FITC缀合物（Sigma）或绵羊抗小鼠FITC缀合物（Sigma）二级Abs在室温下以1:20稀释孵育1小时。将切片安装在含有抗褪色二氮杂双环[2.2.2]辛烷（2.5%，wt/vol）的甘油/PBS培养基中。通过共焦分析评估免疫反应性。

电生理学。恢复至少60分钟后，将一片切片转移到浸没记录室，并以3 ml/min的速度灌注维持在34°C±0.2°C并用95%O饱和的人工脑脊液₂和5%CO₂.切片放入培养箱60分钟后开始记录。用细胞外微电极（玻璃微吸管，内充0.25M NaCl，2-5MΩ）在紧邻鼻孔裂的皮层II/III层记录水平通路刺激诱发的PRh皮层场电位（FPs）(图1A类)并通过Ag/AgCl电极连接至直流放大器。通过使用通过刺激隔离装置连接到同心双极电极（40-80 KΩ）的刺激发生器，施加恒流方波脉冲（0.2 ms，20-250μA，0.033 Hz），该同心双极电极位于距离记录电极约500μm的第II/III层中，沿吻侧方向。调整刺激强度以诱导约50%的最大突触反应。LTP是由100Hz的θ-脉冲刺激（TBS）诱导的，由四组刺激组成，每组刺激间隔15秒，每一组刺激由10组100 Hz的5个脉冲组成，脉冲间隔150毫秒(28). 还使用了两种较弱的TBS，包括(我)25 Hz TBS，仅在传送五个脉冲的频率上不同，以及(ii（ii）)100Hz TBS，由两组100Hz的刺激组成，而不是四组[TBS-100Hz（两组）]。LTD是由5 Hz下3000个刺激或1 Hz下900个刺激的低频刺激（LFS）诱导的。在另一组实验中，在恢复切片期间以及在整个记录期间，直到100Hz TBS后12分钟，将TrkB-IgG受体体（1μg/ml；Regeneron Pharmaceuticals，Tarrytown，NY）添加到脑脊液中。对于所有实验，给出的值均为平均值±SEM。

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图1。

PRh皮层BDNF表达。(A类)我们使用的切片制备的示意图，包括PRh皮层、外侧内嗅皮层和海马（白色背景），其中BDNF的表达通过使用多克隆抗BDNF抗体的免疫组化显示(B类)双标记实验表明，在第II/III层的代表区域，BDNF免疫反应性（绿色）主要与神经元核标记物NeuN（红色）（BDNF/NeuN）的免疫反应性相关。请注意，BDNF免疫反应显示不连续的斑片状特征。如第一层（BDNF/胶质纤维酸性蛋白）的代表区域所示，星形胶质细胞（红色）中未检测到BDNF免疫反应性。（比例尺指示50μm。）

内源性BDNF分泌分析。根据参考文献中描述的方法，通过ELISA对薄片灌流液中的BDNF进行定量。21.两个单克隆抗体(1和9)来源于免疫小鼠(29)亲和纯化。抗体1用作主要抗体，而抗体9与辣根过氧化物酶结合并用作次要抗体。ELISA板在4°C下用抗体1在50 mM碳酸钠缓冲液（pH 9.7）中涂布过夜，并用由Hanks缓冲液、0.1%Triton X-100和2%BSA组成的ELISA缓冲液隔夜封闭。将重组BDNF（0.5-1000 pg/ml）的样品和标准品与Ab 9一起放入平板中，并在4°C下培养过夜。洗涤后，通过与TMB底物孵育30分钟来检测结合的次级抗体。ELISA显示0.5 pg/ml BDNF的敏感性。BDNF浓度表示为初始基础分泌物的百分比（实验开始前收集的前三个组分中测定值的平均值）。数值以平均值±SEM表示。

结果

PRh皮层中BDNF的表达。我们描述了脑片中BDNF蛋白的表达模式，包括PRh皮层、外侧内嗅皮层和海马(图1A类)，通过使用多克隆抗BDNF抗体进行免疫组织化学。在PRh皮质的I-VI层之间，BDNF特异性标记有显著差异，其中最显著的标记位于II/III、V和VI层（图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。在高倍镜下分析显示II/II层不同区域的双重免疫荧光染色。BDNF的表达模式与神经元核蛋白NeuN的表达模式相关(图1B类)，表明BDNF的特异性神经元定位。神经元中的BDNF染色主要呈不连续、斑片状(图1B类). 胶质纤维酸性蛋白和BDNF没有共定位(图1B类).

内源性BDNF基础分泌的特征。在第二系列实验中，我们评估了PRh皮层的平行突触传递和切片灌注介质中BDNF的浓度。将单个切片放置在浸没记录室中，并以3ml/min的速度灌注。在PRh皮质的第II/III层进行电生理记录，其中BDNF染色特别强烈（图6）。以0.033 Hz的频率刺激水平纤维诱发负FP，其振幅在记录的前100分钟内没有变化(图2A类). 相反，在相同实验中收集的1分钟组分中，通过ELISA检测，切片灌注培养基中的BDNF浓度在20分钟后逐渐下降到92±4%，在100分钟后逐渐降低到86±3%(图2B类). 在没有电刺激的情况下，观察到BDNF浓度的类似下降率（20分钟后降至94±3%，100分钟后降至82±2%；数据未显示），表明内源性BDNF分泌是在切片制备过程中自发产生的。先前在海马神经元中分析的内源性BDNF的基础释放(19,21,22,30)，是由“构成性”和“调节性”分泌相结合的结果。该途径的调节成分是一个活动依赖性过程，包括刺激和抑制信号(30). 为了评估受调节的途径是否以及在多大程度上在我们的切片制备中发挥重要作用，将钠通道阻断剂河豚毒素（TTX；1μM）添加到灌注介质中。这种治疗取消了FP(图2C类)但只导致基础BDNF分泌轻微减少(图2D类). 在TTX后的前10分钟内，观察到分泌量最大减少（至87±4%），然后BDNF浓度下降得更慢，在100分钟时达到对照实验的水平（至84±3%）。这些观察表明，在我们的实验条件下，只有一小部分内源性BDNF分泌来自自发的神经元活动。

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图2。

基底突触刺激期间PRh皮层FPs和灌注介质内源性BDNF分泌的平行分析。(A类)将单个切片放置在潜水记录室中，并以3 ml/min的速度灌注。电生理记录是通过放置在PRh皮层第II/III层的细胞外微电极（Rec）进行的（参见图1A类). 使用同心双极电极（Stim）对水平传入纤维施加恒流方波，诱发负FP，其振幅在记录的100分钟内没有变化(n个= 6). (B类)用ELISA法测定切片灌注培养基中1分钟组分中BDNF的浓度，这些组分是在以下实验中收集的：A类注意，BDNF浓度在实验期间逐渐降低（20分钟后降至92±4%，100分钟后降至86±3%）。单个实验中的100%BDNF浓度如下：135、24、34、68、24和19 pg/ml(C类)电生理记录，如A类在没有钠通道阻滞剂TTX（1μM）（箭头所示）的情况下（0-10分钟）和在有钠通道阻拦剂TTX的情况下进行（10-100分钟）。请注意，TTX处理取消了FP(n个= 6). (D类)实验期间BDNF分泌C类BDNF分泌最初减少（20分钟后，即TTX应用10分钟后，降至87±4%），100分钟后达到与对照条件下相似的值（至84±3%）。单个实验中的100%BDNF浓度如下：79、35、19、56、22和47 pg/ml。

LTP期间内源性BDNF分泌增加。我们研究了内源性BDNF分泌是否对导致PRh皮层LTP的高频刺激有反应。100-Hz TBS（有关详细信息，请参阅材料和方法)快速导致FP振幅增加(图3A类)持续时间>180分钟。在开始100Hz TBS后，BDNF分泌瞬时增加，并且在刺激结束后5-12分钟内显著升高(图3B类). 我们通过使用TrkB-IgG受体体干扰BDNF的功能。将切片转移到记录室之前，用TrkB-IgG（1μg/ml）培养1h。TrkB-IgG在100-Hz TBS后12分钟保持在灌注培养基中(图3C类). 此外，为了评估LTP维持是否需要观察到的BDNF分泌模式，使用了仅诱导LTP初始阶段的刺激程序。100 Hz的TBS（两组），由两组刺激而不是四组刺激组成，诱导的LTP振幅较小，持续时间≈35分钟(图4A类)并导致BDNF分泌相对少量增加，仅限于单个（1分钟）分数(图4B类). 此外，我们评估了在应用不导致LTP的TBS时BDNF分泌是否不同。25Hz TBS（仅与100Hz TBS的频率不同）不会引起突触强度的任何变化(图4C类)仅诱导BDNF分泌的短时（1分钟）增加(图4D类).

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图3。

基础刺激和LTP诱导TBS期间PRh皮层FPs和内源性BDNF分泌的平行分析(A类)100Hz TBS诱导LTP。这种刺激诱导FP振幅增加，持续时间>180分钟(n个= 6). (B类)实验期间BDNF分泌的时间进程A类100Hz TBS后BDNF分泌迅速增加，高水平持续5-12分钟后降至基础值。单个实验中的100%BDNF浓度如下：166、16、18、73、25和39 pg/ml(C类)通过TrkB-IgG受体体（1μg/ml）的存在来阻止100Hz TBS对LTP的诱导(n个= 5).

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图4。

基础和弱TBS期间PRh皮层FPs和内源性BDNF分泌的平行分析。(A类)由两组而不是四组刺激组成的100-Hz TBS（两组）仅诱导LTP的初始阶段(n个= 8). (B类)实验期间BDNF分泌的时间进程A类100-Hz TBS（两组）导致BDNF分泌少量增加。单个实验中的100%BDNF浓度如下：37、29、79、122、189、20、48和21 pg/ml(C类)25Hz TBS未能诱导LTP。25赫兹TBS与100赫兹TBS的不同之处在于，频率是25赫兹而不是100赫兹。在我们的实验中，这种降低的频率总是不能诱导LTP(n个= 6). (D类)实验期间BDNF分泌的时间进程C类25-Hz TBS导致BDNF分泌量略有增加，仅限于单个（1分钟）收集的部分。单个实验中的100%BDNF浓度如下：61、19、22、82、224和41 pg/ml。

LTD期间内源性BDNF分泌减少。最后一系列实验旨在评估BDNF分泌是否也会随着LTD诱导的PRh皮层刺激而改变。LFS由3000个刺激组成，5 Hz感应LTD(图5A类)持续>180分钟。值得注意的是，LFS也立即诱导BDNF分泌持续减少，在LFS期间持续，然后恢复到基础水平，尽管突触抑制持续存在(图5B类). 当1 Hz 900次刺激诱导LTD持续约40分钟时，观察到BDNF分泌的类似模式(图4C类和D类).

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图5。

在基础刺激和LTD诱导刺激期间，PRh皮层中FPs和灌注介质中内源性BDNF分泌的平行分析。(A类)LTD由5 Hz下3000个刺激的LFS诱发。LTD持续超过180分钟(n个= 6). (B类)实验期间BDNF分泌的时间进程A类LFS立即诱导BDNF分泌减少。BDNF分泌的最大减少发生在LFS的第一分钟内，并持续数分钟后恢复到基础水平。单个实验中的100%BDNF浓度如下：73、39、95、45、224和73 pg/ml(C类)LFS由900个1 Hz的刺激组成，诱导LTD持续≈40分钟(n个= 6). (D类)实验期间BDNF分泌的时间进程C类单个实验中的100%BDNF浓度如下：51、69、221、172、124和91 pg/ml。

讨论

在本研究中，我们解决了BDNF在活动依赖性突触可塑性中调节作用分析中长期缺失的一个环节，即在完整的器官型神经元系统中诱导和维持LTP和LTD期间内源性BDNF分泌的测定。

迄今为止，在活动依赖性突触可塑性的背景下对BDNF分泌的分析主要集中在LTP上，在BDNF过度表达的还原系统中，以“碎片”评估LTP(25,26)或内源性BDNF分泌在高密度培养物中进行测定，培养物保持相对较短的时间（72小时），通过使用长时间的电刺激来阻止完全分化(27). 在这里，我们测定了灌注液中内源性BDNF在相同切片制备中的分泌，我们从中记录了LTP的发生和维持。必须考虑到，灌注液中内源性BDNF的浓度不仅反映突触修饰部位发生的变化。在给定的实验条件下，内源性BDNF分泌的变化被低估，因为刺激介导的BDNF的分泌仅限于刺激电极周围，而整个切片有助于测量BDNF浓度。此外，灌注介质中的BDNF浓度代表了BDNF分泌和与TrkB受体结合后通过内化去除BDNF的平衡。理想情况下，可以通过开发一种检测系统来设想对突触修饰位点的活性依赖性BDNF分泌进行最准确的定量，该检测系统对应于电流法对生物胺的局部定量(31).

我们研究中最显著的观察结果是，持续超过180分钟的刺激诱导LTP会触发BDNF分泌的快速大幅增加，持续5-12分钟(图3B类). 相反，仅诱导LTP初始阶段的刺激程序(图4A类)导致BDNF分泌量的短时（1分钟）增加，幅度小得多(图4B类). 此外，通过TrkB-IgG隔离BDNF可以预防LTP(图3C类). 这些观察结果表明，BDNF是LTP发生所必需的，并且需要延长BDNF高水平分泌的持续时间以维持LTP。通过TrkB受体激活导致翻译的信号通路(32)和转录(33)这一过程可能涉及到法规。我们还发现，未能诱导LTP的刺激参数伴随着BDNF分泌的微小且非常短暂的增加(图4D类). 这种分泌模式可能与仅诱导LTP初始阶段时发生的模式不同，但在我们系统的分辨率范围内无法显示这种差异。

至于BDNF分泌模式延长的机制，可以假设，只有诱导LTP持续>180分钟的刺激才会触发阈值BDNF浓度的分泌，这是激活自身调节机制所必需的，例如BDNF通过TrkB受体介导BDNF的分泌(21,34). 这一过程可能是由自持BDNF分泌所需的临界胞浆钙浓度启动的。这一解释得到了我们实验室先前实验的支持，表明BDNF通过TrkB介导的IP3形成机制快速诱导海马培养物中BDNF的分泌(23)以及随后细胞内储存的钙释放(21,23). 这种正反馈可能持续到反调节机制发挥作用，例如TrkB受体的内化和/或一氧化氮→蛋白激酶G信号诱导的BDNF分泌减少(30).

观察到LTD伴随着BDNF浓度降低，低于基础分泌水平(图5)在某种程度上令人惊讶。然而，以前的研究表明，在视觉皮层中，抗BDNF抗体或TrkB-IgG受体体对BDNF功能的抑制有助于LTD的诱导(12). 相反，外源性BDNF可显著降低大鼠海马和视皮层切片中的LTD(35,36,37). 这些观察结果表明存在一些机制，通过这些机制可以减少突触部位的BDNF数量，从而促进LTD的诱导。在这里，我们提供了证据，证明这种机制存在，并由导致PRh皮层LTD的刺激参数调节。我们发现刺激（5 Hz）诱发LTD持续时间大于180分钟(图5A类)刺激期间BDNF分泌减少(图5B类). 与LTP的情况一样，测定的BDNF浓度变化低估了刺激部位的影响，可能反映了受刺激区域自发BDNF分泌的完全下调。BDNF分泌的类似减少(图5D类)当1-Hz刺激诱导LTD持续≈40分钟时观察到(图5C类)已应用(38). 与LTP不同，LTD的维持似乎不需要BDNF分泌的更长时间变化。观察到的减少不能完全用沉默自发神经元活动来解释，因为1μM TTX仅诱导基础BDNF分泌的轻微减少(图2D类).

补充材料

致谢

笔记

缩写：BDNF，脑源性神经营养因子；FP，场电位；低频刺激；LTD，长期抑郁；LTP，长期增强；神经核抗原；PRh，鼻腔周围；TBS，θ突发刺激；TTX，河豚毒素。

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