代谢型谷氨酸受体5的选择性变构激动和调节：优化临床前神经科学药物发现的意义

摘要

1.简介

近年来，代谢型谷氨酸受体亚型5（mGlu₅)是一种G蛋白偶联受体（GPCR），在大脑中广泛表达，已成为治疗多种中枢神经系统（CNS）疾病（包括精神分裂症、孤独症、帕金森病和抑郁症）的有希望的药物靶点(Gregory等人，2013年c；Nisvender和Conn，2010年). mGlu的药物设计工作₅主要集中于靶向变构位点，即受体结合位点，在地形上与内源性配体不同。变构配体有望提高受体选择性，最大限度地提高治疗效果，并将不良反应降至最低。此外，变构配体在没有内源性激动剂的情况下对正构激动剂进行调节，可以对受体反应进行时空微调，这是复杂CNS环境中的一种良好治疗机制(Christopoulos和Kenakin，2002年；Leach等人，2007年；Melancon等人，2012年). 增强受体反应的变构配体称为正变构调节剂（PAM），而一些变构化合物也可能在缺乏内源性配体（PAM激动剂）的情况下激活受体。与立体定向激动剂类似，PAM激动剂没有时间控制受体活性的益处。减少内源性反应的变构配体被称为负变构调节剂（NAM），既不增加反应也不减少反应的配体被称作中性变构配物（NAL）(Gentry等人，2015年). mGlu的发现工作₅变构调节剂特别有效。不同的调节剂化学类型识别“MPEP”位点，即位于受体七个跨膜束内的变构口袋(Dore等人，2014年；Gregory等人，2014年；Gregory等人，2013年b；Wu等人，2014年). 值得注意的是，mGlu₅PAM（根据谷氨酸对mGlu的刺激进行分类₅-细胞内钙²⁺（国际民航组织）²⁺)重组细胞动员）已证明在精神病临床前模型和认知增强方面的有效性(Kinney等人，2005年；罗德里格斯等人，2010年；Gregory等人，2013年a). 然而，最近的研究也报道了选择性mGlu的不良反应₅增强剂，如VU0424465（一种用于mGlu的PAM激动剂）诱导的癫痫发作活性₅介导的iCa²⁺动员）(Rook等人，2013年)5PAM523（一种用于mGlu的纯PAM）对大鼠的神经毒性₅-国际民航组织²⁺谷氨酸刺激的动员）(Parmentier-Batteur等人，2014年)。

与许多GPCR一样，mGlu也越来越明显₅受体是多效性耦合的，激活多种信号通路。特别是，当受体主要与G偶联时_q个以及随后细胞内钙（iCa）的变化²⁺)动员，mGlu₅iCa夫妇²⁺-独立的信号通路，如细胞外信号调节激酶（ERK）1和2磷酸化、cAMP、mTOR/PI3K，可以与其他GPCR和离子通道相互作用并调节其活性(Sengmany和Gregory，2015年). 因此可以想象mGlu₅不同化学配体的激活可能会产生独特的受体构象，从而使受体有利于不同的生理反应子集。这一概念被称为“偏向性激动症”(Kenakin和Christopoulos，2013年). 偏向性激动剂提供了设计药物的机会，这些药物专门用于激活与治疗结果相关的所需受体反应，同时避免与不良反应相关的反应。偏倚激动剂对相关I组mGlu的正构激动剂有效₁重组和天然表达细胞中G蛋白和β-抑制蛋白途径之间的受体(Emery等人，2010年；Emery等人，2012年；Hathaway等人，2015年). 几项研究表明，mGlu₅偏向性激动可能与不同的生理反应有关(Gregory等人，2013年a；Gregory等人，2012年；Noetzel等人，2013年；Zhang等人，2005年). 然而，绝大多数mGlu₅根据谷氨酸介导的iCa的调节，变构调节剂可分为PAM、PAM激动剂、NAM或NAL²⁺仅动员。到目前为止，还没有对mGlu进行严格的分析₅不同变构调节剂跨不同途径的信号指纹。可能不同mGlu的优先激活或抑制₅信号通路可能导致不同的行为和/或毒理学结果。

一种避免与某些mGlu相关的神经毒性和癫痫发作的方法₅PAM和/或PAM激动剂(Rook等人，2013年；Parmentier-Battur等人，2014年)保持抗精神病和促进认知的作用可能是通过发展有偏见的mGlu₅调制器(Rook等人，2015年). 此外，迄今为止尚未得到认可的偏见可能有助于观察到，在不同的临床前行为模型中，同样的调节剂需要显著不同的剂量才能发挥功效。例如，DPFE、mGlu₅谷氨酸介导的iCa的PAM激动剂²⁺HEK293A细胞中的动员和ERK1/2磷酸化，需要截然不同的剂量才能引起大鼠认知增强和苯丙胺诱导的过度运动的逆转(Gregory等人，2013年a). 因此，在当前的研究中，我们对mGlu进行了第一次严格的分析₅HEK293A细胞和初级皮层神经元培养物中不同PAM的偏倚。变构配体的选择基于i）“MPEP”变构位点的已知相互作用，ii）之前在iCa中被分类为PAM或PAM激动剂²⁺分析和iii）临床前行为模型中的现有数据。在四条信号通路中，相对于正构激动剂DHPG，确定了偏向变构激动剂的倾向，这四条通路在重组细胞和神经元细胞培养中都易于评估。我们证明mGlu₅变构调节剂表现出偏向性激动和协同作用，为偏倚性mGlu的发展提供了证据₅变构调节剂可能是调节mGlu增强的一种手段₅激发治疗有益效果的活动，如抗精神病药和认知增强，同时避免不利影响。

2.材料和方法

3.结果

基于谷氨酸对mGlu的刺激，八种变构配体先前被归类为PAM或PAM激动剂₅-介导iCa²⁺本研究选择代表四种不同化学类型的动员来探讨mGlu的偏向性激动和偏向性调节的可能性₅(补充图1). 在临床前研究中，结构相关的VU0403602和VU0424465已知不良反应责任(Bridges等人，2013年；Rook等人，2013年)并为具有不良特性的调制器提供参考。我们还包括来自该支架的另外两个配体，VU0360172和VU0405398，它们在iCa中与谷氨酸的协同性较低²⁺与VU0403602或VU0424465相比，检测和最小激动(Gregory等人，2012年). CDPPB和VU29作为结构上不同的变构调节剂，来自同一化学类型类别，其中CDPPB被报道为PAM激动剂，VU29为“纯”PAM(Chen等人，2007年；Lindsley等人，2004年). CDPPB之前已经过测试体内在亨廷顿病、恐惧消退、精神病和成瘾模型中显示出疗效(Cleva等人，2011年；Doria等人，2015年；Ganella等人，2014年；Gass等人，2014年；Uslaner等人，2009年). 最近，VU0409551被描述为一种偏置调制器，其基础是VU040.9551正向调制mGlu₅活动在体外但不会增强mGlu₅海马NMDA电流或NMDA受体依赖性可塑性的调节(Rook等人，2015年). 重要的是，VU0409551在抗精神病类活性、认知增强和精神分裂症遗传模型的临床前模型中具有疗效(Balu等人，2016年；Conde-Ceide等人，2015年；Rook等人，2015年). DPFE是与前三类配体相对的一种结构独特的配体，也被纳入其中，以进一步了解化学支架与药理结果之间的关系。与CDPPB和VU0409551一样，DPFE也进行了行为研究(Gregory等人，2013年a；Peters等人，2015年)从而使潜在的体内功效在体外药理学指纹。

我们首先确认了八种变构调节剂中每一种作为谷氨酸刺激mGlu增强剂的药理学表型₅-介导iCa²⁺HEK293A-mGlu动员₅-低细胞。与之前的研究一致，与立体定向激动剂谷氨酸和DHPG相比，VU0424465、VU0403602和DPFE是有效的部分变构激动剂，实现了50-80%的谷氨酸反应的最大反应。VU0360172、VU0409551和CDPPB也是部分变构激动剂。VU29和VU0405398没有明显的变构激动剂活性(图1A和B). 激动剂疗效的排序为：谷氨酸=DHPG>VU0424465>VU0.403602>DPFE≥VU0409551>VU0360172>CDPPB（参见补充表1对于E_最大值值）。激动剂效力的等级(补充表1)是：VU0403602>CDPPB≥VU0424465>谷氨酸>VU0360172>DHPG=VU0409551>DPFE。

在单独的窗口中打开

图1

微克葡萄糖₅变构配体对iCa具有激动活性²⁺动员，IP₁HEK293A-mGlu中ERK的积累和磷酸化₅-低

指示mGlu的浓度响应曲线₅iCa的正构和变构配体²⁺动员（A&B），IP₁累积（C&D）、ERK1/2磷酸化（E&F）和iCa²⁺在缺乏1.2mM CaCl的情况下动员₂（G&H；%glu-max表示在1.2mM CaCl存在下的最大谷氨酸反应_2,面板A的曲线以灰色显示）。在面板B、D、F和H中，DHPG曲线绘制为虚线，以便于参考。反应标准化为谷氨酸最大反应（iCa²⁺动员）或表现为基底折叠（IP₁积累和ERK磷酸化）。IP（IP）₁和ERK1/2磷酸化实验在10 U/mL GPT存在下进行，以最小化环境谷氨酸的贡献。数据表示为重复进行的3-17次实验的平均值+扫描电镜，未显示的误差条位于符号的尺寸范围内。

所有八种化合物与谷氨酸对iCa均具有不同程度的正协同性（logβ）²⁺动员，导致浓度依赖性谷氨酸效价增加接近极限(补充图1). iCa谷氨酸浓度响应曲线的调节剂效应²⁺动员符合变构作用的操作模型，以量化功能亲和力（pK_B类)和每个配体的功效调节（logβ）(表1). 由此得出的亲和力和合作性估计与先前研究中确定的一致(Bridges等人，2013年；Gregory等人，2013a；Gregory等人，2012年；Manka等人，2010年)。

3.1. 选择mGlu₅PAM显示mGlu增强的“探针依赖性”₅-国际民航组织²⁺动员

虽然谷氨酸是同源激动剂，但它是研究mGlu作用的次优配体₅由于这些天然细胞中存在多种谷氨酸受体亚型和转运体，因此在原代神经元培养中单独存在。因此，我们选择了更具选择性的DHPG作为参考正位激动剂，用于评估原代神经元培养中的配体药理学。我们首先证实，所有八种变构配体都增强了DHPG介导的iCa²⁺HEK293A-mGlu动员₅-低细胞。iCa的DHPG浓度响应曲线²⁺在没有或存在不同浓度的变构配体时的动员(图2)使用变构作用操作模型进行分析。正如预期的那样，无论使用哪种正构激动剂，亲和力估计值都是相似的(表1). 与DHPG相互作用的合作度估计值（logβ）也与VU0403602、VU0360172、VU0409551和CDPPB的谷氨酸测定值相似。相比之下，VU0424465、DPFE或VU0405398与DHPG的协同作用是与谷氨酸的2倍。与谷氨酸相比，VU29与DHPG的正合作性高5倍。

在单独的窗口中打开

图2

DHPG刺激iCa的变构调节²⁺HEK293A-mGlu动员₅-低细胞

iCa的DHPG浓度响应曲线²⁺在没有或存在指定浓度的变构配体的情况下进行动员。通过同时添加两种配体，对DPFE、VU0409551、VU0.424465和VU0403602进行相互作用研究，以最大限度地减少因内在激动剂活性引起的变构配体诱导的急性脱敏。在添加谷氨酸前1分钟添加VU29、VU0405398、CDPPB和VU0360172。数据集被全局拟合到变构作用的操作模型，以评估亲和力和合作性。曲线表示数据的最佳拟合。数据为n=3–10个重复实验的平均值+SEM。未显示的误差线位于符号的尺寸范围内。

3.4. mGlu激动剂活性的评估₅皮层神经元中的变构配体

mGlu的四个测量值相同₅我们在重组细胞中研究的活性随后在皮层神经元中进行了检测，以评估天然系统中有偏向的变构激动剂活性的潜力(图3). 皮层神经元代表一个评估mGlu的生理相关系统₅变构配体活性，并且可以作为在临床前评估之前验证变构调节剂药理学的重要翻译环节。消除mGlu的影响₁mGlu也表达于皮层₁选择性负变构调节剂CPCCOEt 30μM与DHPG联合用于皮层神经元的所有实验。GPT对基础IP无影响₁变构激动水平(补充图3)并且不包括在这些实验中。

在单独的窗口中打开

图3

微克葡萄糖₅变构配体对iCa具有激动活性²⁺动员，IP₁培养皮层神经元中ERK的积累和磷酸化

指示mGlu的浓度响应曲线₅iCa的正构和变构配体²⁺动员（A&B），IP₁累积（C&D）、ERK1/2磷酸化（E&F）和iCa²⁺在缺乏1.2mM CaCl的情况下动员₂（G&H；%DHPG max表示存在1.2mM CaCl时的最大DHPG响应₂，面板A的曲线显示为灰色）。在面板B、D、F和H中，DHPG曲线绘制为虚线，以便于参考。将反应标准化为谷氨酸最大反应（iCa²⁺活动）或表示为折叠基底（IP₁积累和ERK磷酸化）。所有分析均在30μM CPCCOEt的存在下进行，以消除mGlu的作用₁数据表示为重复进行的3–22个实验的平均值+SEM，未显示的误差条位于符号的尺寸内。

DHPG对IP的效力低约10倍₁相对于iCa的累积²⁺（在缺乏或存在1.2 mM细胞外钙的情况下²⁺)和ERK1/2磷酸化(补充表3). 在iCa中²⁺与DHPG、VU0424465和VU0403602相关的动员试验几乎是完全激动剂，而VU0360172、DPFE、VU29和CDPPB都是部分激动剂(图3A、B,补充表2). VU0405398也显示出激动剂活性，然而，最大反应高度可变，且仅限于3μM以上的浓度。VU0409551对iCa没有明显的激动剂活性²⁺动员。激动剂效力的等级顺序为：DHPG>VU0424465=VU0403602>CDPPB=VU29=VU0360172>VU0405398\VU0409551，与在HEK293A细胞中观察到的不同。

对于IP₁累积-变构配体的相对功效与iCa类似²⁺检测，但VU0409551除外，其对IP具有明显的激动剂活性₁堆积(图3C–D). mGlu的时间进程₅-由正构和变构配体介导的ERK1/2磷酸化在皮层神经元中表现为持续升高或抑制，这与HEK293A细胞中观察到的瞬时反应有显著不同(补充图4). VU0424465、VU0403602、VU0360172、VU29、CDPB和VU0409551均为皮层神经元pERK1/2的激动剂，对类似DHPG的反应最大(图3E-F). 变构激动剂（iCa²⁺、pERK1/2和IP₁)预先暴露于mGlu可抑制皮层神经元₅选择性中性别构配体5MPEP证实激动剂是通过与mGlu的相互作用介导的₅(补充图5). 有趣的是，虽然DPFE和VU0405398是IP的部分激动剂₁在积累时，它们对pERK1/2表现出钟形的浓度-反应关系，在1μM时pERK1/2升高，在1μM以上的浓度时降至基础水平以下(图3E-F). 与HEK293A-mGlu中的观察结果类似₅-低细胞，在缺乏细胞外钙的情况下，DHPG最大反应显著降低(图3G). VU0424465、VU0403602、VU0360172或CDPPB在不同钙条件下的效力或最大反应没有显著差异(图3G–H). 然而，VU29、DPFE和VU0405398的激动剂活性丧失。

3.5. 微克葡萄糖₅变构配体是偏向性激动剂

为了严格定量地评估mGlu的表观偏差₅HEK293A-mGlu中的变构激动剂₅-低细胞和皮层神经元、分析之间的观察偏差以及细胞背景的系统偏差应最小化，从而对真正的（构象驱动的）偏向激动剂进行更准确的评估(Kenakin等人，2012年). 在每次分析中，转导系数对数（τ/K_A类) (补充表4)即配体功效和亲和力的复合物，如前所述导出(Kenakin等人，2012年)并归一化为参考配体DHPG（Δlog（τ/K_A类)). Δlog（τ/K）的后续归一化_A类)路径之间，ΔΔlog（τ/K_A类)，允许量化路径之间的偏差程度(图4). 每个变构配体在HEK293A-mGlu中都显示出独特的信号偏倚指纹₅-低细胞和低神经元，尽管有一些显著的趋势。相对于DHPG，VU0424465显示出明显偏离iCa的偏差²⁺动员和朝向IP₁HEK293A-mGlu中的积累（110倍）和ERK1/2磷酸化（9倍）₅-低细胞，主要保留在神经元中。VU0403602偏向IP₁pERK1/2（11倍）和iCa²⁺HEK293A-mGlu动员（14倍）₅-低细胞，但这在神经元中没有反映出来。VU29和CDPPB偏向IP（3–25倍）₁超过pERK1/2和/或iCa²⁺HEK293A细胞和神经元的动员。DPFE、VU0409551和VU0405398在HEK293A细胞中无明显偏倚，但在皮层神经元中有明显的偏倚指纹。VU0405398和DPFE偏向IP₁iCa上²⁺（分别为12倍和26倍）与无法使用操作模型进行分析的双相pERK1/2响应耦合。VU0409551是唯一一个在IP₁皮层神经元中pERK1/2。

在单独的窗口中打开

图4

微克葡萄糖₅变构配体是HEK293A-mGlu中相对于DHPG的偏向性激动剂₅-低层和皮层神经元

转导系数（log（τ/K_A类))是通过应用方程式3HEK293A-mGlu中激动剂浓度响应曲线₅-低（A，曲线图1)和皮层神经元（B，曲线图2)并归一化为DHPG（Δlog（τ/K_A类)). 为了计算不同路径之间不同配体的明显偏倚程度，Δlog（τ/K_A类)值之间相减ΔΔ（log（τ/K_A类))以确定对数偏差系数。Δlog数据（τ/K_A类)表示平均值±SEM，而对数偏差估计值仅为平均值。*表示与Tukey后验的单向方差分析存在显著差异，p<0.05。

3.6. CDPPB、DPFE、VU0405398是皮层神经元DHPG的有偏变构调节剂

我们无法进行调节剂与DHPG之间的相互作用研究，以量化HEK293A-mGlu中的亲和力和合作性₅-低细胞，因为IP的强效激动剂₁每个变构配体在其自身的权利中显示了积累和ERK1/2磷酸化。然而，在皮层神经元中，一些变构配体具有最小或部分的激动剂效应，因此仍有足够的反应窗口，以允许在此生理相关系统中与DHPG进行变构相互作用实验。因此，IP的DHPG浓度响应曲线₁和iCa²⁺在不存在和存在浓度增加的VU0360172、VU29、CDPPB、DPFE、VU0409551或VU0405398的情况下，使用变构的操作模型进行构建和分析(图5,补充图6). 除VU0405398外，两条通路上的变构配体的亲和力估计值相似，VU04005398在IP中具有较高的亲和力₁化验，化验(表1). 对于所有六种变构调节剂，IP的logβ值较低₁与iCa相比²⁺(图5D); 这对DPFE（3.8倍）、VU0360172（3.6倍）、VU0409551（6.5倍）和VU0405398（2.8倍）而言意义重大。鉴于VU0360172、VU0405398和DPFE也是ERK1/2磷酸化的部分激动剂，我们评估了这三种调节剂对DHPG浓度-反应曲线的调节。在皮层神经元中，VU0360172是一种PAM激动剂，用于DHPG刺激的ERK1/2磷酸化，具有相似的亲和力和协同性估计（pK_B类：6.49±0.20和logβ：0.69±0.18）与iCa中测定的值²⁺化验(图5D). 相反，DPFE和VU0405398在ERK1/2磷酸化中表现出独特的钟形调节反应。虽然每种配体中1μM增强了DHPG反应，但每种配体中10μM导致了对ERK1/2磷酸化的DHPG最大反应降低(图5)。

在单独的窗口中打开

图5

微克葡萄糖₅变构配体是天然皮层神经元DHPG反应的偏置调节剂

iCa的DHPG浓度响应曲线²⁺动员（A），知识产权₁VU0360172和DPFE存在和不存在时的累积（B）和ERK1/2磷酸化（C）。VU0360172和DPFE均使iCa的DHPG效价发生左移²⁺和IP₁分析。数据集被全局拟合到变构作用的操作模型，以评估亲和力和合作性。曲线表示数据的最佳拟合。在ERK1/2磷酸化分析中，DPFE产生了1μM的左移，但在10μM时降低了DHPG的最大反应。D） 绘制变构配体的协同性估计值（Logβ），以便比较不同途径的调节。对于显示混合调节活性的DPFE和VU0405398，Logβ值绘制为零，以突出隐含偏差；在这种情况下，绝对数值没有意义。数据是重复进行的n=3-9个实验的平均值±SEM。未显示的误差线位于符号的尺寸范围内。

4.讨论

mGlu的变构调节剂₅为众多精神和神经疾病的治疗提供了相当大的治疗潜力。特别是mGlu₅PAM已证明在精神病、认知增强和NMDA受体功能减退的临床前模型中有效(Ayala等人，2009年；Gregory等人，2013年a；Horio等人，2013年；Rook等人，2015年；Uslaner等人，2009年). 然而，最近的一些研究报告了选择性mGlu的不良反应₅变构调节剂(Rook等人，2013年；Parmentier-Battur等人，2014年). 因此，为了实现mGlu的治疗潜力₅变构调节剂，需要更好地了解变构药物的全部作用范围。我们检验了这样一个假设，即结构多样的PAM具有未被重视的偏见药理学。我们发现mGlu₅变构配体在重组系统和天然系统中都有不同的偏倚信号指纹。此外，这种偏倚还延伸到了对正构激动剂活性的调节，变构配体和正构配体之间的协同作用程度因受体活化程度的不同而不同。不同mGlu的偏向性激动剂和调节的流行率₅PAM化学型突显出我们对mGlu功能后果的认识不足₅变构调节，为治疗发现开辟了新途径。更好地了解mGlu的全部功能₅变构调节剂的作用，可能将特定通路的激活（和/或增强）与不同的生理结果联系起来，以促进治疗效果并避免不良反应。

特别是，许多研究的mGlu₅变构配体，以前主要根据谷氨酸刺激的iCa的调节进行分类²⁺动员，显示出与iCa的偶联效率的显著差异²⁺动员，IP₁积累和ERK1/2磷酸化。最引人注目的是，每个测试的变构配体对IP都有更大的疗效₁相对于iCa的累积²⁺动员。因此，测试的配体不能被视为纯mGlu₅PAM，不具备纯变构调节剂的安全优势，即受体反应和饱和效应的时空微调优势。经典的iCa²⁺动员被认为是肌醇磷酸水解的下游，然而，我们的数据表明₁积累不一定导致iCa²⁺通过mGlu动员₅。IP之间的这些差异可能₁和iCa²⁺与这两种分析的响应耦合测量的不同动力学有关。瞬时iCa中变构配体相对于正构激动剂缺乏平衡²⁺检测也可能是一个促成因素。事实上，分析和配体之间的潜在时间差异影响多巴胺D2受体的偏倚，因此动力学背景也可能在理解偏倚激动剂方面发挥关键作用(Klein Herenbrink等人，2016年). 然而，人们普遍认为mGlu₅受体与各种钙通道耦合(Gao等人，2013年；Kammermeier等人，2000年；Lu等人，1999年；McCool等人，1998年；Ribeiro等人，2010a；Tu等人，1999年)从而产生Ca²⁺从细胞内和细胞外储备动员。为了区分钙的来源²⁺，我们比较了iCa²⁺有无1.2 mM Ca时的动员²⁺在HEK293A-mGlu中₅-低细胞。有趣的是，在缺乏细胞外钙的情况下，谷氨酸和DHPG降低了最大反应²⁺，均研究了mGlu₅变构配体不受影响。通过应用严格的分析方法量化偏差，我们发现VU0424465在IP₁和细胞外钙²⁺-免费iCa²⁺分析（20倍）和IP之间₁和iCa²⁺分析（110倍）。这些数据表明，变构激动剂与不同的效应剂互补，而非正构激动剂，以影响细胞内钙²⁺水平。

我们的数据清楚地表明，mGlu中的变构调节剂活性₅-国际民航组织²⁺动员试验不一定能预测其他mGlu的活性₅-中介效应。我们的数据有助于越来越多的证据表明代谢性谷氨酸受体（包括mGlu）存在偏向性激动剂₁(Emery等人，2012年；Hathaway等人，2015年)和III组mGlu受体(Jalan-Sakrikar等人，2014年). 此外，我们观察到mGlu增强的探针依赖性₅-国际民航组织²⁺HEK293A细胞的动员，其中选择的变构配体的协同作用大小取决于存在的正构激动剂。之前未观察到mGlu的探针依赖性₅然而，已知其他mGlu亚型普遍存在(Jalan-Sakrikar等人，2014年). 探针依赖现象是一个关键的考虑因素，尤其是在从在体外对天然制剂的分析，如切片电生理学，其中经常使用替代激动剂。有趣的是，尽管与谷氨酸相比，VU29与DHPG具有更高的正协同作用，但CDPPB在类似程度上增强了这两种激动剂。同样，对于所研究的三种吡啶酰胺乙炔，VU0424465和VU0405398与DHPG和谷氨酸具有不同的协同性，而VU0403602没有。这些数据表明，所观察到的探针依赖性与特定的化学类型无关，或者来自同一支架的配体之间不一致。

当从重组系统转移到生理相关系统时，探针依赖性是一个重要的考虑因素，而细胞背景本身的变化可能是理解药物药理学的一个混淆因素。事实上，在这项研究中，我们观察到mGlu的时间分布存在明显差异₅-HEK293A-mGlu之间ERK1/2磷酸化₅-低层和皮层神经元。而ERK1/2磷酸化在HEK293A-mGlu中是暂时的₅-皮层神经元低细胞pERK1/2水平在30min内保持升高。这些数据表明，不同的细胞内效应器正在调节pERK1/2以响应mGlu₅皮层神经元与HEK293A细胞的激活。此外，持续的配体诱导反应表明，在配体空出受体后，受体激活的后果将继续存在。细胞环境也可能驱动mGlu的差异性分区和/或内化₅在这两种细胞类型中。值得注意的是，50-80%的mGlu₅受体被认为位于细胞内膜上(Hubert等人，2001年；Kumar等人，2008年)和mGlu的亚细胞定位₅可以决定整个细胞的反应(Jong等人，2009年; Kumar等人，2012年）。mGlu是否₅测试的变构配体穿过质膜，诱导受体内化或与受体内化。DHPG不活跃地跨膜转运，只激活细胞表面的受体(Jong等人，2009年)这表明皮层神经元持续的pERK1/2反应来源于细胞表面受体，然而，持续的信号可能是由内胚体内的内化细胞表面受体驱动的。

对所有八种变构配体的偏倚激动剂信号指纹图谱的比较表明，VU0424465在HEK细胞和神经元培养物中具有最大的差异。我们早期的研究与VU0424465内在疗效（mGlu₅-国际民航组织²⁺HEK细胞内）致癫痫发作和行为性惊厥(Rook等人，2013年). 然而，将VU0424465与DPFE、VU0409551和CDPPB这三种配体的偏倚信号指纹图谱进行比较，这三种配体在认知和精神病模型中有效，但未见不良反应报告(Gregory等人，2013年a；Uslaner等人，2009年；Balu等人，2016年；Rook等人，2015年)，表明VU0424465对IP的明显偏向（10–100倍）₁和相对于iCa的ERK1/2²⁺在HEK293A-mGlu中₅-低细胞可能是不良反应责任的更好预测。值得注意的是，在皮层神经元中进行的所有实验都是在CPCCOEt（一种mGlu₁负变构调节剂）以消除mGlu的DHPG激活₁然而，mGlu₁和mGlu₅已知会异构化(Sevastyanova和Kammermeier，2014年). 代谢型谷氨酸受体（mGlu）的异构化₂和mGlu₄)可以影响变构调节剂药理学(Yin等人，2014年). 在未来，确定mGlu是否₁/微克葡萄糖₅杂合物影响mGlu的偏倚激动剂₅选择性PAM激动剂。了解不同配体的偏倚特征，并将其与已知的临床前特征联系起来，为设计避免与不良反应相关的信号通路的治疗方法提供了机会。

我们发现HEK293A-mGlu之间的变构配体偏置谱不同₅-低细胞和皮层神经元培养。值得注意的是，VU0409551是唯一一个明显偏离pERK1/2（相对于IP）的配体₁)iCa缺乏激动剂疗效²⁺皮层神经元的活动。这些数据与之前的报告一致，即VU0409551作用于mGlu₅不会增强NMDA通道电流(Rook等人，2015年)或长期给药时刺激海马或前额叶皮层的pERK1/2水平(Balu等人，2016年). 有趣的是，DPFE和VU0405398对皮层神经元ERK1/2磷酸化有明显不同的浓度-反应关系，引起双相反应。虽然VU0405398尚未测试体内，DPFE具有独特的临床前疗效。认知增强需要相当低剂量的DPFE（0.56mg/kg），而逆转苯丙胺诱导的过度运动需要>10mg/kg(Gregory等人，2013年). 相反，CDPPB的认知研究(Horio等人，2013年；Stefani和Moghaddam，2010年)已经证明，在逆转苯丙胺诱导的过度运动所需剂量相似的情况下具有疗效(Kinney等人，2005年). 很容易推测，DPFE和VU0409551相对于pERK1/2的不同耦合剖面可以预测体内偏向认知增强的疗效。

除了偏向性激动外，还证明了不同mGlu的偏向性调节₅皮质神经元中的变构配体。偏向性调节可能对中枢神经系统药物更有利，而不是直接激活受体，因为它可以更好地控制基础谷氨酸张力。多项研究表明，不同的mGlu₅效应物和第二信使在不同的中枢神经系统疾病中可能受到干扰。例如，mTOR和Akt信号中断与严重抑郁症和自杀有关(Dwivedi等人，2010年；Jernigan等人，2011年)而基础pERK1/2、Akt和IP改变增加_三/国际民航组织²⁺在亨廷顿病小鼠模型中观察到信号传导(Bezprozvanny和Hayden，2004年；Ribeiro等人，2010b；Tang等人，2005年). 因此，偏置调制可以提供调节mGlu增强或抑制的方法₅对与不同疾病状态相关的效应物的活性。

总之，我们已经确定了几种mGlu的信号指纹₅iCa的变构配体²⁺动员，IP₁在重组和天然系统中的积累和ERK1/2磷酸化。探针依赖性、偏置激动剂和偏置调制在该受体上起作用。重要的是，分歧最大的偏倚曲线与之前显示具有不同偏倚特征的配体有关体内疗效简介。神经科学相关疾病的药物发现继续面临着高消耗率，这在很大程度上是因为无法将有希望的临床前药理学特征转化为临床有效的治疗方法。我们的研究结果表明，未经认可的有偏见的激动剂和/或调节可能导致这些失败，并强调需要检查受体活性的多种测量方法，以最佳地分类配体的药理学。未来，这些有偏差的信号指纹可能会提供一个框架，用于合理开发mGlu₅最优变构配体在体外在临床前模型中转化为理想活动并避免靶向不良反应的概况。

补充材料

致谢

缩写

脚注

工具书类