PP2A在ARF信号转导至p53中的作用

摘要

ARF–p53肿瘤抑制通路是细胞抵抗激活的细胞和病毒致癌基因诱导的非受控细胞分裂刺激的主要防御机制之一(1–5). ARF和/或p53在70%以上的人类癌症中发生突变。癌基因对生长促进细胞信号通路的不当激活可导致ARF的诱导。ARF的表达可激活p53，导致凋亡细胞死亡或细胞周期阻滞。ARF–p53通路的调控机制仍有待精确阐明。

这些小DNA病毒对它们调节的许多细胞信号通路提供了很好的见解。在感染周期中，它们克服了细胞调节控制系统，激活了病毒DNA合成和病毒组装所需的信号通路。这些细胞生长信号的非计划激活激活ARF，从而激活p53，导致流产感染。为了抵消这种结果，大多数DNA病毒编码抑制p53功能的蛋白质。大多数病毒蛋白直接靶向p53。例如，SV40大T抗原与p53结合并抑制其转录因子活性(6–8). 腺病毒E1B 55K和HPV E6与p53结合，与其他蛋白质协同，阻断其功能并导致其降解(9–15).

多瘤病毒（Py）的罕见之处在于其早期区域蛋白、大T抗原（PyLT）、中T抗原（CyMT）和小T抗原（PiST）均未与p53结合(16). 我们之前已经证明Py癌基因PyMT激活ARF和p53，因此不会转化含有完整ARF–p53通路的原代小鼠细胞和REF52细胞(17). 当p53或ARF失活时，PyMT会改变这些细胞类型(17,18). PyMT还将转化PyLT和PyST也表达的原代小鼠和REF52细胞(19,20). 在这些转化细胞中，野生型ARF大量表达，但野生型p53水平较低(17,18). 这一发现表明PyLT和/或PyST阻止ARF激活p53。在本文中，我们确定并定义了哪种Py蛋白及其功能参与了废除这一关键调控步骤。

材料和方法

细胞培养和转染。REF52和Rat-1是建立的大鼠胚胎成纤维细胞系，见参考文献。17,18、和21用pBabehygro-p53感染REF52细胞，建立DNp53REF52的细胞系^302–390(18). 用含有野生型Py或bc1051突变体的pAT153质粒转染PyREF52和bc1051 REF52细胞后生成(18,22). 所有细胞系均在补充有10%FCS、100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中常规培养。根据制造商的说明，所有转染都是通过使用FuGENE 6（Roche Diagnostics）在六孔板的每孔中使用2μg DNA进行的。转染6小时后，将每个转染孔的细胞转移到三个60cm的培养皿中，每3-4天更换一次培养基。转染Rat-1和DNp53REF52细胞生长10–12天后，转染REF52的细胞生长≈20天后，用0.5%结晶紫在10%甲醇中染色，并评估转化灶的数量。

J结构域和PP2A突变体的产生。参考文献中描述了k45Q和Del 42HPDKGG47 J结构域突变体和Ins 107AL PP2A结构域突触的产生和性质。23根据制造商的说明，使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）将这些突变并入含有bc1051基因组DNA或PyST cDNA的pAT153质粒。

蛋白质的Western Blot分析。细胞直接从Nonidet P-40裂解缓冲液（1%Nonide P-40/20 mM Tris·HCl，pH 7.5/150 mM NaCl/25 mM NaF/1 mM EDTA/完整的微型蛋白酶抑制剂混合物）中的培养物中裂解。蛋白质浓度通过使用Lowry蛋白质分析和DC蛋白质分析试剂（Bio-Rad）测定。将所有蛋白质样品加载到4–20%梯度Tris-glycine凝胶上进行SDS/PAGE，但要分析ARF的样品除外，这些样品使用16%Tris-glucine凝胶（Invitrogen）分离。使用Bio-Rad Mini-Trans-Blot系统在90 V下将蛋白质立即转移到聚偏二氟乙烯膜（Fisher）上90分钟。使用5%牛奶（Bio-Ra德）在含有吐温20（TBST）的Tris-buffered生理盐水中，在4°C下轻轻摇晃，隔夜培养，从而阻断膜。使用以下抗体对膜进行检测：Py T抗原的PYC、ARF的兔多克隆821B6、β-肌动蛋白（Sigma）、p21单克隆抗体（Pharmingen）、MDM2的2A9、2A10和4B2，以及p53的CM5（英国纽卡斯尔诺沃卡斯特拉）。所有抗体在5%牛奶/TBST中孵育1.5小时，并在室温下轻轻摇晃。然后用TBST冲洗膜，并将其与辣根过氧化物酶结合的相应二级抗体、大鼠、兔子、山羊或小鼠（Jackson ImmunoResearch）孵育，将其在5%牛奶/TBST中稀释1 h，在室温下轻轻摇晃。根据制造商的协议，使用ECL试剂（Amersham Biosciences）和Hyperfilm MP（Amersham Bioscinces）进行检测。

免疫荧光。细胞被放置在六或八周的Lab-Tek载玻片（Nalge-Nunc）中，并允许其生长到所需的汇合处。用4%多聚甲醛（电子显微镜科学）固定1h，然后用1%Triton X-100在PBS中渗透10min。用5%驴血清（Jackson ImmunoResearch）在PBS内封闭1h。将初级抗体孵育1h，并在5%驴血清中稀释。用762抗体（伦敦帝国理工学院Steve Dilworth赠品）检测Py T抗原，用兔多克隆821B6抗体检测ARF。冲洗细胞，应用适当的二级抗体（分子探针），并将处理过的细胞孵育30分钟。抗体与荧光团结合，用徕卡DM RXA荧光显微镜结合蔡司软件和灯进行免疫荧光检测。图像是使用滨松数码相机拍摄的。

结果

PyST抑制ARF激活p53。初步实验表明，PyLT在转化REF52细胞的能力上并不能补充PyMT（数据未显示）。这一发现与之前的发现一致，即PyLT和PyMT并没有转化原代小鼠细胞(19,20). 因此，我们评估了PyST在REF52细胞转化中是否能够补充PyMT。我们最初使用的是bc1051 Py突变体，在该突变体中，PyLT的剪接受体被破坏，导致PyLT表达缺失，而不会损害PyMT和PyST蛋白的生产和功能(22). REF52细胞容易被bc1051基因组DNA转化(图1一个)和预期一样，这些转化的细胞只含有PyMT和PyST蛋白（图。​（图1B类1B类和​和2一个).2一个). bc1051转化的REF52细胞（bc1051 REF52）与表达PyLT、PyMT和PyST的完整Py早期区域转化的REV52细胞相似，其中含有ARF（图。​（图1B类1B类和​和2B类)2B类)和低水平的p53(图2C类). bc1051和Py转化的REF52细胞中的p53都有功能，因为它可以被稳定下来，并且可以在阿霉素损伤DNA后激活其p21和MDM2下游基因(图2C类). bc1051转化的REF52细胞中的ARF定位于核仁内(图1B类)，如在PyREF52细胞中观察到的(17).

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图1。

转化bc1051（PyMT+PyST）REF52细胞中的ARF位于细胞核中。(一个)左边是未转化REF52细胞的显微照片，这些细胞具有正常的形态，并且高度接触抑制。右侧显示由bc1051多瘤突变株转化的REF52细胞（bc1051 REF52），该突变株只表达PyMT和PyST(22). bc1051 REF52细胞具有转化的形态，并且不受接触抑制。(B类)免疫荧光染色分析转化bc1051 REF52细胞中Py T抗原和ARF的定位。在左侧，用762抗多瘤共同区域抗体（Py）检测膜结合的PyMT和核质小T抗原，并用绿色（FITC）染色。右侧，用821B6抗体检测位于核仁中的ARF，并用红色（德克萨斯红）染色。

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图2。

经PyMT和PyST转化的REF52细胞激活ARF，但不激活p53。(一个)野生型Py DNA转化的REF52细胞表达PyLT、PyMT和PyST，而bc1051突变DNA转化的细胞（bc1051 REF52）在LT剪接供体位点含有突变(22)，仅表示PyMT和PyST。所示为两个不同的转化PyREF52分离株和三个不同的bc1051 REF52细胞分离株的提取物的西方分析，用检测PyLT（LT）、PyMT（MT）和PyST（ST）中常见氨基酸序列的PYC抗体进行探测。(B类)只有PyMT和PyST转化的REF52细胞（bc1051 REF52）含有ARF。对未转化的REF52细胞、用野生型Py表达的PyLT、PyMT和PyST转化的PyREF52的两个不同分离物以及用只表达PyMT与PyST的bc1051突变转化的两个细胞分离物（bc1051 REF52）进行西方分析（见一个)用兔抗大鼠ARF多克隆血清821B6进行检测。ARF数量的差异很可能是由于PyMT诱导的激活不同Py转化细胞克隆株中ARF的细胞信号水平的差异。(C类)由Py野生型（PyREF52）或bc1051突变型（bc1051 REF52。来自一个转化的PyREF52细胞系、一个分离的转化的bc1051 REF52和未转化的REF52的细胞在存在或不存在DNA损伤剂阿霉素的情况下培养7小时，然后通过Western分析评估是否存在p53、p21和MDM2。

这些数据表明，PyST足以阻止PyMT诱导的ARF激活p53。PyST包含两个已知的域。一个是结合Hsc70分子伴侣的J结构域(24,25)另一个是PP2A结构域，它允许PyST模拟PP2A B亚单位并结合到由A和C亚单位组成的核心PP2A二聚体(26,27). PyMT包含与PyST相同的J和PP2A结构域（PyST序列195个氨基酸中的191个也存在于421-aa PyMT蛋白质中），但这两种蛋白质的细胞位置不同。PyMT位于质膜中，而PyST同时存在于细胞质和细胞核中(28).

Py J结构域的失活不能阻止PyMT诱导ARF或PyST抑制ARF激活p53。为了确定PyST的哪种功能参与ARF消除p53激活，在bc1051突变基因组DNA背景中产生PyST和PyMT的J结构域和PP2A结构域的突变。J结构域中的突变涉及氨基酸45的K变为Q（K45Q）或含有完整J结构域结合位点的氨基酸42–47（HPDKGG）的缺失，但不会抑制REF52细胞的转化，DNp53REF52细胞（其中内源性大鼠p53的功能被显性阴性p53抑制的REF52）或rat-1细胞[缺乏内源性ARF(17)并包含在其p53途径中，因为p21不表达(21)] (图3).

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图3。

PyMT诱导ARF或PyST阻断ARF对p53的信号传导不需要J结构域。将J和PP2A结构域中的突变并入bc1051基因组DNA中，并测试其对REF52细胞、DNp53REF52（REF52包含显性阴性p53）和Rat-1细胞（其中ARF和p21均不表达，导致p53反应受损）的转化能力。显示了转染bc1051基因组DNA和包含各种J结构域和PP2A突变的bc1051基因DNA的每微克转化菌落数。J结构域突变是用J结构域结合区（K45Q）中45个氨基酸的Q取代K，或者是含有完整J结构域绑定区（Del 42HPDKGG47）的42–47个氨基酸的缺失。PP2A结构域通过在氨基酸107（Ins 107AL）处插入一个AL而发生突变，之前已经证明该氨基酸可以灭活Py T抗原结合PP2A的能力(23). 由于使用了基因组DNA，突变位于中间T抗原（MT）和小T抗原（ST）编码区。在顶部，显示了从bc1051基因组DNA生成中小型T抗原的不同剪接，以及常见J和PP2A结构域区域中突变的位置。数字表示不同蛋白质的氨基酸序列。还显示了唯一的中间T抗原和小T抗原编码区的位置。

REF52细胞与原代细胞相似，含有完整的ARF–p53通路。DNA转染后，REF52细胞中产生的转化集落比p53途径受损的细胞中产生的转化集落更少，出现的时间更长(图3). 最有可能的是，这种较低的转化率是由于REF52细胞无法完全从p53激活的后果中恢复过来，这是由于转染将大量受损的DNA引入细胞而引起的DNA损伤反应。

在由含有J结构域突变的bc1051基因组DNA转化的细胞中，ARF丰富，p53最少，与由未突变J结构域的bc1051基因组DNA转化细胞相似（图。1B类和C类和​和2）。2). 这些数据表明，使PyMT的J结构域失活的突变不会抑制PyMT诱导ARF的能力，而使PyST J结构域失去活性的突变不会影响PyST阻断ARF信号传导至p53的能力。

PP2A在ARF向p53发出信号中起作用。指定bc1051 PP2A结构域的基因组序列中的突变影响PyMT和PyST，并且在REF52细胞以及包含显性阴性p53和缺乏功能性ARF和p21基因的Rat-1细胞的REF52中转化不足(图3). 这是因为PP2A亚单位A和C与PyMT的结合是SRC家族激酶与PyPT稳定结合所必需的(29). 一旦结合，这些细胞激酶可以磷酸化PyMT酪氨酸250、315和322，允许细胞蛋白与这些磷酸化酪氨酸结合，导致细胞PI3激酶、PLC-γ和RAS激活的RAF→MEK→ERG信号通路的非计划激活，从而导致细胞转化(28). 因此，为了评估仅影响PyST PP2A结构域的突变的影响，我们评估了野生型或突变型PyST cDNA与野生型PyMT cDNA共同转染后REF52细胞的转化。图4显示了每微克转染DNA的平均转化菌落数，该DNA来源于三种不同的转染。在J结构域突变的野生型PyST cDNA和PyST基因cDNA都能够补充野生型PyMT，用于REF52细胞的转化，而在PP2A结构域中突变的PyST无法与野生型Py基因cDNA一起生成转化的REF52肿瘤细胞(图4). 缺乏转化不是因为PP2A PyST突变株的毒性，因为我们可以很容易地分离出含有这种PyST变异株的REF52细胞，当与抗生素耐药标记物连接时（数据未显示）。这些结果确定PyST的PP2A结构域在ARF依赖性介导的p53激活中发挥作用。

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图4。

PyST需要PP2A结构域来阻断ARF对p53的信号传导。显示了用野生型中间T抗原cDNA（MT）与野生型或突变型小T抗原cDNA（ST）共同转染REF52细胞或单独用bc1051基因组DNA转染REF52细胞后产生的转化集落的数量。显示了三个实验中每微克中间T抗原DNA的平均转化菌落数。使用的小T抗原突变体是Del 42HPDKGG47 J结构域缺失和Ins 107AL PP2A插入突变体（参见图3). 顶部显示了cDNA中中小型T抗原结构域的组织。这些数字表明了这两种蛋白质的氨基酸序列，并显示了小T抗原cDNA中突变的位置。

讨论

PP2A是一种主要的细胞丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，具有许多细胞蛋白靶点(30–34). 已知PyST取代PP2A全酶中的PP2A B调节亚基，并与PP2A a支架和C催化亚基形成新的复合物(26,27,35). 有四个不同的调节性B亚单位家族，包含至少22种不同的亚型，由不同的基因和相同B基因的不同剪接变异体编码(31,33,34). 目前尚不清楚PyST是否可以取代特定的B亚单位家族，或者是否可以取代多个B亚单位。人们怀疑，当PyST进入PP2A复合体时，它会抑制PP2A活性，但尚未排除含有PyST的新PP2A复合物具有新的PP2A特异性。目前，我们只能推测PP2A在ARF–p53信号通路中的作用。ARF本身可能被磷酸化，因为我们在2D凝胶上检测到多种ARF形式（M.G.M.和M.F.，未发表的结果）。ARF可能与磷酸化状态可能影响ARF激活p53能力的其他蛋白质复合。

ARF被认为通过抑制MDM2降解p53的能力来激活p53(36–39). 尽管ARF已被证明绑定到MDM2在体外，有越来越多的证据表明体内ARF不需要与MDM2形成稳定的相互作用，也不需要将MDM2隔离到核仁以激活p53(17,40,41). 因此，ARF可能通过间接和直接的方式影响MDM2降解p53的能力，这可能涉及PP2A依赖性步骤。众所周知，p53及其调节因子MDM2在多个位点被磷酸化，MDM2与p53的结合以及由此产生的对p53活性的抑制依赖于磷酸化(42–44). PyST也可能影响ARF–p53通路中其他未知蛋白的磷酸化状态。

SV40和Py具有相似的基因组大小和相关基因组织，但每种病毒通过不同的机制阻止p53激活。这两种病毒的小T抗原大小相似，具有相似的J和PP2A结构域。两种小T抗原的PP2A结构域可能具有不同的生物学功能。最近已经证明，SV40小T抗原对PP2A的干扰是Ras癌基因转化的人类细胞永生化所必需的(45). 据报道，PyST尚未以类似方式发挥作用。目前尚不清楚SV40小T抗原PP2A结构域是否可以或需要以与PyST PP2A域类似的方式干扰ARF向p53的信号传导。在SV40的情况下，p53被SV40大T抗原的结合直接靶向和功能失活。相反，在Py的情况下，PyLT不与p53结合，而是PyST PP2A结构域通过阻断ARF信号抑制p53上调。SV40小T抗原也可以取代PP2A全酶中的B调节亚单位(26,46). 最近的一份报告确定了至少两种不同的B亚型，SV40小T抗原可以在PP2A复合物中取代(47). 目前，尚不清楚PyST是否取代PP2A复合体中的这些或其他B亚单位。SV40和Py小T抗原与PP2A A亚单位的结合存在差异(48)这可能反映了它们对PP2A全酶活性的影响不同。

我们的研究表明，Py利用一种独特的策略来消除p53的激活。与其他小DNA病毒不同，后者编码直接靶向p53并使其失活的蛋白质，Py通过PyST PP2A结合域靶向并抑制关键ARF介导的p53激活信号。本研究揭示了PP2A在调节ARF–p53肿瘤抑制通路中以前未被认识的作用，并强调了病毒蛋白在识别细胞信号通路中的重要调节机制方面的作用。

致谢

笔记

缩写：Py，多瘤病毒；PyLT、Py大T抗原；PyMT、Py中间T抗原；PyST，Py小T抗原。

参考文献