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分子生物学细胞。2004年10月;15(10): 4532–4543.
数字对象标识:10.1091/桶。E04-04-348
预防性维修识别码:项目编号519147
PMID:15282343

Pur抑制蛋白与Sp1/Smad辅活化因子动态相互作用诱导转化生长因子β1激活的肌成纤维细胞血管平滑肌α-肌动蛋白基因转录

卡尔·亨里克·赫尔丁,监控编辑器

摘要

小鼠血管平滑肌α-肌动蛋白(SMA)基因增强子在成纤维细胞中通过转化生长因子β1(TGFβ1)激活,TGFβ是肌成纤维细胞分化和伤口愈合的有效介质。SMA增强子包含Sp1转录激活蛋白和Purα和β阻遏蛋白的串联位点。我们研究了这些不同蛋白质之间的动态相互作用,以确定可能控制慢性炎症期间肌成纤维细胞分化的检查点。SMA增强子中的一个新元件SPUR负责成纤维细胞中的基础和TGFβ1依赖性转录激活,并能够结合Sp1和Pur蛋白。当TGFβ1或Smad蛋白过表达增加SMA增强子活性时,一种新的Sp1:Pur:SUR复合物被解离。观察到Pur蛋白与Smad2/3的物理联系,即Smads与上游增强子区的结合,该增强子区域在TGFβ1激活的肌成纤维细胞中经历DNA双重解链。转化生长因子β1不能减轻SMA增强子的Purβ阻遏作用,而Purα介导的阻遏部分被TGFβ1或Smad蛋白的过度表达所挽救。Pur阻遏物亚型与Sp1和Smad辅活化因子之间的相互作用可能调节创面修复和组织重塑期间TGFβ1激活的肌成纤维细胞中SMA增强子的输出。

简介

肌成纤维细胞因组织损伤而产生,并获得许多平滑肌细胞正常表达的收缩蛋白,如血管平滑肌α-肌动蛋白(SMA)。这些基质细胞通常含有许多平滑肌肌动蛋白应力纤维,这些纤维有助于产生伤口收缩和闭合所需的等长机械力(斯科利和加比亚尼,1988年;Desmoulière和Gabbiani,1996年;鲍威尔., 1999;塞里尼和加布亚尼,1999年;辛兹., 2001;托马塞克., 2002). 慢性肌成纤维细胞活化与许多与组织重塑相关的病理条件有关,包括增生性瘢痕、间质纤维化、纤维瘤病和某些肿瘤的基质反应(罗诺夫·杰森., 1995;韦伯,1995年;., 1996;Zalewski和Shi,1997年;内德莱克., 2001;卡西曼., 2002). 对小鼠移植心脏的研究表明,慢性同种异体移植功能障碍(CAD)是移植后心力衰竭的主要原因,与心脏肌成纤维细胞移植周SMA基因激活有关(Subramanian语., 2002). 随后心肌细胞中SMA表达的不适当升高,这是生理应激的一种迹象(黑色., 1991)冠状动脉平滑肌细胞中SMA基因的沉默在时间上与肌成纤维细胞的激活、纤维化和移植血管硬化有关,后者限制灌注并影响移植存活率(阿姆斯特朗.,1997年a,b条,c(c);Subramanian语., 1998).

转化生长因子β1(TGFβ1)是肌成纤维细胞分化的重要介质,参与慢性纤维化疾病的病理生物学(赫尔丁., 1997;德兰克., 1998;马萨格和沃顿,2000年). 报告不仅证明了转化生长因子β1在调节细胞外基质稳态中的关键作用(风扇., 1999;布兰顿和科普,1999年)但也指出其对SMA基因的激活作用,SMA基因是应力纤维组装和肌成纤维细胞张力产生所必需的(Ronnov-Jessen和Petersen,1993年;塞里尼., 1998). TGFβ1结合跨膜受体复合物并激活Smad协同调节蛋白,这些蛋白被转运到细胞核形成多亚单位转录调节复合物(马萨格和沃顿,2000年). 细胞类型和基因特异性伴侣蛋白与速率限制性Smad相互作用,以确定转录反应的性质和持续时间。这样的蛋白质可以独特地控制占据SMA增强子内紧密定位位点的普遍存在的DNA结合蛋白之间的动态相互作用。因此,了解Smad及其伙伴蛋白在肌成纤维细胞SMA增强子处相互作用的分子机制,对于理解与移植后器官排斥相关的异常纤维增殖过程至关重要。

我们实验室以前的研究表明,基质成纤维细胞中的SMA基因受到一系列阳性和阴性的调控顺式-基础转录和TGFβ1诱导转录所需的最小增强子内的作用元件(Kelm.,1996,1999年a,b条,2003;卡利尼., 2002;科根., 2002). 虽然TGFβ1通过对多种阳性调控元件的协同作用,扩增了小鼠SMA增强子的基础表达,但其诱导性本身仅限于增强子中的一个部位,即THR,之前的研究表明,该增强子与单链特异性DNA修饰试剂具有TGFβ1-依赖性高反应性(贝克尔., 2000;科根., 2002). 重要的是,在成纤维细胞和动脉平滑肌细胞中发现了三种单链特异性DNA结合因子,它们减弱了SMA增强子的转录输出(科根., 1995;太阳., 1995; 克尔姆.,1996,1999年a,b条). 这些阻遏物结合富含嘌呤/嘧啶(Pur/Pyr)的大区域的相反链,该区域包含THR和相邻的MCAT元件,该元件结合SMA增强子激活所需的TEF1蛋白。Purα和Purβ与富含嘌呤的链结合,而MSY1对富含嘧啶的链具有特异性。在接受心脏移植的患者中,所有三种蛋白的水平都随着移植周围纤维化和慢性排斥反应的发生而增加(Subramanian语., 2002). Purα、Purβ和MSY1在单链DNA上自结合,并结合TEF1和血清反应因子(SRF)等双链特异性转录激活蛋白,形成异聚物(卡利尼., 2002). 由于Purα、Purβ和MSY1倾向于结合单链DNA,它们可能会阻止TEF1激活蛋白与其Pur/Pyr-rich结构域内同源的双链MCAT结合元件的连接。此外,最近的研究表明,Purβ阻遏物的功能特性可以受到SRF的影响,SRF是肌成纤维细胞和动脉平滑肌细胞中的关键SMA基因激活剂(太阳., 1995;克尔姆., 2003).

我们现在知道,Sp1/3 DNA结合蛋白还通过与第二个TGFβ1控制元件(最初在动脉平滑肌细胞中描述为TCE)的相互作用,在成纤维细胞中作为SMA增强子的转录激活剂发挥作用(科根., 2002). 在本报告中,我们确定了一个新的富含嘌呤的结构域,该结构域与TCE内的核心Sp1/3共识结合位点重叠服务提供商采购上述THR中的蛋白结合元件,我们将这种新的调节成分称为SPUR标准元素。尽管移植慢性排斥反应后Purα、Purβ和MSY1的DNA结合活性受到调节(Subramanian语., 2002)和Sp1有助于改变胶原蛋白基因表达模式,通常与伤口愈合和纤维化有关(格林维尔., 1997;Poncelet和Schnaper,2001年)TGFβ1依赖的SMA基因激活是组织损伤后肌成纤维细胞分化的一个重要特征,我们对这些蛋白之间的相互关系一无所知。因此,我们的目标是确定单股特异性SMA阻遏蛋白是否与双股特异性Sp1/3 DNA结合蛋白相互作用,并研究这些相互作用在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞时如何变化。在本报告中,我们表明Pur和Sp1蛋白实际上在SMA增强子的SPUR元件上共享相邻的结合位点,并以TGFβ1敏感的方式进行物理相互作用。数据表明,成纤维细胞到肌成纤维细胞的转化涉及SMA增强子内位于SPUR和THR位点的蛋白质:DNA和蛋白质:蛋白质相互作用的改变。Pur和Sp1蛋白之间的动态相互作用可以调节肌成纤维细胞中的SMA基因输出,从而更有效地修复接受器官移植物中炎症细胞造成的损伤。这种相互作用的破坏可能会导致超收缩性肌成纤维细胞过度堆积,从而改变接受的心脏移植物的结构,达到功能破坏的程度。因此,这些分子相互作用可能是固体器官移植后新型抗排斥治疗的有用靶点。

材料和方法

细胞培养方法

小鼠AKR-2B胚胎成纤维细胞保存在补充有5%热灭活胎牛血清(hiFBS)和青霉素-链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的McCoy的5A培养基(Cambrex Bio-Science Walkersville,MD)中。非人类灵长类COS7肾脏成纤维细胞在DMEM(4.5 g/l)中保持d日-葡萄糖)补充青霉素-链霉素和10%hiFBS。所有细胞系在37°C、5%CO的增湿培养箱中培养2将成纤维细胞暴露于HEPES缓冲的DMEM(1.0 g/l)48小时后,成纤维细胞处于静止状态d日-葡萄糖),含0.5%hiFBS和青霉素-链霉素-Fungizone。在制备蛋白质提取物之前,将重组人TGFβ1(5 ng/ml,终浓度;R&D Systems,Minneapolis,MN)加入不同时期的培养物中。

蛋白质提取物的制备和电泳迁移率变化分析(EMSA)

用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞单层两次,刮入新鲜的PBS中,以3000 rpm的转速沉淀,在PBS中再次冲洗,并在八个低渗缓冲液(10 mM HEPES,pH 7.9,1.5 mM MgCl)中重新悬浮2,10 mM KCl,0.2 mM苯甲基磺酰氟[PMSF],0.5 mM二硫苏糖醇[DTT])。细胞在冰上膨胀10分钟,然后转移到Dounce均质机,用B型杵进行处理。以4000 rpm离心15分钟,从破裂的细胞中收集细胞核,并将其悬浮在半包装的冰镇低盐缓冲液(20 mM HEPES,pH 7.9,25%甘油,1.5 mM MgCl)中2,0.02 M KCl,0.2 mM EDTA,0.2 mM PMSF,0.5 mM DTT)。高盐缓冲液(20 mM HEPES,pH 7.9,25%甘油,1.5 mM MgCl2添加等于半填充颗粒体积的1.2 M KCl、0.2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、0.5 mM DTT),并在4°C下轻轻摇动进一步提取细胞核30 min。以14500 rpm离心30 min收集细胞核,并用50体积的透析缓冲液透析,透析缓冲液含有20 mM HEPES、pH 7.9、20%甘油、100 mM KCl、0.2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、0.5 mM DTT。透析后,通过14500 rpm离心20 min收集上清液,用于生化分析。使用放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(1×PBS,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠,蛋白酶抑制剂鸡尾酒,0.2 mM PMSF,0.5 mM DTT)在0.6 ml/100-mM培养板上从PBS冲洗单层制备全细胞提取物,然后在4°C下轻轻摇晃15 min。将粘附的裂解细胞残留物刮入0.3 ml RIPA缓冲液中,并与原始裂解液合并到单个微离心管中,以10000×在4°C下保持10分钟。如前所述,从新生儿(4、6、9和13天大)、8至10周大的成人和同种心脏移植中制备小鼠心室组织提取物(Subramanian语., 2002). 如前所述,对细胞和组织提取物进行EMSA和超移EMSA(科根., 2002;Subramanian语., 2002).

DNA结合分析(DBA)

本研究中使用的合成寡核苷酸探针对应于小鼠SMA 5′-侧翼区域的序列(分钟., 1990). 将含有核提取物(100μg蛋白质)和生物素化寡核苷酸(100 pmol;Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)的反应混合物培养在含有聚(dI-dC)、10 mM Tris、pH 7.5、50 mM NaCl、0.5 mM DTT、0.5 mM-EDTA、0.12 mM PMSF、4%甘油的反应混合物中。蛋白质:生物素:如前所述,在链霉亲和素固定的顺磁性颗粒上捕获DNA复合物(普罗米加,麦迪逊,威斯康星州;0.6毫升/反应,30分钟培养)(克尔姆等。, 2003). 用含有25mM Tris-HCl、pH 7.5、1mM EDTA和100mM NaCl的缓冲液洗涤四次后,使用2×蛋白质变性缓冲液洗脱结合的蛋白质,并通过SDS-PAGE和免疫印迹程序进行分析。

哺乳动物蛋白过表达质粒、细胞转染和报告基因检测

使用Mirus(Invitrogen,San Diego,CA)转染试剂和制造商提供的方案,用上述SMA启动子的优化混合物转染40–50%合流的成纤维细胞:报告融合质粒VSMP4和VSMP8,和/或编码各种转录调控蛋白的质粒(科根., 2002). 编码人类Sp1和人类Smad 2/3/4蛋白的质粒分别由J.Horowitz博士(北卡罗来纳州立大学罗利分校)和L.Choy博士和R.Derynk博士(加利福尼亚大学旧金山分校)提供。使用QIAGEN制备树脂和制造商提供的协议(加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENE)纯化质粒。转染48小时后,用冷PBS清洗细胞三次,然后使用氯霉素乙酰转移酶(CAT)酶联免疫吸附测定(ELISA)裂解缓冲液(印第安纳波利斯罗氏应用科学公司)进行裂解。在14000×在4°C下保存10分钟,并在-20°C下储存,然后进行分析。提取物中的总蛋白通过比色法测定(Pierce Chemical,Rockford,IL)。通过免疫印迹评估同等数量的裂解蛋白,以验证蛋白过度表达。使用商业ELISA试剂盒(罗氏应用科学公司)测定CAT报告基因活性。报告基因表达相对于总细胞蛋白进行了标准化,转染按常规进行三次,重复三到五次。对数据集进行方差分析,以评估统计学显著性(p<0.05)。

蛋白质免疫沉淀

在200μl溶液D(20 mM HEPES,pH 7.9,100 mM KCl,0.2 mM EDTA,20%甘油,1 mM DTT,0.2 mM PMSF)中,将来自成纤维细胞的核或全细胞蛋白提取物(100μg)与商业(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)H-tag(针对Pur蛋白)或DYKDDDDK-tag特异性(针对Smad)抗体(2μg)结合。在旋转平台混合器上于4°C下孵育1小时后,添加之前在溶液D中洗涤并悬浮的20μl蛋白G-琼脂糖(Sigma-Aldrich)小份,并在4°C条件下旋转孵育16小时。通过在4°C下以2500 rpm离心5 min收集带有固定蛋白的琼脂糖珠,用PBS洗涤四次,悬浮在1×SDS-PAGE样品缓冲液中,在95°C下加热5 min,并通过SDS-PACE和选择抗体的免疫印迹评估释放的蛋白。

免疫印迹法

蛋白质(10-μg等分)通过SDS-PAGE使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行分级,然后电泳转移到硝化纤维素膜(Schleicher&Schuell,Keene,NH)。在含3%(wt/vol)脱脂奶粉和0.5%牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水(TBS;25 mM Tris-HCl,pH 7.5,150 mM NaCl)中于4°C下隔夜封闭后,在室温下用选定的兔多克隆抗体(2μg/ml)孵育斑点90分钟,轻轻摇晃。商业上获得了Sp1和Smad蛋白的特异性抗体(加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司),前面描述了两种不同的Pur蛋白特异抗体(抗Purα291–313和抗Purβ302–324)以及泛特异性Purα/β抗体(42–69)(克尔姆.,1999年a;Subramanian语., 2002). 在室温下,在含有吐温20(0.05%vol/vol)的TBS中,在20分钟内清洗四次印迹。然后施加辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二级抗体(1:1500)45分钟,之后按照上述方法清洗印迹,并通过化学发光(ECL;Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)处理抗体可视化,并在Biomax胶片上成像(Eastman Kodak,Rochester,NY)。

结果

一种新的Pur蛋白双链DNA结合位点位于SMA增强子Sp1激活位点附近

小鼠SMA增强子中的双链TCE元件代表了TGFβ1激活的肌成纤维细胞中Sp1/3激活蛋白的强结合位点(科根., 2002). 对TCE侧翼序列的检查显示,在“正向”(也称为DNA双链的“上部”或“感觉”链)和“反向”(也称DNA双链中的“下部”或“反向”链)中有三个假定的Pur蛋白结合位点(GGA)Sp1/3结合所需TCE富含GC-的核心内和3′方向(表1). 最初的TCE探针被扩展到包括这些序列组件,因此创建了一个名为SPUR的新探针,它包含这两个组件S公司第1/3页和采购-结合位点。SPUR位于小鼠SMA基因5′侧翼区域的-59和-28之间。为了确定小鼠Pur蛋白是否能够结合SPUR探针,使用从新生小鼠心室组织和胎牛血清刺激的小鼠AKR-2B成纤维细胞制备的蛋白提取物进行EMSA。出生前,SMA是小鼠心室肌细胞中表达的主要肌动蛋白亚型。由于SMA在这些细胞中的表达在出生后第14天停止,预计4-d龄新生小鼠的心室提取物中含有SMA基因转录的激活物(如Sp1)和阻遏物(如Purα和β)。同样,血清刺激的成纤维细胞瞬时表达SMA,并含有SMA基因激活物和阻遏物,以调节SMA转录输出。如所示图1在双链(ds)环境下,使用SPUR探针检测心脏组织和成纤维细胞提取物中的Sp1/Sp3和Pur蛋白。此外,Sp1、Sp3和Pur蛋白通过各自的多克隆抗体在dsSPUR探针上独立地改变大小,但与TEF1或SRF增强子激活蛋白的特异性抗体无关。为了进行比较,在心脏提取物EMSA中使用MCAT探针的正向单链(ss)成分作为Pur蛋白结合的阳性对照(科根., 1995;太阳., 1995;Subramanian语., 2002)并表示超转移Pur蛋白:DNA复合物的位置。通过使用ssMCAT探针,Pur蛋白的抗体超移位复合物在EMSA中很明显,但在使用dsSPUR探针的分析中不太明显,因为天然的Sp1:dsSPUR-复合物迁移到超移位Pur:dsSPUR/复合物的同一位置(比较区域在图1左面板或右面板的相同区域)。Purα和PurβDNA复合物都被抗Purβ302-324抗体改变了大小,因为它们具有形成异二聚体的已知能力(克尔姆1999年a).

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EMSA描述了新生小鼠心室(左侧和中部)和血清处理的AKR-2B成纤维细胞(右侧)提取物中天然Sp1、Sp3和Pur蛋白与来自SMA增强子不同区域的双链SPUR探针(dsSPUR)或单链探针(ssMCAT)的相互作用包含Pur蛋白结合位点,但不包含其他蛋白质。EMSA反应使用针对Sp1、Sp3、Purβ、SRF和TEF1的抗体进行处理,以改变包含同源转录因子的DNA:蛋白质复合物的大小(大小变化复合物位于标有星号的括号内)。Sp1、Sp3和Pur蛋白的大小都独立地由其相应的抗体改变,而不是由无关的SRF或TEF1抗体改变。

表1。

DNA探针序列用于评估SMA增强子结合蛋白的动态相互作用

GGA公司AGG公司:潜在Pur结合位点
转速1/转速3
   SPUR标准GAAGCGAGTG公司GGA公司GG公司GGA公司TCAGAGCA公司AGG公司GGC公司
   三氯乙烯gaaggagtg公司GGA公司GG公司GGA公司TCAGA公司
   TCEm公司GAAGCGAGTG公司TTA公司GG公司GGA公司
TCAGA公司
   MCAT公司GCAGAACAGA公司GGA公司ATGCAGT公司GGA公司AGAGACC公司
   推力GCAGT公司GGA公司AGAGACCC公司AGG公司CCTCTGGCCACCAGA公司
   SPUR标准GAAGCGAGTG公司GGA公司GG公司GGA公司TCAGAGCA公司AGG公司GGC公司
   标准普尔1GAAGCGAGTG公司TTA公司GG公司GGA公司TCAGAGCA公司AGG公司GGC公司
   标准普尔2gaaggagtg公司GGA公司GG公司GGA公司TCAGATAC公司CTT公司TTA公司
复合年增长率AGAC公司:潜在Smad结合位点
   SBE(+对照)CCC公司复合年增长率CACCACCCCC公司复合年增长率燃气涡轮发电机
   SPUR标准GAAGCGAGGGGAGGAT公司复合年增长率GCAAGGGC公司
   MCAT公司复合年增长率A类复合年增长率GGAATGCAGTGGAAG公司AGAC公司C类
   推力GCAGTGGAAG公司AGAC公司CCAGCCTCTGGCCACC(CCAGCCCTCTCGCCAC)复合年增长率
   NS(对照)CAGGTGAATGGCAGCAGCTGTCGACTCAC公司

为了简单起见,只显示了正向的上链序列。Pur蛋白和Sp1/Sp3结合基序的显著特征在顶部组中用粗体字母表示,而推测的Smad-binding共识序列在底部组中用黑体字母表示。替换突变被强调。

在SMA基因调控的背景下,Pur蛋白一直被视为单链特异性DNA结合蛋白。因此,观察到它们对双链SPUR DNA的亲和力偏离了这种行为是非常有趣的。为了进一步探讨这一新观察的意义,使用小鼠AKR-2B胚胎成纤维细胞制备的核提取物进行DBA结合Western blot分析。我们的目的是检查序列和链特异性问题,并明确解决每个Pur蛋白亚型的结合。SPUR和TCE探针,加上含有突变Sp1位点的TCE探针变体(TCEm;表1),以双链或单链(正向)形式与核蛋白提取物孵育。上述MCAT元件的前链作为单链结合的阳性对照,因为已知其包含两种Pur蛋白的高亲和力位点(科根., 1995;太阳., 1995). 用Purα/β、Sp1和Sp3特异性抗体评估DNA结合蛋白的Western blot。虽然Pur蛋白与所有四个探针的前链结合,但SPUR是唯一能够结合Pur蛋白的双链探针(图2A). 正如预期的那样,Sp1和Sp3都与SPUR和TCE的双链形式结合,但未能结合双链TCEm,也没有结合任何单链探针(图2A、Sp1和Sp3)。有趣的是,TCEm的双链版本保留了一些Pur蛋白结合活性,这可能是因为在没有Sp1/3与该突变探针结合的情况下,完整的GGA位点可能可用于Pur占据(参考表1). 因为单链特异性MSY1转录调控蛋白结合Pur蛋白(克尔姆.,1999年b)最近的研究表明,可以增强SMA增强子的单链Pur/Pyr-rich区域对Purβ的负载(克尔姆., 2003),我们检查了MSY1是否是SPUR探针上鉴定的新型含Pur络合物的成分。虽然在单链型SPUR或TCE探针上清楚地检测到MSY1结合,但该蛋白与双链SPUR上形成的Pur复合物无关(图2A). 此外,MSY1与正向DNA的相互作用似乎对基于SPUR的探针(SPUR、TCE和TCEm)具有特异性,因为来自MCAT Pur/Pyrrich区域的正向链无法与MSY1结合(图2A). 因此,双链SPUR似乎适应了与Pur阻遏蛋白的新型特异性相互作用,到目前为止,这种作用仅表现出对SMA增强子单链区域的明显偏好。

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(A) 使用双链和单链SMA增强子探针对成纤维细胞核提取物进行DBA。DBA探头显示在顶部边缘。用于亲和性分离蛋白的Western blot分析的抗体如左图所示。ds,双链DBA探针;ss,单线DBA探头。dsSPUR结合Pur、Sp1和Sp3蛋白质。(B) 使用突变SPUR探针对成纤维细胞核提取物进行DBA。双链情况下的SPUR突变消除了Pur结合,但对与单链探针的结合没有不利影响。wt,野生型上下文;m1,m2,突变上下文(表1); ns,非特异性物种。DBA Western blots的抗体显示在左侧。

对双链SPUR中富含GC和GGA的成分进行独立突变,以评估其在介导Pur蛋白结合中的重要性(图2B、SPURm1和SPURm2)。GC-rich和GGA位点对Pur蛋白与双链SPUR的结合至关重要。然而,Sp1/3结合仅因GC丰富位点本身的突变而受损,而非GGA基序的突变。该观察结果表明,Pur蛋白与双链探针的结合具有序列特异性。定性而言,单链突变探针在结合Pur和MSY1蛋白方面表现出与天然环境中探针几乎相同的能力(图2B(右),这意味着Pur与双链DNA结合所需的完整GC-rich和GGA位点不是与单链DNA结合的重要决定因素。这些结果表明,与结构上受限制的双链探针相比,单链序列特异性较低。

TGFβ1及其受体相关Smad蛋白改变Pur蛋白相互作用

因为SPUR区域包含先前报道的TCE,参与TGFβ1对成纤维细胞SMA启动子的调节(科根., 2002),我们检测了在存在和不存在这种肌成纤维细胞分化的基本生长因子介质的情况下Pur与SPUR的结合。DBA对暴露于5 ng/ml TGFβ1 1 1或6 h后从肌成纤维细胞制备的核蛋白提取物进行评估。TGFβ1治疗6小时后,Pur结合减少了四倍,这是双链SPUR的特异性(图3). 在存在TGFβ1的情况下,Sp1转录激活物与双链SPUR的结合没有改变,这与我们之前的观察一致,即在肌成纤维细胞分化过程中,与SMA增强子的净Sp1/Sp3结合没有增加(科根., 2002). Western blot分析显示,暴露于TGFβ1 6 h后,成纤维细胞核提取物中Pur蛋白水平没有降低(未公布的数据)。这一发现表明,尽管在TGFβ1激活的肌成纤维细胞中可以检测到Pur蛋白,但它似乎不太能够结合双链SPUR DNA。有趣的是,在TGFβ1治疗期间,MSY1与单链(正向)SPUR的结合适度增强(图3). 暴露于TGFβ1 6 h后,在原代人肺肌成纤维细胞中观察到Pur和MSY1蛋白的类似趋势(未发表数据)。

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从TGFβ1激活的肌成纤维细胞制备的核提取物DBA。用于免疫印迹的抗体显示在每个面板的左侧。在TGFβ1暴露6小时后,与dsSPUR探针结合的Pur蛋白减少了四倍。

进行蛋白质免疫沉淀实验,以检查Sp1和Pur蛋白之间物理关联的可能性,这可能解释了它们对双链SPUR的联合亲和力,并为TGFβ1对Pur蛋白与SPUR相互作用的调节影响提供了控制点。在存在或不存在TGFβ1的情况下,从培养6 h的肌成纤维细胞制备的核提取物与Sp1特异性抗体孵育,然后使用泛特异性Pur蛋白抗体对沉淀物质进行Western blot评估。Sp1抗体从对照提取物中免疫沉淀Pur蛋白,而从TGFβ1处理后制备的提取物中收集的Pur蛋白明显较少(图4A). 总核蛋白的蛋白质印迹显示对照组和处理组提取物中Pur蛋白和Sp1的数量相等(图4A,底部),表明TGFβ1最有可能损害蛋白质:蛋白质相互作用,而不是降低这些蛋白质的净可用性。

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来自成纤维细胞的Sp1:Pur蛋白复合物的免疫沉淀。(A) 从无血清(对照)AKR-2B成纤维细胞核提取物中分离出的Sp1免疫沉淀物含有显著的Purα和Purβ带,通过使用泛特异性抗Pur抗体的Western blot分析显示。在TGFβ1暴露6小时期间,肌成纤维细胞分化伴随着Sp1:Pur蛋白相互作用的减少。暴露于TGFβ1对核提取物中Pur蛋白亚型水平无明显影响(下图)。(B) 用Sp1特异性抗体对转染空表达质粒(-)或含有编码Smad 2、3和4(+)cDNA的等摩尔质粒混合物的COS7成纤维细胞分离的Pur蛋白免疫沉淀进行Western blot处理。转染Smad表达质粒不会影响Sp1蛋白的净表达(底部),但会显著削弱Sp1:Pur蛋白的相互作用(顶部)。

Smad蛋白2、3和4在创伤愈合过程中介导肌成纤维细胞TGFβ1受体信号,并强烈激活天然SMA基因(科根., 2002). 扩展中显示的数据图4A,我们研究了Smad蛋白过度表达对转染COS7成纤维细胞中Sp1和Pur蛋白物理结合的影响。Pur蛋白抗体能够从未转染的COS7成纤维细胞免疫沉淀天然Pur:Sp1复合物,但不能从编码Smad 2、3和4的表达载体的等摩尔组合转染的细胞免疫沉淀(图4B). Western blot分析显示,在未转染的对照细胞和过度表达Smad蛋白的细胞中,天然Sp1的数量相等(图4B,底部)。数据显示在图4,A和B提示TGFβ1及其受体调节的Smad信号剂均能改变Sp1和Pur蛋白之间的物理相互作用。

Pur蛋白是成纤维细胞中有效的SMA转录抑制因子

我们实验室先前的结果表明,Purβ,而不是Purα,是主动脉平滑肌细胞中小鼠SMA启动子的有效阻遏物(克尔姆., 2003). 为了研究Sp1:Pur蛋白相互作用对成纤维细胞SMA增强子活性的功能影响,我们将COS7肾成纤维细胞中Smads 2/3/4、Purα、Purβ和Sp1的组合与SMA增效剂:CAT报告基因融合构建物(称为VSMP4)共转染。VSMP4中包含的191碱基对增强子片段包括SPUR、TCE、MCAT、THR和CArG B元件,这些元件对成纤维细胞中SMA的基础转录和TGFβ1诱导转录都是必要的(培养., 1992;科根., 2002). 与它们在动脉平滑肌细胞中的行为相反,我们惊讶地发现,两种Pur蛋白在抑制转染成纤维细胞中的基底和Sp1增强型SMA增强子输出方面同样有效(图5A). 更有趣的是,Smad 2/3/4的过度表达不仅消除了Purα对VSMP4的抑制,而且还中和了Purβ对Sp1存在时VSMP4激活的负面影响(图5B). 相反,Smad蛋白不能有效缓解Purβ单独或与Purα联合过度表达的成纤维细胞中SMA增强子的抑制(图5C). 显然,无论是在基础状态还是Sp1激活状态,Smad蛋白都能够覆盖SMA增强子的抑制,但只有当抑制由Purα而非Purβ介导时。Western blot分析证实转染COS7成纤维细胞中Smad 2/3/4和Pur蛋白过度表达(图5D). 为了将这些结果与TGFβ1受体介导的肌成纤维细胞激活进行比较,我们检测了Pur蛋白过度表达对AKR-2B成纤维细胞SMA转录激活的影响,这些成纤维细胞在转染TGFβ2后通过通常的受体途径激活内源性Smad。尽管这两种Pur蛋白都能破坏肌成纤维细胞中SMA增强子的TGFβ1激活,但Purβ表现出明显的阻遏作用,其效力是Purα的三到四倍(图6A). 当与Purα共表达时,与COS7成纤维细胞相比,Smads在AKR-2B成纤维细胞中的SMA增强子去抑制作用较弱。这一观察结果可能与每个成纤维细胞系中天然Pur蛋白水平的差异和/或SMA增强子激活因子如Sp1、TEF1或SRF的可用性有关。最后,3.6-kb VSMP8小鼠SMA启动子构建物的Smad激活,先前显示可在许多转基因小鼠系中驱动高水平、平滑肌组织特异性过度表达(Wang.,1997,1998;前田., 1999;三月., 1999;麦格劳., 1999;诺布., 2001;Gokturk公司., 2003)在COS7成纤维细胞中也被Pur蛋白的过度表达所抑制(图6B). 作为Smad激活的VSMP8的阻遏物,Purβ的效力几乎是Purα的10倍。

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Pur蛋白作为转染COS7成纤维细胞中SMA增强活性的双峰介质。(A) 两种Pur蛋白都能抑制Sp1介导的SMA增强子激活。(B) Smad蛋白是SMA增强子的强效激活剂,可以中和Purα介导的抑制,无论是否含有Sp1。(C) Purβ表现为显性阴性型阻遏物,不受Smad或Sp1蛋白过度表达的影响。对于A到C,单个转染中包含的表达质粒用(+)表示。(D) 通过使用Pur蛋白特异性多克隆抗体进行Western blot分析,验证转染COS7成纤维细胞中的蛋白过度表达(top);Smad 2、3和4(中间);或Sp1(底部)。1号通道(所有面板),非转染COS7成纤维细胞提取物;通道2–4,COS7成纤维细胞的提取物,转染了Purα单独表达质粒(通道2,顶部)、Smad2/3/4(通道2中,中间)、Sp1(通道2、底部)、Purβ单独表达载体(通道3,顶部)或Purα和Purβ两者(通道4,顶部)。

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在AKR-2B成纤维细胞中Pur蛋白的过度表达减弱了TGFβ1或Smad蛋白对SMA增强子和全长启动子的激活。(A) 通过TGFβ1、Smad2/3/4或两者的组合转染的成纤维细胞中的VSMP4增强子活化被Purα过度表达显著抑制,并被Purβ完全抑制。将通道2、3和4与通道5、6和7(Purα介导的抑制)或通道8、9和10(Purβ介导的阻遏)进行比较。(B) Smad介导的AKR-2B成纤维细胞中全长VSMP8启动子的激活被Purα和Purβ显著抑制。将泳道5与泳道6(Purα介导的抑制)或泳道7(Purβ介导的抑制)进行比较。VSMP8启动子通常在成纤维细胞中转录沉默,但被TGFβ1或Smad信号转导中间蛋白激活(比较通道1和5)。对于A和B,用于每次转染的各种处理和/或表达质粒组合显示在底部。

SMA激活蛋白Smad2/3/4和Sp1与Pur阻遏蛋白物理结合,但在SMA增强子中占据不同的DNA结合位点

上述结果表明,在双链SPUR中,Sp1和Pur蛋白之间存在物理相互作用,Smad蛋白似乎可以抵消SMA增强子对Purα的抑制。我们假设肌成纤维细胞中可能存在多蛋白复合物,例如,它可以促进Pur蛋白阻断的SMA增强子的Smad蛋白去表达。为了支持这一观点,从COS7成纤维细胞中收集的Smad蛋白免疫沉淀物,其过度表达H标记的Pur蛋白,结合DYKDDDDK标记的Smads 2/3/4版本,被观察到含有Purα和Purβ(图7,车道5-8)。此外,在没有Smads的情况下,从共表达Sp1和H-tagged Pur蛋白的细胞中收集Sp1免疫沉淀物,以表明表位标记不会对Pur结构产生不利影响,正如其结合Sp1的能力未受损所评估的那样(图7,1-4车道)。此外,阴性对照实验用于监测与免疫沉淀(IP)抗体的非特异性相互作用(图7或用于收集沉淀蛋白的亲和珠(图7,无IP)显示H标记Pur蛋白没有假结合相互作用。

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转染COS7成纤维细胞中Smad 2/3:Pur蛋白复合物的证据。从过度表达Sp1(1-4道)或Smad 2/3/4(5-8道)的COS7成纤维细胞制备的核蛋白提取物用Sp1或Smad特异性抗体进行IPed(如每个面板底部所示),并使用左侧所示抗体进行Western blot(WB)处理。Sp1(IP:Sp1)和Smad(IP:Flg-Smad)免疫沉淀都含有Purα和Purβ,但用Smad 7阴性对照抗体处理的样品不含有(IP:Smad 7)。所有过度表达的蛋白都没有表现出与亲和分离珠的非特异性结合(无IP)。如底部两个面板所示,通过核蛋白提取物的Western blot分析验证蛋白质过度表达。标记为“ns”的带没有详细研究,但可能代表共价修饰的Pur蛋白亚型(未公布的数据)。

我们推断,鉴定Smad蛋白的DNA结合位点将有助于阐明191碱基对SMA增强子内相互作用的Pur蛋白、Smad和Sp1之间的空间关系。如中的蛋白质印迹分析所示图85 ng/ml TGFβ1暴露后1 h内,Smads 2和Smads 3在AKR-2B成纤维细胞细胞核内积聚。然而,Sp1水平不受生长因子处理的影响,并且在细胞核中含量较高。有趣的是,DBA使用暴露于TGFβ1后2 h制备的成纤维细胞核提取物,显示Smad 2/3优先与双链THR探针结合,而Sp1与含有更多3′双链SPUR位点的探针密切相关,这证实了先前的观察结果(图8). 与SPUR结合的Smad蛋白并不明显高于双链MCAT探针或双链非特异性序列控制探针观察到的结果,但与含有已知Smad结合元件(SBE)的双链阳性对照探针相比具有可比性。总之,尽管Pur阻遏物与肌成纤维细胞中的Sp1和Smad激活物发生物理相互作用,但每个激活物都结合SMA增强子的不同区域。鉴于先前的报告显示TGFβ1通过促进THR区域内DNA构象的改变而激活肌成纤维细胞中的SMA转录,Smad 2/3与SMA增强子的THR成分的优先相互作用很有意思(贝克尔., 2000).

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肌成纤维细胞中的SMA增强子激活蛋白具有不同的亚细胞定位和增强子结合特异性。左,暴露于TGFβ1 24小时后,从AKR-2B成纤维细胞制备的核蛋白提取物的Smad和Sp1蛋白印迹。Smad 2和3在TGFβ1处理后1 h内进入细胞核,而细胞核Sp1水平则一致较高。对,DBA使用TGFβ1激活的肌成纤维细胞的核提取物和来自SMA增强子的各种dsDNA探针(见顶部)。Smad和Sp1增强子激活蛋白结合到SMA增强子的不同区域。

心脏重塑与Pur蛋白异构比改变有关

Pur蛋白结合Sp1和Smad2/3 SMA基因激活蛋白的能力以及Purα和Purβ对TGFβ1信号的不同功能反应促使我们推测,SMA基因输出可能受重塑细胞和组织床内Pur蛋白亚型比率的控制。例如,Purβ亚型的积累可能会沉默SMA基因,因为该蛋白对基础转录具有显性负作用,而不管激活的Smad蛋白是否共存于细胞核中。相反,Purα亚型的化学计量优势可能与SMA基因转录的更动态状态有关,因为它似乎是双峰运行的,这取决于是否存在Sp1和Smad激活剂。为了进一步检验这些观点,我们评估了两种SMA基因重编程和心脏重塑的小鼠模型,以了解SMA基因输出和Pur蛋白亚型比率之间的关系。在小鼠出生后心脏发育期间,胚胎发育8至13天期间表达的胎儿SMA亚型逐渐被α-肌动蛋白的心脏亚型所取代(帕克., 1990;黑色., 1991;Subramanian语., 2002). 值得注意的是,随着SMA蛋白水平的降低,Purβ在出生后第一周的心室表达占主导地位(图9). 出生后9天,成熟小鼠心室中的Purα、Purβ和SMA水平均降低,在8周龄成年小鼠心脏中几乎检测不到。相反,在接受的、慢性排斥的成年小鼠心脏移植物中,胎儿SMA基因的重新激活伴随着两种Pur蛋白的升高,尤其是表现出TGFβ1敏感性的Purα亚型(图9).

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心脏重塑伴随着Pur蛋白亚型含量和SMA表达的变化。使用Pur-和SMA特异性抗体通过Western blot评估从新生儿(产后第4、6、9和13天)和成年小鼠心室以及从移植的同种异体(同种异体)心脏移植物(移植后30天)心室制备的蛋白提取物。出生后发育期的特点是Purβ亚型占主导地位,SMA表达减少,而慢性排斥的同种异体心脏表达更多Purα和SMA蛋白,而非移植受体的本地心脏表达更多。标记为“ns”的带没有详细研究,但可能代表共价修饰的Pur蛋白亚型(未公布的数据)。

讨论

SMA基因表达缺陷与心脏重塑

SMA在血管平滑肌细胞中组成性表达,在基质肌成纤维细胞中短暂表达,在心肌细胞的严格发育控制下,根据每种特殊细胞类型的要求赋予功能特征。SMA亚型的异常表达可导致血管顺应性和收缩性受损(施利德米耶., 2000;., 2003)并且与肌成纤维细胞的异常积聚和愈合伤口的增生性瘢痕有关(鲍威尔., 1999;托马塞克., 2002)以及心肌细胞中应力纤维装配不当和肌节断裂(古玛., 1997). SMA基因调控不当的长期后果通过一种称为CAD的慢性致病过程在接受的心脏移植中得到了明确证明。CAD是一种心脏重塑异常,与冠状动脉床SMA丢失和心肌实质和基质增加有关(., 1994;铃木., 1996;Subramanian语., 1998). 利用小鼠异位心脏移植模型,我们最近证实,心脏成纤维细胞比心肌细胞更容易受到SMA基因重编程的影响,这可以通过它们早期积累SMA转录重编程蛋白、TEF1、MSY1、Purα和Purβ来证明(Subramanian语., 2002). 心脏肌成纤维细胞可能会在接受的心脏移植物中引发心室重构,因为它们能够合成细胞外基质蛋白并形成瘢痕,理论上,瘢痕可能会对成年心肌细胞产生生物力学压力,从而以类似于在某些心脏移植物上观察到的情况激活这些细胞中胎儿SMA基因的表达心脏肥厚性疾病状态(黑色., 1991;苏斯曼., 2002). 在本报告中,我们试图描述首次在TGFβ1激活的肌成纤维细胞和移植心脏中发现的SMA表达转录激活物和阻遏物之间的相互关系。我们假设,SMA基因激活和抑制之间平衡的破坏可能是在接受的心脏移植物中观察到的慢性排斥组织病理学的某些方面的原因,这些组织病理学可能由过量的肌成纤维细胞沉淀,特别是间质和血管周纤维化和冠状动脉硬化。

肌成纤维细胞DNA结构与SMA转录调控

在肌成纤维细胞中,TEF1、Sp1/3、Smad 2/3和SRF转录调控蛋白都结合双链DNA并作为SMA增强子的激活剂发挥作用,而Purα、Purβ和MSY1明显偏好单链DNA并充当阻遏物(科根., 1995;太阳., 1995;克尔姆.,1999年a;科根., 2002). Kelm及其同事已经证明,TEF1激活剂和Purα/Purβ/MSY1阻遏物之间的竞争性相互作用可以调节SMA增强子的Pur/Pyr-rich区域的启动子输出,该区域含有一个具有高电位的反向重复序列,从而在热力学稳定的十字形结构中形成暴露的单链环(克尔姆.,1999年a;贝克尔., 2000;卡利尼., 2002). 我们现在通过显示Pur阻遏蛋白也与Sp1激活物竞争来扩展这些发现,但在一个明显不同的SMA增强子双链区域,即SPUR元件。与Pur/Pyr-rich区域不同,SPUR不包含允许未折叠DNA结构的明显反向重复序列。以前在小鼠脑中观察到Pur和Sp1蛋白之间的功能性相互作用,认为复合物控制髓鞘碱性蛋白(MBP)基因的转录(特雷蒂亚科娃., 1999). 在这个系统中,与Sp1的物理相互作用增强了Purα与其靶单链序列相互作用以驱动MBP启动子激活的能力。类似地,在U937单核细胞系的分化过程中,Purα和Sp1协同诱导CD11cβ-整合素基因转录,该转录是促进炎症期间单核细胞与内皮细胞粘附所必需的(雪莱., 2002). 在CD11c启动子中,Sp1与双链序列结合,而Purα的结合严格局限于单链DNA靶标。相反,我们的结果表明,Pur蛋白与含有高亲和力Sp1结合位点的SMA增强子区域的双链和单链元素相互作用。此外,在存在TGFβ1的情况下,Pur与双链SPUR DNA的结合被显著破坏,这表明Pur蛋白与SPUR处双链DNA的结合与基因抑制状态有关,而不是像MBP和CD11c启动子那样激活。Pur与双链SPUR的结合需要一个新的含有3′GAA的基序加上一个完整的GC-rich Sp1位点,这与之前的Sp1占有率对于Pur与双链SPUR的相互作用是至关重要的(尽管不是唯一的决定因素)的想法相一致。Pur与双链SPUR的结合可能需要与Sp1的物理相互作用和/或由蛋白质复合物介导的DNA构象变化,使SPUR GAA区域更容易接受Pur结合。Sp1:Pur蛋白复合物显示出对双链DNA的严格要求。单品牌SPUR探针不能结合Sp1:Pur蛋白复合物,尽管这些探针在天然或突变序列环境中完全能够单独结合Pur蛋白。能够结合Pur蛋白的单品牌SPUR探针可能表现出双链SPUR无法提供的构象灵活性,这可能是由于结合的Sp1/3蛋白施加的限制。这些观察非常重要,因为它们表明,Sp1:Pur:dsSPUR三元复合物不是由Pur蛋白与柔性单链DNA的机会主义相互作用形成的。相反,数据表明,一种新的Sp1:Pur蛋白复合物与构象受限的双链SPUR元件特异结合。

其他潜在的Pur蛋白伴侣包括TEF1,之前证明其可以结合包含SMA增强子中肌肉特异性MCAT元件的双链DNA(太阳., 1995). 虽然MSY1也被鉴定为MCAT位点的Pur蛋白伴侣,但这种DNA结合蛋白不是新鉴定的双链SPUR蛋白复合体的组成部分,尽管与Pur一样,MSY1与SPUR的前链结合良好。奇怪的是,SPUR的前链富含嘌呤,与对MSY1具有高亲和力的MCAT的反链富含嘧啶的链有很大不同(科根., 1995). 对这种差异的一种解释是,MSY1与SPUR的前向富含嘌呤链的结合可能是间接的,并通过与Pur蛋白的直接物理相互作用介导,Pur蛋白是SMA增强子中富含嘌呤单链元件的主要占有者(克尔姆.,1999年b;卡利尼., 2002). 无论MSY1与前向型SPUR相互作用的实际基础如何,我们的数据清楚地表明,在双链SPUR形成Sp1:Pur复合物使得该元素无法用于MSY1结合。鉴于MSY1具有显著的增强Pur蛋白介导的动脉平滑肌细胞SMA基因抑制的能力(克尔姆., 2003),将其排除在双链SPUR之外,可能通过TGFβ1快速而有力地激活SMA增强子,在肌成纤维细胞分化中提供特定的功能优势。根据其对SMA转录活性的失活作用,MSY1在其他系统中以其促进单链DNA构象状态的能力而广为人知,这可能会在缺乏TGFβ1基信号的情况下进一步降低SPUR元件转录激活的发生率(松本和沃尔夫,1998年).

转化生长因子β1信号转导对SMA增强子转录调控蛋白相互作用的影响

从我们的研究中得出的一个重要概念是,Pur蛋白是SMA基因转录的天然抑制剂,除非存在改变增强子中DNA构象或提供能够中和Pur蛋白抑制的限速活化蛋白的微环境条件。我们发现TGFβ1能够改变Sp1和Pur蛋白的物理相互作用,最终结果是在SMA增强子激活期间,双链SPUR DNA对Pur结合的亲和力降低。在TGFβ1受体参与后,Smad蛋白很快在成纤维细胞核中变得可用,并且似乎在控制肌成纤维细胞分化过程中SMA基因表达的大小和/或持续时间方面起着重要的速率控制作用(科根., 2002). 我们目前的研究没有解决Smad蛋白是否直接改变Pur蛋白与dsSPUR DNA的物理相互作用。然而,Smad蛋白似乎确实影响Pur:Sp1蛋白与蛋白质的相互作用,鉴于文献中支持Smad蛋白可以通过物理隔离转录阻遏物来激活基因这一观点的证据,这一点特别有趣。Hox同源域蛋白家族成员在与同源DNA位点结合时抑制转录。转化生长因子β超家族的一个成员,骨形态发生蛋白,使用Smad蛋白中间物来减轻骨桥蛋白启动子的抑制(., 1999). 抑郁症似乎是通过Smad1蛋白结合和Hoxc-8从DNA中移位而发生的。该小组最近还发现,Smad4在TGFβ1介导的骨桥蛋白基因转录激活中,以物理方式取代同一启动子中的Hoxc-9阻遏物(., 2001). 虽然基于Smad的SMA基因去表达的细节尚不完整,但Pur/Pyr-rich THR区域确实包含Pur蛋白的一个功能重要的DNA结合位点,可以通过Pur和Smad2/3之间的物理相互作用间接将Smad招募到THR。此外,THR区域包含一致的CAGA基序,可在Pur招募后稳定Smad蛋白结合。然而,THR中蛋白质与DNA的相互作用可能非常复杂。特别是,最近的一份报告显示,干扰素-γ是一种有效的抗纤维化细胞因子,通过增强YB-1与Smad3的相互作用,阻断了α2前胶原基因的TGFβ1激活(东(Higashi)., 2003). THR含有人类YB-1的小鼠同源物MSY1的结合位点,提出了一种有趣的可能性,即Pur:Smad3和MSY1:Smad2复合物之间的动态相互作用可能以某种未知的方式控制SMA增强子这一区域的转录输出。此外,鉴于报告表明CAGA基序本身对Smad结合既不必要也不充分,可能需要THR两侧的核苷酸序列(马萨格和沃顿,2000年).

在TGFβ1激活后,我们推测核Smads可能结合并取代双链SPUR中的Pur蛋白,但不会改变Sp1转录激活物的结合(科根., 2002). 同时,TGFβ1信号转导可以改变THR处Pur蛋白的结合,从而揭示位于那里的几个CAGA基序中的一个隐蔽的双链Smad结合位点。THR和SPUR由105个碱基对分开,理论上可能位于单个核小体中两个相邻的80碱基对DNA环内(Wolffe,1998年). 因此,TGFβ1激活的肌成纤维细胞中SPUR和THR之间的物理和功能联系可能是在核小体堆积和/或染色质折叠的背景下完成的。SMA基因阻遏的一个工作模型将Pur蛋白置于双链SPUR和THR,其中富含嘌呤的单链位点可能因MSY1在相反富含嘧啶的链上的协同作用而暴露。基质成纤维细胞对TGFβ1的已知生理反应的一个关键特征是瞬时激活,在该模型中可以通过1)部署核Smad,2)Smad辅助在SPUR从Sp1中去除Pur蛋白,3)核Smad随后快速转换,最后4)TGFβ1受体占据后24小时内SPUR处Sp1:Pur阻遏物复合体的重新表达。核Smad的转换可能使Pur和MSY1蛋白在THR处快速重新配置受抑制的单链DNA构象状态。与SPUR的情况不同,TGFβ1信号似乎并没有物理上取代THR位点的Pur,因此它可能很容易与MSY1合作,并有效地改造THR抑制的十字构型。THR的这些假设事件也可能通过损伤其同源TEF1结合蛋白终止附近MCAT元件的转录活性(卡利尼., 2002)从而重建低水平的SMA基因输出。随后MSY1与SPUR的结合可能通过增强Pur蛋白的抑制性抓握进一步稳定转录抑制(克尔姆., 2003)和/或破坏SMA增强子此区域的双链DNA结构,以防止Sp1结合。

Pur蛋白异构体在肌成纤维细胞激活中的差异作用及其在慢性排斥反应病理生物学中的意义

在与小鼠SMA基因转录控制相关的两种Pur蛋白中,只有对SMA增强子的Purα抑制被TGFβ1或Smads中和。Purβ似乎缺乏参与肌成纤维细胞中基于TGFβ1的SMA基因激活的能力,并作为显性负型调节蛋白发挥作用。然而,我们最近对主动脉平滑肌细胞中SMA启动子调控的研究清楚地表明,血清反应因子可以减轻Purβ基的抑制,而血清反应因子是平滑肌细胞的一个重要谱系决定因子,与心肌蛋白相互作用,指导小鼠的心血管发育和血管维持(克尔姆., 2003). 这些观察结果表明,Purβ对SMA转录的负面影响可能被SRF介导的发育信号所抵消,SRF旨在允许基本肌肉收缩蛋白(如SMA)在血管平滑肌细胞中长期积累。相反,炎症损伤反应中暂时积累的激活物(如Smad蛋白)似乎缺乏覆盖Purβ阻遏的能力,因此可能与需要以空间或时间限制的方式战略性控制SMA基因激活的途径更相关,例如基于肌纤维母细胞的伤口愈合。我们的数据清楚地表明,Purα是与SMA转录去表达同时从SPUR中释放出来的,需要进一步研究来确定这种DNA结合行为是否是Purα亚型所特有的。如果存在功能差异,Pur蛋白基因表达的失调或它们与增强子DNA和/或转录激活剂(如Sp1或Smads)的相互作用可以解释包括CAD在内的慢性纤维化疾病的一些病理生物学特征。我们发现,在未移植的成年小鼠心脏中,Pur蛋白水平非常低,但在接受心脏移植后,Pur蛋白质水平显著升高,显示出慢性排斥反应的迹象。免疫组织学分析先前表明,当慢性排斥反应和移植血管硬化首次变得明显时,移植后30天接受的心脏移植物中观察到的核Pur蛋白水平升高,主要是由于间质和血管周围肌成纤维细胞的积聚所致(Subramanian语., 2002).

我们在本报告中还证明,出生后小鼠心室中的α-actin基因重编程发生在以Purβ高水平表达为特征的发育期。尽管是间接的,但这一发现与Purβ对成纤维细胞中SMA基因转录的有效抑制作用以及我们最近对主动脉平滑肌细胞的研究一致(克尔姆., 2003). 胚胎晚期小鼠心脏发育的特点是心肌细胞中胎儿SMA基因完全下调,编码心肌肌动蛋白特异性亚型的基因协同上调(麦克休., 1991;古玛., 1997). 我们推测,Purβ参与了α-肌动蛋白基因的重新编程过程,新生小鼠心室中Purβ的高水平表达反映了心脏α-肌动蛋白在成熟心脏中积累时遗留和持续的SMA基因抑制。有趣的是,高水平的Purβ与心力衰竭动物模型相关,并且在从慢性心力衰竭患者身上取下的活检中也观察到类似的结果(古普塔., 2003). 这些研究人员表明,Purβ可以抑制转染心肌细胞中α-肌球蛋白重链基因启动子的表达,因此可以作为人类心脏病基因沉默和心室重塑的新标志物。

总之,我们发现SMA启动子的SPUR区域与Sp1具有高亲和力,也与Pur蛋白结合。Sp1:Pur复合物依赖于DNA构象,对TGFβ1敏感。Smad 2/3蛋白是TGFβ1受体信号传导的关键介质,它破坏了Sp1和Pur蛋白之间的物理相互作用,但自身却与Pur蛋白以及THR中的DNA序列元件结合,THR是已知的一个区域,在TGFβ(贝克尔., 2000). 因此,Pur阻遏蛋白可能在SMA增强子中占据战略地位,利用其结合单链和双链DNA的不同寻常的能力,以及暂时协调两个新识别的蛋白质伙伴Smad 2/3和Sp1的作用,驱动TGFβ1激活的肌成纤维细胞中SMA基因的激活。Pur蛋白的新兴且非常有趣的功能特性为开发治疗和预防慢性疾病的治疗策略提供了新的见解,例如动脉硬化、肝、肺、肾和心脏的特发性纤维化,SMA基因表达调控不良的心脏移植功能障碍。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)对A.R.S.的HL-70294和HL-60876资助,对R.J.K.的HL-54281资助,以及对J.A.P.的美国心脏协会产前研究金0215142B资助。

笔记

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc。E04–04–0348。文章和出版日期可在www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E04–04–0348.

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会