Pur抑制蛋白与Sp1/Smad辅活化因子动态相互作用诱导转化生长因子β1激活的肌成纤维细胞血管平滑肌α-肌动蛋白基因转录

蛋白质提取物的制备和电泳迁移率变化分析（EMSA）

用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞单层两次，刮入新鲜的PBS中，以3000 rpm的转速沉淀，在PBS中再次冲洗，并在八个低渗缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.9，1.5 mM MgCl）中重新悬浮₂，10 mM KCl，0.2 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，0.5 mM二硫苏糖醇[DTT]）。细胞在冰上膨胀10分钟，然后转移到Dounce均质机，用B型杵进行处理。以4000 rpm离心15分钟，从破裂的细胞中收集细胞核，并将其悬浮在半包装的冰镇低盐缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，25%甘油，1.5 mM MgCl）中₂，0.02 M KCl，0.2 mM EDTA，0.2 mM PMSF，0.5 mM DTT）。高盐缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，25%甘油，1.5 mM MgCl₂添加等于半填充颗粒体积的1.2 M KCl、0.2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、0.5 mM DTT），并在4°C下轻轻摇动进一步提取细胞核30 min。以14500 rpm离心30 min收集细胞核，并用50体积的透析缓冲液透析，透析缓冲液含有20 mM HEPES、pH 7.9、20%甘油、100 mM KCl、0.2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、0.5 mM DTT。透析后，通过14500 rpm离心20 min收集上清液，用于生化分析。使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（1×PBS，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，0.2 mM PMSF，0.5 mM DTT）在0.6 ml/100-mM培养板上从PBS冲洗单层制备全细胞提取物，然后在4°C下轻轻摇晃15 min。将粘附的裂解细胞残留物刮入0.3 ml RIPA缓冲液中，并与原始裂解液合并到单个微离心管中，以10000×克在4°C下保持10分钟。如前所述，从新生儿（4、6、9和13天大）、8至10周大的成年人和心脏同种异体移植物中制备小鼠心室组织提取物(Subramanian语等., 2002). 如前所述，对细胞和组织提取物进行EMSA和超移EMSA(科根等., 2002;Subramanian语等., 2002).

DNA结合分析（DBA）

本研究中使用的合成寡核苷酸探针对应于小鼠SMA 5′-侧翼区域的序列(分钟等., 1990). 将含有核提取物（100μg蛋白质）和生物素化寡核苷酸（100 pmol；Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）的反应混合物培养在含有聚（dI-dC）、10 mM Tris、pH 7.5、50 mM NaCl、0.5 mM DTT、0.5 mM-EDTA、0.12 mM PMSF、4%甘油的反应混合物中。蛋白质：生物素：如前所述，在链霉亲和素固定的顺磁性颗粒上捕获DNA复合物（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州；0.6毫升/反应，30分钟培养）(克尔姆等。, 2003). 用含有25 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA和100 mM NaCl的缓冲液洗涤四次后，用2×蛋白质变性缓冲液洗脱结合蛋白，并通过SDS-PAGE和免疫印迹程序进行分析。

哺乳动物蛋白过表达质粒、细胞转染和报告基因检测

使用Mirus（Invitrogen，San Diego，CA）转染试剂和制造商提供的方案，用上述SMA启动子的优化混合物转染40–50%合流的成纤维细胞：报告融合质粒VSMP4和VSMP8，和/或编码各种转录调控蛋白的质粒(科根等., 2002). 编码人类Sp1和人类Smad 2/3/4蛋白的质粒分别由J.Horowitz博士（北卡罗来纳州立大学罗利分校）和L.Choy博士和R.Derynk博士（加利福尼亚大学旧金山分校）提供。使用QIAGEN制备树脂和制造商提供的协议（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENE）纯化质粒。转染48小时后，用冷PBS清洗细胞三次，然后使用氯霉素乙酰转移酶（CAT）酶联免疫吸附测定（ELISA）裂解缓冲液（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）进行裂解。在14000×克在4°C下保存10分钟，并在-20°C下储存，然后进行分析。提取物中的总蛋白通过比色法测定（Pierce Chemical，Rockford，IL）。通过免疫印迹评估同等数量的裂解蛋白，以验证蛋白过度表达。使用商业ELISA试剂盒（罗氏应用科学公司）测定CAT报告基因活性。报告基因表达相对于总细胞蛋白进行了标准化，转染按常规进行三次，重复三到五次。对数据集进行方差分析，以评估数据集的统计显著性（p<0.05）。

蛋白质免疫沉淀

在200μl溶液D（20 mM HEPES，pH 7.9，100 mM KCl，0.2 mM EDTA，20%甘油，1 mM DTT，0.2 mM PMSF）中，将来自成纤维细胞的核或全细胞蛋白提取物（100μg）与商业（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）H-tag（针对Pur蛋白）或DYKDDDDK-tag特异性（针对Smad）抗体（2μg）结合。在旋转平台混合器上于4°C下孵育1小时后，添加之前在溶液D中洗涤并悬浮的20μl蛋白G-琼脂糖（Sigma-Aldrich）小份，并在4°C条件下旋转孵育16小时。通过在4°C下以2500 rpm离心5 min收集带有固定蛋白的琼脂糖珠，用PBS洗涤四次，悬浮在1×SDS-PAGE样品缓冲液中，在95°C下加热5 min，并通过SDS-PACE和选择抗体的免疫印迹评估释放的蛋白。

TGFβ1及其受体相关Smad蛋白改变Pur蛋白相互作用

因为SPUR区域包含先前报道的TCE，参与TGFβ1对成纤维细胞SMA启动子的调节(科根等., 2002)，我们检测了在存在和不存在这种肌成纤维细胞分化的基本生长因子介质的情况下Pur与SPUR的结合。DBA对暴露于5 ng/ml TGFβ1 1 1或6 h后从肌成纤维细胞制备的核蛋白提取物进行评估。TGFβ1治疗6小时后，Pur结合减少了四倍，这是双链SPUR的特异性(图3). 在存在TGFβ1的情况下，Sp1转录激活物与双链SPUR的结合没有改变，这与我们之前的观察一致，即在肌成纤维细胞分化过程中，与SMA增强子的净Sp1/Sp3结合没有增加(科根等., 2002). Western blot分析显示，暴露于TGFβ1 6 h后，成纤维细胞核提取物中Pur蛋白水平没有降低（未公布的数据）。这一发现表明，尽管在TGFβ1激活的肌成纤维细胞中可以检测到Pur蛋白，但它似乎不太能够结合双链SPUR DNA。有趣的是，在TGFβ1治疗期间，MSY1与单链（正向）SPUR的结合适度增强(图3). 暴露于TGFβ1 6 h后，在原代人肺肌成纤维细胞中观察到Pur和MSY1蛋白的类似趋势（未发表数据）。

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图3。

从TGFβ1激活的肌成纤维细胞制备的核提取物DBA。用于免疫印迹的抗体显示在每个面板的左侧。在TGFβ1暴露6小时后，与dsSPUR探针结合的Pur蛋白减少了四倍。

进行蛋白质免疫沉淀实验，以检查Sp1和Pur蛋白之间物理关联的可能性，这可能解释了它们对双链SPUR的联合亲和力，并为TGFβ1对Pur蛋白与SPUR相互作用的调节影响提供了控制点。在存在或不存在TGFβ1的情况下，从培养6 h的肌成纤维细胞制备的核提取物与Sp1特异性抗体孵育，然后使用泛特异性Pur蛋白抗体对沉淀物质进行Western blot评估。Sp1抗体从对照提取物中免疫沉淀Pur蛋白，而从TGFβ1处理后制备的提取物中收集的Pur蛋白明显较少(图4A). 总核蛋白的蛋白质印迹显示对照组和处理组提取物中Pur蛋白和Sp1的数量相等(图4A，底部），表明TGFβ1最有可能损害蛋白质：蛋白质相互作用，而不是降低这些蛋白质的净可用性。

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图4。

来自成纤维细胞的Sp1:Pur蛋白复合物的免疫沉淀。（A） 从无血清（对照）AKR-2B成纤维细胞核提取物中分离出的Sp1免疫沉淀物含有显著的Purα和Purβ带，通过使用泛特异性抗Pur抗体的Western blot分析显示。在TGFβ1暴露6小时期间，肌成纤维细胞分化伴随着Sp1:Pur蛋白相互作用的减少。暴露于TGFβ1对核提取物中Pur蛋白亚型水平无明显影响（下图）。（B） 用Sp1特异性抗体对转染空表达质粒（-）或含有编码Smad 2、3和4（+）cDNA的等摩尔质粒混合物的COS7成纤维细胞分离的Pur蛋白免疫沉淀进行Western blot处理。转染Smad表达质粒不会影响Sp1蛋白的净表达（底部），但会显著削弱Sp1:Pur蛋白的相互作用（顶部）。

Smad蛋白2、3和4在创伤愈合过程中介导肌成纤维细胞中的TGFβ1受体信号传导，并强烈激活天然SMA基因(科根等., 2002). 扩展中显示的数据图4A，我们研究了Smad蛋白过度表达对转染COS7成纤维细胞中Sp1和Pur蛋白物理结合的影响。Pur蛋白抗体能够从未转染的COS7成纤维细胞免疫沉淀天然Pur:Sp1复合物，但不能从编码Smad 2、3和4的表达载体的等摩尔组合转染的细胞免疫沉淀(图4B). Western blot分析显示，在未转染的对照细胞和过度表达Smad蛋白的细胞中，天然Sp1的数量相等(图4B，底部）。数据显示在图4，A和B，表明TGFβ1及其受体调节的Smad信号剂都可以改变Sp1和Pur蛋白之间的物理相互作用。

Pur蛋白是成纤维细胞中有效的SMA转录抑制因子

我们实验室的先前结果表明，Purβ（而非Purα）是主动脉平滑肌细胞中小鼠SMA启动子的有效阻遏物(克尔姆等., 2003). 为了研究Sp1:Pur蛋白相互作用对成纤维细胞SMA增强子活性的功能影响，我们将COS7肾成纤维细胞中Smads 2/3/4、Purα、Purβ和Sp1的组合与SMA增效剂：CAT报告基因融合构建物（称为VSMP4）共转染。VSMP4中包含的191碱基对增强子片段包括SPUR、TCE、MCAT、THR和CArG B元件，这些元件对成纤维细胞中SMA的基础转录和TGFβ1诱导转录都是必要的(培养等., 1992;科根等., 2002). 与它们在动脉平滑肌细胞中的行为相反，我们惊讶地发现，两种Pur蛋白在抑制转染成纤维细胞中的基底和Sp1增强型SMA增强子输出方面同样有效(图5A). 更有趣的是，Smad 2/3/4的过度表达不仅消除了Purα对VSMP4的抑制，而且还中和了Purβ对Sp1存在时VSMP4激活的负面影响(图5B). 相反，Smad蛋白不能有效缓解Purβ单独或与Purα联合过度表达的成纤维细胞中SMA增强子的抑制(图5C). 显然，无论是在基础状态还是Sp1激活状态，Smad蛋白都能够覆盖SMA增强子的抑制，但只有当抑制由Purα而非Purβ介导时。Western blot分析证实转染COS7成纤维细胞中Smad 2/3/4和Pur蛋白过度表达(图5D). 为了将这些结果与TGFβ1受体介导的肌成纤维细胞激活进行比较，我们检测了Pur蛋白过度表达对AKR-2B成纤维细胞SMA转录激活的影响，这些成纤维细胞在转染TGFβ2后通过通常的受体途径激活内源性Smad。尽管这两种Pur蛋白都能破坏肌成纤维细胞中SMA增强子的TGFβ1激活，但Purβ表现出明显的阻遏作用，其效力是Purα的三到四倍(图6A). 当与Purα共表达时，与COS7成纤维细胞相比，Smads在AKR-2B成纤维细胞中的SMA增强子去抑制作用较弱。这一观察结果可能与每个成纤维细胞系中天然Pur蛋白水平的差异和/或SMA增强子激活因子（如Sp1、TEF1或SRF）的可用性有关。最后，3.6-kb VSMP8小鼠SMA启动子构建物的Smad激活，先前显示可在许多转基因小鼠系中驱动高水平、平滑肌组织特异性过度表达（Wang等.,1997,1998;前田等., 1999;三月等., 1999;麦格劳等., 1999;诺贝等., 2001;Gokturk公司等., 2003)在COS7成纤维细胞中也被Pur蛋白的过度表达所抑制(图6B). 作为Smad激活的VSMP8的阻遏物，Purβ的效力几乎是Purα的10倍。

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图5。

Pur蛋白作为转染COS7成纤维细胞中SMA增强活性的双峰介质。（A） 两种Pur蛋白都能抑制Sp1介导的SMA增强子激活。（B） Smad蛋白是SMA增强子的强效激活剂，可以中和Purα介导的抑制，无论是否含有Sp1。（C） Purβ表现为显性阴性型阻遏物，不受Smad或Sp1蛋白过度表达的影响。对于A到C，单个转染中包含的表达质粒用（+）表示。（D） 通过使用Pur蛋白特异性多克隆抗体进行Western blot分析，验证转染COS7成纤维细胞中的蛋白过度表达（top）；Smad 2、3和4（中间）；或Sp1（底部）。1号通道（所有面板），非转染COS7成纤维细胞提取物；通道2–4，COS7成纤维细胞的提取物，转染了Purα单独表达质粒（通道2，顶部）、Smad2/3/4（通道2中，中间）、Sp1（通道2、底部）、Purβ单独表达载体（通道3，顶部）或Purα和Purβ两者（通道4，顶部）。

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图6。

AKR-2B成纤维细胞中Pur蛋白的过度表达通过TGFβ1或Smad蛋白减弱SMA增强子和全长启动子的激活。（A） TGFβ1、Smad2/3/4或两者的组合对转染的成纤维细胞中VSMP4增强子的激活被Purα过表达显著抑制，并被Purβ完全抑制。将通道2、3和4与通道5、6和7（Purα介导的抑制）或通道8、9和10（Purβ介导的阻遏）进行比较。（B） Smad介导的AKR-2B成纤维细胞中全长VSMP8启动子的激活被Purα和Purβ显著抑制。将车道5与车道6（Purα介导的抑制）或车道7（Purβ介导的阻遏）进行比较。VSMP8启动子通常在成纤维细胞中转录沉默，但被TGFβ1或Smad信号转导中间蛋白激活（比较通道1和5）。对于A和B，用于每次转染的各种处理和/或表达质粒组合显示在底部。

SMA激活蛋白Smad2/3/4和Sp1与Pur阻遏蛋白物理结合，但在SMA增强子中占据不同的DNA结合位点

上述结果表明，在双链SPUR中，Sp1和Pur蛋白之间存在物理相互作用，Smad蛋白似乎可以抵消SMA增强子对Purα的抑制。我们假设肌成纤维细胞中可能存在多蛋白复合物，例如，它可以促进Pur蛋白阻断的SMA增强子的Smad蛋白去表达。为了支持这一观点，从COS7成纤维细胞中收集的Smad蛋白免疫沉淀物，其过度表达H标记的Pur蛋白，结合DYKDDDDK标记的Smads 2/3/4版本，被观察到含有Purα和Purβ(图7，车道5-8）。此外，在没有Smads的情况下，从共表达Sp1和H-tagged Pur蛋白的细胞中收集Sp1免疫沉淀物，以表明表位标记不会对Pur结构产生不利影响，正如其结合Sp1的能力未受损所评估的那样(图7，1-4车道）。此外，阴性对照实验用于监测与免疫沉淀（IP）抗体的非特异性相互作用(图7或用于收集沉淀蛋白的亲和珠(图7，无IP）显示H标记Pur蛋白没有假结合相互作用。

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图7。

转染COS7成纤维细胞中Smad 2/3:Pur蛋白复合物的证据。从过度表达Sp1（1-4道）或Smad 2/3/4（5-8道）的COS7成纤维细胞制备的核蛋白提取物用Sp1或Smad特异性抗体进行IPed（如每个面板底部所示），并使用左侧所示抗体进行Western blot（WB）处理。Sp1（IP:Sp1）和Smad（IP:Flg-Smad）免疫沉淀物均含有Purα和Purβ，但用Smad 7阴性对照抗体处理的样品没有（IP:Smad 7）。没有一种过表达的蛋白质表现出与亲和分离珠的非特异性结合（无IP）。如底部两个面板所示，通过核蛋白提取物的Western blot分析验证蛋白质过度表达。标记为“ns”的带没有详细研究，但可能代表共价修饰的Pur蛋白亚型（未公布的数据）。

我们推断，鉴定Smad蛋白的DNA结合位点将有助于阐明191碱基对SMA增强子内相互作用的Pur蛋白、Smad和Sp1之间的空间关系。如Western blot分析所示图85 ng/ml TGFβ1暴露后1 h内，Smads 2和Smads 3在AKR-2B成纤维细胞细胞核内积聚。然而，Sp1水平不受生长因子处理的影响，并且在细胞核中含量较高。有趣的是，DBA使用暴露于TGFβ1后2 h制备的成纤维细胞核提取物，显示Smad 2/3优先与双链THR探针结合，而Sp1与含有更多3′双链SPUR位点的探针密切相关，这证实了先前的观察结果(图8). 与SPUR结合的Smad蛋白并不明显高于双链MCAT探针或双链非特异性序列控制探针观察到的结果，但与含有已知Smad结合元件（SBE）的双链阳性对照探针相比具有可比性。总之，尽管Pur阻遏物与肌成纤维细胞中的Sp1和Smad激活物发生物理相互作用，但每个激活物都结合SMA增强子的不同区域。鉴于先前的一份报告显示TGFβ1通过促进THR区域内的DNA构象变化来激活肌成纤维细胞中SMA的转录，Smad 2/3与SMA增强子的THR组分的优先相互作用是令人感兴趣的(贝克尔等., 2000).

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图8。

肌成纤维细胞中的SMA增强子激活蛋白具有不同的亚细胞定位和增强子结合特异性。左，暴露于TGFβ1 24小时后，从AKR-2B成纤维细胞制备的核蛋白提取物的Smad和Sp1蛋白印迹。Smad 2和3在TGFβ1处理后1 h内进入细胞核，而细胞核Sp1水平则一致较高。对，DBA使用TGFβ1激活的肌成纤维细胞的核提取物和来自SMA增强子的各种dsDNA探针（见顶部）。Smad和Sp1增强子激活蛋白结合到SMA增强子的不同区域。

肌成纤维细胞DNA结构与SMA转录调控

在肌成纤维细胞中，TEF1、Sp1/3、Smad 2/3和SRF转录调控蛋白都与双链DNA结合，并作为SMA增强子的激活剂发挥作用，而Purα、Purβ和MSY1对单链DNA表现出明显的偏好，并作为阻遏物发挥作用(科根等., 1995;太阳等., 1995;克尔姆等.，1999年a;科根等., 2002). Kelm及其同事已经证明，TEF1激活剂和Purα/Purβ/MSY1阻遏物之间的竞争性相互作用可以调节SMA增强子的Pur/Pyr-rich区域的启动子输出，该区域含有一个具有高电位的反向重复序列，从而在热力学稳定的十字形结构中形成暴露的单链环(克尔姆等.，1999年a;贝克尔等., 2000;卡利尼等., 2002). 我们现在通过显示Pur阻遏蛋白也与Sp1激活物竞争来扩展这些发现，但在一个明显不同的SMA增强子双链区域，即SPUR元件。与Pur/Pyr-rich区域不同，SPUR不包含允许未折叠DNA结构的明显反向重复序列。以前在小鼠脑中观察到Pur和Sp1蛋白之间的功能性相互作用，认为复合物控制髓鞘碱性蛋白（MBP）基因的转录(特雷蒂亚科娃等., 1999). 在这个系统中，与Sp1的物理相互作用增强了Purα与其靶单链序列相互作用以驱动MBP启动子激活的能力。类似地，在U937单核细胞系的分化过程中，Purα和Sp1协同诱导CD11cβ-整合素基因转录，该转录是促进炎症期间单核细胞与内皮细胞粘附所必需的(雪莱等., 2002). 在CD11c启动子中，Sp1与双链序列结合，而Purα结合严格限制于单链DNA靶。相反，我们的结果表明，Pur蛋白与含有高亲和力Sp1结合位点的SMA增强子区域的双链和单链元素相互作用。此外，在存在TGFβ1的情况下，Pur与双链SPUR DNA的结合被显著破坏，这表明Pur蛋白与SPUR处双链DNA的结合与基因抑制状态有关，而不是像MBP和CD11c启动子那样激活。Pur与双链SPUR的结合需要一个新的含有3′GAA的基序加上一个完整的GC-rich Sp1位点，这与之前的Sp1占有率对于Pur与双链SPUR的相互作用是至关重要的（尽管不是唯一的决定因素）的想法相一致。Pur与双链SPUR的结合可能需要与Sp1的物理相互作用和/或由蛋白质复合物介导的DNA构象变化，这些变化使SPUR的GAA区域更容易接受Pur的结合。Sp1:Pur蛋白复合物显示出对双链DNA的严格要求。单品牌SPUR探针不能结合Sp1:Pur蛋白复合物，尽管这些探针在天然或突变序列环境中完全能够单独结合Pur蛋白。能够结合Pur蛋白的单品牌SPUR探针可能表现出双链SPUR无法提供的构象灵活性，这可能是由于结合的Sp1/3蛋白施加的限制。这些观察非常重要，因为它们表明，Sp1:Pur:dsSPUR三元复合物不是由Pur蛋白与柔性单链DNA的机会主义相互作用形成的。相反，数据表明，一种新的Sp1:Pur蛋白复合物与构象受限的双链SPUR元件特异结合。

其他潜在的Pur蛋白伴侣包括TEF1，之前证明其可以结合包含SMA增强子中肌肉特异性MCAT元件的双链DNA(太阳等., 1995). 虽然MSY1也被鉴定为MCAT位点的Pur蛋白伴侣，但这种DNA结合蛋白不是新鉴定的双链SPUR蛋白复合体的组成部分，尽管与Pur一样，MSY1与SPUR的前链结合良好。奇怪的是，SPUR的前链富含嘌呤，与对MSY1具有高亲和力的MCAT的反链富含嘧啶的链有很大不同(科根等., 1995). 对这种差异的一种解释是，MSY1与SPUR的前向富含嘌呤链的结合可能是间接的，并通过与Pur蛋白的直接物理相互作用介导，Pur蛋白是SMA增强子中富含嘌呤的单链元素的主要占有者(克尔姆等.，1999年b;卡利尼等., 2002). 无论MSY1与前向型SPUR相互作用的实际基础如何，我们的数据清楚地表明，在双链SPUR形成Sp1:Pur复合物使得该元素无法用于MSY1结合。鉴于MSY1具有显著的增强Pur蛋白介导的动脉平滑肌细胞SMA基因抑制的能力(克尔姆等., 2003)，将其排除在双链SPUR之外，可以通过TGFβ1快速而有力地激活SMA增强子，从而在肌成纤维细胞分化中提供特定的功能优势。根据其对SMA转录活性的失活作用，MSY1在其他系统中以其促进单链DNA构象状态的能力而广为人知，这可能会在缺乏TGFβ1基信号的情况下进一步降低SPUR元件转录激活的发生率(松本和沃尔夫，1998年).

转化生长因子β1信号转导对SMA增强子转录调控蛋白相互作用的影响

从我们的研究中得出的一个重要概念是，Pur蛋白是SMA基因转录的天然抑制剂，除非存在改变增强子中DNA构象或提供能够中和Pur蛋白抑制的限速活化蛋白的微环境条件。我们发现TGFβ1能够改变Sp1和Pur蛋白的物理相互作用，最终结果是在SMA增强子激活期间，双链SPUR DNA对Pur结合的亲和力降低。在TGFβ1受体参与后，Smad蛋白很快在成纤维细胞核中变得可用，并且似乎在控制肌成纤维细胞分化过程中SMA基因表达的大小和/或持续时间方面起着重要的速率控制作用(科根等., 2002). 我们目前的研究没有解决Smad蛋白是否直接改变Pur蛋白与dsSPUR DNA的物理相互作用。然而，Smad蛋白似乎确实影响Pur:Sp1蛋白与蛋白质的相互作用，鉴于文献中支持Smad蛋白可以通过物理隔离转录阻遏物来激活基因这一观点的证据，这一点特别有趣。Hox同源域蛋白家族成员在与同源DNA位点结合时抑制转录。转化生长因子β超家族的一个成员，骨形态发生蛋白，使用Smad蛋白中间物来减轻骨桥蛋白启动子的抑制(史等., 1999). 抑郁症似乎是通过Smad1蛋白结合和Hoxc-8从DNA中移位而发生的。该小组最近还发现，Smad4在TGFβ1介导的骨桥蛋白基因转录激活中，以物理方式取代同一启动子中的Hoxc-9阻遏物(史等., 2001). 虽然基于Smad的SMA基因去表达的细节尚不完整，但Pur/Pyr-rich THR区域确实包含Pur蛋白的一个功能重要的DNA结合位点，可以通过Pur和Smad2/3之间的物理相互作用间接将Smad招募到THR。此外，THR区域包含一致的CAGA基序，可在Pur招募后稳定Smad蛋白结合。然而，THR中蛋白质与DNA的相互作用可能非常复杂。特别是，最近的一份报告显示，干扰素-γ是一种有效的抗纤维化细胞因子，通过增强YB-1与Smad3的相互作用，阻断了α2前胶原基因的TGFβ1激活(东（Higashi）等., 2003). THR含有人类YB-1的小鼠同源物MSY1的结合位点，提出了一种有趣的可能性，即Pur:Smad3和MSY1:Smad2复合物之间的动态相互作用可能以某种未知的方式控制SMA增强子这一区域的转录输出。此外，鉴于有报道表明CAGA基序本身对Smad结合既不必要也不充分，可能需要THR侧翼的核苷酸序列(马萨格和沃顿，2000年).

在TGFβ1激活后，我们推测核Smads可能结合并取代双链SPUR中的Pur蛋白，但不会改变Sp1转录激活物的结合(科根等., 2002). 同时，TGFβ1信号转导可以改变THR处Pur蛋白的结合，从而揭示位于那里的几个CAGA基序中的一个隐蔽的双链Smad结合位点。THR和SPUR由105个碱基对分开，理论上可能位于单个核小体中两个相邻的80碱基对DNA环内(沃尔夫，1998年). 因此，TGFβ1激活的肌成纤维细胞中SPUR和THR之间的物理和功能联系可能是在核小体堆积和/或染色质折叠的背景下完成的。SMA基因阻遏的一个工作模型将Pur蛋白置于双链SPUR和THR，其中富含嘌呤的单链位点可能因MSY1在相反富含嘧啶的链上的协同作用而暴露。基质成纤维细胞对TGFβ1的已知生理反应的一个关键特征是瞬时激活，在该模型中可以通过1）部署核Smad，2）Smad辅助在SPUR从Sp1中去除Pur蛋白，3）核Smad随后快速转换，最后4）在TGFβ1受体占据后24小时内，Sp1:Pur阻遏物复合物在SPUR处重新连接。核Smad的转换可能使Pur和MSY1蛋白在THR处快速重新配置受抑制的单链DNA构象状态。与SPUR的情况不同，TGFβ1信号似乎并没有物理上取代THR位点的Pur，因此它可能很容易与MSY1合作，并有效地改造THR抑制的十字构型。THR的这些假设事件也可能通过损伤其同源TEF1结合蛋白终止附近MCAT元件的转录活性(卡利尼等., 2002)从而重建低水平的SMA基因输出。随后MSY1与SPUR的结合可能通过增强Pur蛋白的抑制性抓握进一步稳定转录抑制(克尔姆等., 2003)和/或破坏SMA增强子此区域的双链DNA结构，以防止Sp1结合。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对A.R.S.的HL-70294和HL-60876资助，对R.J.K.的HL-54281资助，以及对J.A.P.的美国心脏协会产前研究金0215142B资助。