β细胞复制是维持出生后β细胞质量的主要机制

摘要

介绍

β细胞质量在决定胰岛素分泌量方面起着至关重要的作用，胰岛素分泌量是为了将身体的葡萄糖水平维持在一个狭窄的范围内。越来越多的证据表明，β细胞质量是动态的，胰岛素需求的变化会导致β细胞质量的快速显著变化(1–三). β细胞的质量由平衡β细胞生长（分化和复制）和β细胞死亡（凋亡）控制。调节β细胞质量参数的分子基础尚不清楚(4). 了解β细胞质量的调节尤其重要，因为内分泌胰腺无法补偿不断变化的胰岛素需求，这可能是糖尿病的发病机制之一(5–7).

在小鼠胚胎发生过程中，β细胞由一群胰腺祖细胞生成(8,9). 从祖细胞分化而来的β细胞是有丝分裂后的，直接谱系追踪分析表明，在胚胎发生过程中，祖细胞群持续存在，以允许新的β细胞分化(10,11). 然而，在出生后的发育过程中，分化的β细胞的复制会导致新β细胞的增加(12). 新生儿期β细胞复制率高导致β细胞质量大量增加(13,14). 终末分化的β细胞如何在新生儿期从静止状态过渡到复制状态？在这里，我们研究了D-环素在产后发育中调节β细胞的细胞周期进程中的作用。三种D-细胞周期蛋白（细胞周期蛋白D1、D2和D3）是由不同基因编码的细胞周期机制的关键组成部分，但在蛋白质水平上表现出显著的同源性(15). D-细胞周期蛋白的水平由有丝分裂原控制，在诱导后，与伙伴细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和CDK6结合，使细胞进入S期(16,17). 这里我们报告一个D-cyclin，细胞周期蛋白D2是β细胞复制和出生后发育过程中β细胞质量适当扩张所必需的。我们认为，细胞周期蛋白D2在β细胞内介导有丝分裂刺激以调节胰腺中的β细胞质量方面起着关键作用。

结果

为了确定哪些D-细胞周期蛋白在发育中的胰腺中表达，我们对从发育中的胚胎胰腺和新生儿胰腺中分离的RNA进行了RT-PCR。RT-PCR分析显示高水平的细胞周期蛋白D2表达和低水平细胞周期蛋白D3在发育中的胰腺中（图​（图1A）。1A） ●●●●。胚胎胰腺中D-cyclin的免疫组织化学分析表明，cyclin D2的表达仅限于胰腺上皮细胞的细胞核，而在分化的内分泌细胞中没有表达（图​（图1B）。1B） ●●●●。与RT-PCR分析一致，在胚胎发育期间胰腺中观察到低水平的细胞周期蛋白D3表达（数据未显示）。对出生后胰腺的分析证实了cyclin D1完全不表达（图​（图1C）1C） 但显示其余的D-cyclins以动态方式表达，通常以相互排斥的细胞类型表达。细胞周期蛋白D3的表达仅限于外分泌细胞和导管细胞，而在内分泌细胞中不存在（图​（图1D）。1D） ●●●●。另一方面，细胞周期蛋白D2在内分泌胰腺以及外分泌和导管组织中表达（图​（图1，1、E和F）。细胞周期蛋白D2与胰岛素的协同作用表明，细胞周期蛋白D1在胰岛内的β细胞亚群的细胞核中表达（图​（图1，1、E和F）。细胞周期蛋白D2的表达最常见于较大的胰岛，很少在内分泌激素染色阳性的小簇内分泌细胞或导管细胞中观察到（图​（图1F）。1F） ●●●●。表达细胞周期蛋白D2的β细胞比例在出生后第一周内增加，随后下降。因此，在第二周结束时，细胞周期蛋白D2阳性的β细胞相对较少（图​（图1G）。1G） ●●●●。细胞周期蛋白D2在外分泌和导管组织中也减少，到出生后第14天（P14），这些组织不再表达细胞周期蛋白D1（图​（图1H），1H） ，但继续表达细胞周期蛋白D3（数据未显示）。

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图1

胰腺发育过程中细胞周期蛋白D2的表达。我们对从胚胎胰腺中分离的RNA进行了RT-PCR，并用anti_glucagon（绿色）、anti_insulin（绿色）和anti_D-环素（红色；如图所示）Ab对不同年龄的胰腺切片进行了染色。(A类)RT-PCR检测发育中胰腺中细胞周期蛋白D1、D2和D3的表达。从E12.5胰腺中分离到RNA。(B类)胚胎早期发育过程中祖细胞中细胞周期蛋白D2（cyc D2）的表达。在E11.5，上皮祖细胞而非分化细胞表达细胞周期蛋白D2。胰腺背芽的轮廓。在此阶段，细胞周期蛋白D2的表达仅限于上皮细胞，而在间质中未观察到。(C类)在P4时，胰腺中未观察到细胞周期蛋白D1（cyc D1）的表达。(D类)细胞周期蛋白D3（cyc D3）在外分泌和导管（箭头）组织中表达，但不包括内分泌胰腺。(E类)细胞周期蛋白D2在胰腺P4处表达。与胰岛素抗体结合显示细胞周期蛋白D2在胰岛中表达。在此阶段，34.5%±2.0%的胰岛细胞表达细胞周期蛋白D2。(F类)胰岛的高倍放大E类显示cyclin D2表达局限于β细胞的细胞核（箭头所示）。(G公司)Cyclin D2继续在P7的内分泌胰腺（胰岛细胞的33.2%±4%）和导管组织中表达（箭头所示）。(H（H）)到P14时，内分泌胰腺中很少有细胞表达细胞周期蛋白D2（胰岛细胞的11.3%±1.4%）。在此阶段，外分泌组织和导管组织未显示细胞周期蛋白D2的任何表达。

要解决以下问题：细胞周期蛋白D2是内分泌胰腺发育所必需的，我们分析了小鼠，其中细胞周期蛋白D2该基因在ES细胞中被同源重组灭活。由于细胞周期蛋白D2在胚胎发育期间在胰腺祖细胞中表达，我们研究了细胞周期蛋白D1是否在协调祖细胞增殖和内分泌细胞分化中发挥作用。组织学和免疫荧光分析显示，妊娠晚期（胚胎期[E]17.5）胰腺中的胰岛结构、组成或内分泌物质没有显著差异细胞周期蛋白D2^–/–胚胎与WT同窝婴儿的比较（数据未显示）。因此，细胞周期蛋白D2似乎对胚胎发育期间内分泌胰腺的形成是不可或缺的。

确定是否细胞周期蛋白D2我们在出生后8周检测了小鼠胰岛的形态。H&E染色显示胰岛的大小从细胞周期蛋白D2^–/–小鼠与其窝友的比较（图​（图2，2、A和B）。胰腺组织中胰岛素和胰高血糖素表达的免疫组织学分析表明，较小的胰岛表达这些激素（图​（图2，2、C和D）。在来自细胞周期蛋白D2的胰腺中，未发现使用胰岛激素Ab’s混合物的异常胰岛外染色^–/–小鼠（数据未显示）。在6周龄小鼠中，WT小鼠的平均胰岛直径为202±13μm，而cyclin D2为76.5±4μm^–/–老鼠(P（P）< 0.0001). 细胞周期蛋白D2中的胰岛^–/–小鼠保留了内分泌细胞的特征性分布，β细胞形成核心，α细胞形成外套。无明显坏死或纤维化细胞周期蛋白D2^–/–胰腺以及这些胰腺的大小和重量与WT的同窝伙伴相似。单个β细胞的大小在细胞周期蛋白D2^–/–和WT的同卵双胞胎，表明胰岛大小的减小可能是由于β细胞数量的减少。由于内分泌细胞的数量取决于内分泌细胞新生、复制和凋亡的平衡，我们考虑了这些机制中是否有任何一种受到缺乏细胞周期蛋白D2.

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图2

WT和WT中胰岛形态和内分泌细胞的新生细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。我们对6周龄WT和细胞周期蛋白D2^–/–（_/_）与抗胰高血糖素和抗胰岛素抗体的同窝伴侣。我们通过测量十个随机选择的至少有十个细胞宽的胰岛的最长轴来估计胰岛的大小。(A类和B类)WT的H&E染色胰腺(A类)和细胞周期蛋白D2^–/–(B类)老鼠。有密集核的胰岛用箭头表示。(C类)WT小鼠具有胰岛外围α细胞和核心β细胞的特征性结构。(D类)细胞周期蛋白D2^–/–小鼠显示出明显更小的胰岛，尽管胰岛外围的α细胞和核心的β细胞的形态得以保留。WT小鼠的平均胰岛直径为202±13μm，而WT小鼠为76.5±4μm细胞周期蛋白D2^–/–老鼠(P（P）< 0.0001). (E类和F类)P7 WT和细胞周期蛋白D2^–/–用抗胰岛素和抗胰高血糖素抗体染色的同窝鼠。DAPI核染色可根据导管细胞的特征形态轻松识别导管细胞。WT中胰岛素阳性导管细胞(E类)和中细胞周期蛋白D2^–/–(F类)图中显示了室友（箭头）。乳腺癌中激素阳性导管细胞的频率细胞周期蛋白D2^–/–小鼠与WT同窝小鼠相似。

许多观察结果，包括荷尔蒙阳性导管细胞的普遍存在以及胰岛与导管的密切关系，导致了内分泌细胞分化发生在导管中的想法(12). 在WT新生儿中，很少在出生后立即观察到导管细胞的激素阳性染色，但在出生后第一周结束时观察到的更频繁（图​（图2E）。2E） ●●●●。在细胞周期蛋白D2^–/–P7小鼠，激素阳性的导管细胞清晰可见，频率大致与WT同窝鼠相似（图​（图2F）。2F） ●●●●。此外，具有免疫反应性胰岛素的胰岛外细胞在WT和细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。这些结果表明，激素阳性导管细胞的频率不受细胞周期蛋白D2我们也没有观察到WT和细胞周期蛋白D2^–/–小鼠（数据未显示）。

我们通过评估β细胞结合BrdU的能力，检查了出生后β细胞的复制状态。BrdU是一种胸腺嘧啶类似物，在周期的S期并入循环细胞的细胞核。在出生后的第一周内，WT新生儿的胰腺显示胰岛内有大量细胞被BrdU染色。与胰岛素协同作用证实，很大一部分β细胞在出生后早期进行了复制（图​（图3A）。三A） ●●●●。令人惊讶的是，在来自细胞周期蛋白D2^–/–同窝的人（图​（图3B）。三B） ●●●●。野生型与细胞周期蛋白D2复制指数的比较^–/–P4新生儿的细胞周期蛋白D2β细胞复制出现明显缺陷^–/–小鼠（9.2%对0%，P（P）< 0.001). 测试是否细胞周期蛋白D2在其他内分泌细胞的复制中起作用，我们在这些胰腺中检测了胰高血糖素染色细胞是否也含有BrdU。在WT新生儿的胰腺中，一些胰高血糖素阳性细胞显示BrdU掺入，这表明除了β细胞外，α细胞在出生后早期发育过程中也会复制和扩张（图​（图3C）。三C） ●●●●。同样，在胰腺α细胞中未观察到BrdU的掺入细胞周期蛋白D2^–/–室友（图​（图3D）。三D） ●●●●。细胞周期蛋白D2的复制缺陷^–/–小鼠局限于内分泌胰腺，因为很容易看到包含BrdU的外分泌细胞和导管细胞。进一步表征细胞周期蛋白D2在胰腺中的复制^–/–我们通过淀粉酶染色鉴定了BrdU在小鼠外分泌组织中的掺入。BrdU在外分泌组织中的掺入在细胞周期蛋白D2^–/–胰腺与WT窝友的比较（图​（图3，三、E和F）。

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图3

出生后WT胰腺发育过程中BrdU的掺入细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。4日龄和7日龄小鼠在处死前2小时注射BrdU。(A类和B类)胰腺切片中含有抗胰岛素和抗黑素瘤抗体。(A类)在P4 WT小鼠中，在出生后发育的第一周，含有BrdU的一部分β细胞很明显。对20个具有代表性的胰岛进行定量分析表明，在P4 WT小鼠中，9.2%的β细胞含有BrdU。箭头显示了一个含有BrdU阳性β细胞的胰岛示例。(B类)在细胞周期蛋白D2^–/–没有观察到同窝的β细胞掺入BrdU。箭头表示小岛细胞周期蛋白D2^–/–不含BrdU-阳性β细胞。(C类和D类)含有抗胰高血糖素和抗黑素瘤抗体的胰腺切片。(C类)胰高血糖素阳性细胞在WT胰腺中合并BrdU。箭头所示为胰岛中含有BrdU阳性α细胞的示例。(D类)未观察到含有BrdU的胰高血糖素阳性细胞。(E类和F类)胰腺切片中含有抗淀粉酶和抗黑素酶抗体。WT胰腺外分泌组织和导管组织中BrdU掺入相似(E类)和细胞周期蛋白D2^–/–老鼠(F类).

接下来，我们研究了在缺乏细胞周期蛋白D2是由于内分泌细胞无法上调剩余的D-cyclin。我们比较了细胞周期蛋白D1和D3在新生儿WT和细胞周期蛋白D2^–/–室友。如前所示，在WT P4小鼠中，细胞周期蛋白D3在外分泌和导管组织中表达，但在内分泌组织中不表达（图​（图4A）。4A） ●●●●。在细胞周期蛋白D2中^–/–同窝小鼠外泌物和导管组织中cyclin D3的表达与WT小鼠相似。值得注意的是，与胰岛素协同作用表明，细胞周期蛋白D3在来自细胞周期蛋白D2^–/–鼠标（图​（图4B）。4B） ●●●●。我们也未能从P4 cyclin D2中观察到胰腺β细胞中cyclin D1的表达^–/–鼠标（图​（图4C）。4C） ●●●●。接下来我们检测了细胞周期蛋白D1和D3在细胞周期蛋白D2^–/–处于出生后内分泌胰腺重塑阶段末期的小鼠。P14 WT小鼠的胰腺切片没有细胞周期蛋白D1染色（图​（图4D）。4D） ●●●●。在细胞周期蛋白D2^–/–然而，同窝婴儿的内分泌胰腺中可以清楚地检测到细胞周期蛋白D1的表达。与胰高血糖素结合后，发现胰腺中的细胞周期蛋白D1表达细胞来自细胞周期蛋白D2^–/–小鼠被限制在胰岛核心（图​（图4E），4E） ，胰岛素染色显示细胞周期蛋白D1在β细胞的细胞核中表达（图​（图4F）。4F） ●●●●。在P14 WT和细胞周期蛋白D2^–/–小鼠，但内分泌细胞中没有（数据未显示）。

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图4

细胞周期蛋白D1和D3在WT和WT中的表达细胞周期蛋白D2^–/–小鼠出生后发育期间。(A类和B类)4日龄婴儿胰腺切片细胞周期蛋白D2^–/–用抗环素D3和抗胰岛素抗体对小鼠进行染色。(A类)在P4 WT小鼠中，细胞周期蛋白D3在外分泌和导管组织中表达，但在内分泌胰腺中未观察到。箭头表示胰岛缺乏cyclin D3表达。(B类)在细胞周期蛋白D2^–/–同窝卵，细胞周期蛋白D3在外分泌和导管组织（箭头）中表达，但在β细胞中未观察到。(C类)4日龄婴儿胰腺切片细胞周期蛋白D2^–/–用抗环素D1和抗胰岛素抗体对小鼠进行染色。细胞周期蛋白D1在细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。(D类_F类)14天大WT和细胞周期蛋白D2^–/–小鼠被抗环素D1、抗胰高血糖素染色(D类和E类)和抗胰岛素(F类)抗体。(D类)WT P14小鼠胰腺中不表达细胞周期蛋白D1。(E类)在胰岛中观察到细胞周期蛋白D1的表达细胞周期蛋白D2^–/–室友。箭头表示P14胰岛中cyclin D1的表达细胞周期蛋白D2^–/–胰腺。(F类)细胞周期蛋白D1在胰岛素阳性细胞的细胞核中表达。箭头表示P14β细胞中cyclin D1的表达细胞周期蛋白D2^–/–胰腺。

由于β细胞复制是调节β细胞质量的一个重要参数，我们量化了出生后2周内的总β细胞质量。在P4细胞周期蛋白D2^–/–小鼠与同窝的WT小鼠相似（WT，0.39±0.02 mg，vs细胞周期蛋白D2^–/–0.36±0.01毫克）。β细胞质量随后在出生后的发育过程中迅速增加，P14 WT小鼠的β细胞质量明显增加了4倍（图​（图5A）。5A） ●●●●。相比之下，细胞周期蛋白D2中的β细胞质量没有明显增加^–/–室友。因此，通过P14细胞周期蛋白D2^–/–小白鼠大约是其WT同窝小白鼠的30%(细胞周期蛋白D2^–/–0.5±0.05 mg，而WT为1.5±0.16 mg；P（P）< 0.05). 这种重量增加的减少是内分泌胰腺特有的，因为单个胰腺的总重量细胞周期蛋白D2^–/–在出生后的整个发育过程中，小鼠与WT同窝小鼠没有显著差异。这与外分泌组织的观察结果一致，外分泌组织占胰腺的98%，在缺乏细胞周期蛋白D2此外细胞周期蛋白D2^–/–在体重或大小方面，小鼠与WT同窝小鼠没有差异（图​（图5B）。5B） ●●●●。因此，与WT小鼠不同细胞周期蛋白D2^–/–β细胞质量的增加与小鼠不匹配（图​（图55C） ●●●●。

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图5

WT中的β细胞质量和细胞周期蛋白D2^–/–小鼠出生后发育期间。(A类)每个胰腺的β细胞质量估计为β细胞的相对横截面积（通过β细胞所占横截面积除以总组织横截面积的量化确定）与胰腺重量的乘积。如图所示，在出生后测量β细胞质量。数据是每个基因型四只小鼠的平均值±SEM。在WT小鼠中，β细胞质量测量显示P14增加了4倍。相反，细胞周期蛋白D2^–/–同一时期，同一窝鼠的β细胞质量没有明显增加。(B类)测量细胞周期蛋白D2胎仔的体重，以对应出生后的β细胞质量测量值。这个细胞周期蛋白D2^–/–老鼠的体重与同窝的老鼠没有区别。(C类)相对β细胞质量是以β细胞质量与体重的比值计算的。数据是每个基因型10只小鼠的平均值±SEM。

检测细胞周期蛋白D2的相对β细胞质量是否降低^–/–小鼠导致血清胰岛素水平改变和葡萄糖稳态异常，我们测量了血清胰岛素水平，并在WT和细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。隔夜禁食后，WT和细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。然而，在葡萄糖激发后，WT小鼠的血清胰岛素水平增加了一倍，但仅在细胞周期蛋白D2^–/–鼠标（图​（图6A）。6A） ●●●●。这个细胞周期蛋白D2^–/–与WT小鼠相比，小鼠的空腹血糖水平持续升高。这个细胞周期蛋白D2^–/–腹腔注射葡萄糖后，小鼠清除血液中葡萄糖的能力也下降。注射后15分钟，WT小鼠的峰值水平在140和160 mg/dl之间，到90分钟测试期结束时达到基线水平（图​（图6B）。6B） ●●●●。相反，细胞周期蛋白D2^–/–注射后15分钟内，小鼠血糖水平升高（300-350 mg/dl）。此外，在测试期间，血糖水平未能恢复到基线水平，注射后120分钟血糖水平保持在150–250 mg/dl的范围内（数据未显示）。

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图6

细胞周期蛋白D2突变小鼠的血浆胰岛素水平降低，糖耐量受损。(A类)WT和细胞周期蛋白D2^–/–小鼠隔夜禁食，葡萄糖激发30分钟后（2 g/kg体重）。结果表示为四个WT和cyclin D2的平均值±SEM^–/–老鼠。(B类)12周龄WT和cyclin D2在禁食16小时（时间0）和注射葡萄糖（2 g/kg体重）后测量血糖水平^–/–老鼠。结果表示为三个WT和cyclin D2的平均值±SEM^–/–老鼠。

讨论

最近的研究表明，成年期新的β细胞来源于原有β细胞的复制(18). 调节β细胞复制的机制尚不清楚。啮齿类动物出生后至断奶期间的特征是β细胞质量大量增加。我们表明，这种增加主要是由于终末分化β细胞的复制，并已开始解决细胞周期调节器在β细胞复制中的作用。在这里我们发现一种特异性的D-细胞周期蛋白，细胞周期蛋白D2在出生后调节终末分化β细胞的复制中起重要作用。在细胞周期蛋白D2^–/–小鼠，内分泌细胞复制的缺失导致β细胞质量减少3倍。几行证据表明细胞周期蛋白D2是内分泌细胞特有的。首先，在产后期间细胞周期蛋白D2^–/–小白鼠和它们的WT室友没有区别。其次，胰腺的重量细胞周期蛋白D2^–/–小鼠与WT同窝小鼠没有区别。第三，外分泌细胞和导管细胞的复制在细胞周期蛋白D2^–/–老鼠。因此，细胞周期蛋白D2的缺失导致了出生后发育期间内分泌胰腺形成的狭义和高度选择性后果。

内分泌胰腺中的选择性复制缺陷令人惊讶，因为小鼠的遗传分析表明，在绝大多数细胞类型中，上调剩余的D-cyclin可以补偿任何特定D-cyclin-的丢失(19). 未能检测到其他D-cyclin在β细胞中的表达细胞周期蛋白D2^–/–小鼠认为，缺乏β细胞复制可归因于这些β细胞无法上调剩余的D-cyclins。未能上调β细胞中其他D-cyclin的表达细胞周期蛋白D2^–/–然而，小鼠仅限于出生后早期，因为出生后2周，在胰岛细胞核中很容易观察到cyclin D1的表达。细胞周期蛋白D1的上调与内分泌胰腺从出生后2周内β细胞的高复制率和β细胞团的扩张率过渡到稳定的β细胞团水平相一致。我们的结果还表明，在出生后早期发育中，β细胞无法上调其他D-cyclin的表达，这表明调节β细胞高复制率的有丝分裂信号对cyclin D2有特异性影响。内分泌胰岛细胞中细胞周期机制信号通路的这种刚性连接可能通过提供调节β细胞质量的方法，为糖尿病的选择性治疗干预提供了机会。

D型细胞周期蛋白作为有丝分裂刺激的传感器，与伙伴细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6结合，驱动视网膜母细胞瘤基因产物、pRb和pRb相关蛋白的磷酸化和随后的失活(16,17,20). CDK4-null小鼠也表现出β细胞增殖缺陷，表明CDK4在控制β细胞周期进展中是细胞周期蛋白D2的必要伴侣(21). 然而，CDK4-null小鼠比WT小鼠小40%，这意味着CDK4发挥着更广泛的作用，并且是建立动物体内稳态细胞数量所必需的(22). 这表明调节β细胞复制的有丝分裂信号可能通过细胞周期蛋白D2介导。因此，细胞周期蛋白D2可能通过作为有丝分裂原信号传导的传感器并与细胞周期机制联系，在β细胞中发挥关键作用。

鉴定有丝分裂途径中调节内分泌细胞复制的关键成分的一个兴趣是将其用于β细胞的体外繁殖或设计增加体内β细胞质量的方法。然而，迫使内分泌细胞重新进入细胞周期会引发程序性细胞死亡。例如，c-myc在β细胞中的过度表达导致最初增殖增加，随后凋亡，随后β细胞质量减少(23). 这表明一种内在机制可以保护内分泌细胞免受有丝分裂刺激的不当激活。因此，有必要了解在出生后早期发育过程中，内分泌细胞的复制如何调节，而不会伴随细胞死亡。更好地了解β细胞的细胞周期进程是如何调节的，这可能会为糖尿病的治疗带来新的策略。

方法

致谢

脚注

工具书类