核受体在调节各种细胞代谢途径中的重要作用日益明显。近年来，各种对经典内分泌配体无反应的核受体，包括过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）、肝X受体、法尼样X受体和维甲酸X受体，已被证明被低亲和力饮食衍生配体激活(6，11，26，44)。代谢配体（如脂肪酸、氧甾醇和胆汁酸）对这些受体的激活引发了这些配体合成和分解代谢途径的下游转录调控。其余受体被指定为孤儿受体，因为尚未确定内源性配体，它们构成了核受体的最大亚类。孤儿受体很可能在调节中间代谢方面发挥额外作用。将孤儿受体与靶基因联系起来是核受体生物学领域的一个重要目标。靶基因分析还将为确定哪些代谢物作为这些受体的内源性配体提供见解，进而为开发旨在调节细胞代谢的药物干预措施提供见解。
雌激素相关受体（ERR）家族是最近被确定为细胞代谢候选调节因子的一组孤儿受体。ERR家族有三个成员，ERRα、ERRβ和ERRγ(13，16，18)。早期对哺乳动物组织中ERR亚型的组织和发育表达模式的描述表明，它们参与细胞能量代谢的调节。例如，在成年人中，ERRα和ERRγ在主要依赖线粒体氧化代谢产生能量的组织中表达丰富，如心脏、棕色脂肪和缓慢转换的骨骼肌(16，43，47)。在胚胎发育过程中，这两种亚型都在心脏和骨骼肌中表达，表明它们在发育过程中发挥功能作用，并维持分化肌肉的功能。我们发现，出生后心脏ERRα表达显著增加，这与出生后转变为脂肪酸作为能量底物以及参与细胞脂肪酸摄取和线粒体氧化的酶的整体上调相一致(19)。此外，ERRα结合编码介质-酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）基因的5′调控区，MCAD催化线粒体β-氧化途径的第一步，因此与脂肪酸氧化途径的直接调控有关(43，47).
早期尝试未能证明ERRα介导的MCAD公司不同细胞培养模型中的基因转录，表明细胞缺乏ERRα信号的关键功能成分。最近，我们和其他人发现PPARγ辅激活子1（PGC-1）家族的转录辅激活子是ERRα和ERRγ的有效辅激活子(17，19，21，42)。PGC-1亚型有三种，即PGC-1α、PGC-1β和PRC。PGC-1是一系列细胞能量代谢途径的关键调节器，但其在靶组织中的主要作用是促进线粒体氧化代谢(24，37)。PGC-1α通过一些核受体和非核受体转录因子伙伴的协同激活增加细胞线粒体数量、脂肪酸氧化和呼吸(29，38，49)。PGC-1β也被认为可以激活组织中的氧化代谢，尽管与PGC-1α相比，它是通过一组相对有限的转录伙伴来实现的(31，45).
共享的PGC-1α和PGC-1β伙伴包括ERRα和ERRγ、核呼吸因子1（NRF-1）、肝细胞核因子4、雌激素受体α和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）(17，19，21，30，42，46，49)。因此，ERR亚型可能对ERRα、ERRγ和PGC-1辅活化因子共存的组织（如心脏和骨骼肌）中的ERR靶基因进行PGC-1介导的调控。事实上，我们证明ERRα/PGC-1α复合物直接激活了MCAD公司通过早期研究中确定的ERRα结合位点的基因启动子以及ERRα过度表达激活NIH 3T3细胞内源性MCAD基因表达(19)。总的来说，迄今为止公布的结果表明，ERRs是PGC-1下游调节电路的一个组成部分，并激发了人们对ERRα和相关亚型代谢作用的定义的兴趣。然而，ERR亚型调控的特定靶基因和相关代谢途径尚未明确。
为了确定ERRα的潜在靶基因，对ERRα过度表达的大鼠新生心肌细胞进行了转录谱研究。在ERRα阴性小鼠的细胞培养和心脏和骨骼肌体内进行验证研究。这些研究揭示了ERRα的几个关键调控功能。首先，我们发现ERRα激活了参与多种关键能量生成途径的基因，包括细胞脂肪酸摄取、脂肪酸氧化和线粒体电子传递/氧化磷酸化。其次，ERRα介导的脂肪酸利用基因调控至少部分通过直接激活帕帕α基因转录，一种由PGC-1α共同激活的机制。总之，这些结果确定ERRα是心脏和骨骼肌能量代谢的关键调节因子。
材料和方法
质粒构建物。
人类的野生型和变异型PPAR（购电协议）α启动子报告质粒已被描述(35，36)。表达人类ERRα和小鼠PGC-1α、pcDNA3.1-ERRα和pcDNA3.1-myc/his的哺乳动物表达载体。还描述了PGC-1α(19，46)。pSG5-HA-ERRγ表达载体是M.Stallcup（南加州大学）赠送的礼物。
哺乳动物细胞培养和瞬时转染。
CV1细胞保持在37°C和5%CO2Dulbecco改良的Eagle培养基中10%的胎牛血清。通过磷酸钙共沉淀法进行瞬时转染(9)。将报告质粒（4μg/ml）与RSV-βGal（0.5μg/ml）共转染，表达Rous肉瘤病毒启动子驱动的β-半乳糖苷酶基因，以控制转染效率。在共转染实验中，使用表达ERR亚型、PGC-1α的哺乳动物表达载体或相应的空载体。在转染后48小时收集细胞并进行分析，如前所述测量荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性(5).
如前所述，从1日龄Harlan-Sprague-Dawley大鼠制备心室心肌细胞(9)。24小时后，细胞感染由巨细胞病毒启动子驱动的表达绿色荧光蛋白（GFP）、ERRα、PGC-1α或PPARα的腺病毒。实验构建物也表达来自独立启动子的GFP。通过荧光显微镜定量表达GFP的细胞，在18小时内感染率达到90-95%。分别从感染后48和72小时的细胞中制备RNA和全细胞蛋白提取物。已描述表达GFP、人ERRα和小鼠PGC-1α或小鼠PPARα的腺病毒的构建和繁殖(2，15，19，20，28).
用野生型ERRα尾组织制备小鼠原代成纤维细胞−/−（ERR淘汰赛），或ERRα−/−PPARα−/−（双基因敲除）小鼠。在完全培养基中分离和培养成纤维细胞（Dulbecco改良Eagle's培养基，20%胎牛血清，2 mM我-谷氨酰胺、1 mM非必需氨基酸和100μg/ml青霉素/链霉素）。简而言之，将尾夹（1 cm）浸泡在每毫升500μg/ml青霉素/链霉素的完整培养基中10分钟，冲洗干净，并在不含青霉素/链霉素的培养基中切碎。将组织块在37°C的完全培养基中加上500 U胶原酶消化过夜。用5ml移液管研磨细胞，离心收集细胞，并在完整培养基中的T25烧瓶中培养。48小时后，对细胞进行继代培养和扩增，以确定适当的病毒滴定，并在第二代或第三代进行过表达实验。
DNA微阵列。
使用RNAzol（Tel-Test Inc.）从大鼠新生心肌细胞中分离出总RNA，然后使用RNeasy试剂盒（Qiagen Inc.）进行清理。双链cDNA由12μg总RNA合成，该总RNA首先用Superscript II（Invitrogen Corp.）用T7启动子聚（a）引物（T7T24）逆转录，然后根据制造商的方案进行第二链合成。按照制造商的协议，使用T7-coupled ENZO BioArray High-Yield RNA转录标记试剂盒（ENZO Diagnostics Inc.）合成生物素标记的cRNA。
华盛顿大学医学院Alvin Siteman癌症中心的多重基因分析核心对Affymetrix大鼠U34A芯片进行了杂交。Affymetrix MAS 5.0软件用于初始数据分析和背景归一化。随后的数据操作在Excel中执行。在GFP和ERRα过表达条件下，Affymetrix软件称之为缺失的探针集被排除在随后的数据分析之外。信号强度归一化为所有探针组的平均强度。信号强度比计算为ERRα表达与GFP表达细胞的比值，以检测ERRα过度表达引起的变化。进行了三项独立试验。在至少两个试验中，信号强度比增加≥2倍（诱导）或减少≤0.5倍（抑制）被认为在ERRα表达细胞中可能受到调节。
Northern和免疫印迹分析。
如前所述进行总细胞RNA分离和印迹(5)。将印迹与来自MCAD、ERRγ、PPARα和PGC-1αcDNA小鼠克隆的放射性标记探针杂交。此外，还使用了人类ERRα、大鼠M-CPT I和通用肌动蛋白探针。蛋白质提取物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（7.5%）分解并转移到硝化纤维素膜上。使用前面描述的抗MCAD和抗酰基辅酶A氧化酶抗体对MCAD和酰基辅酶A氧化酶进行免疫检测(7，22)。脂肪酰辅酶A合成酶1抗体由J.E.Schaffer（华盛顿大学医学院）慷慨提供。
实时定量逆转录PCR。
如前所述进行实时PCR(40)。从8周龄野生型或ERRα比目鱼肌中分离的总RNA−/−用Taqman逆转录试剂（Applied Biosystems）和寡核苷酸（dT）和随机六聚体（1:1比例）对小鼠进行逆转录。用Taqman核心试剂和Prism 7700序列检测器（Applied Biosystems）以96-well格式进行三次反应。描述了PGC-1α引物探针组(三)。以下小鼠特异性引物探针组用于检测特异性基因表达：MCAD正向，5′-GGAAATGACAAAAAAAGATATT-3′；MCAD反面，5′-ATGGCGCCACATCAGA-3′；MCAD探针，5′-TGTCACACAGAGACACATCATTG-3′；M-CPT I正向，5′-TCTAGGCAATGCCGTTCAC-3′；M-CPT I反面，5′-GAGCACATGGGCACACATAC-3′；M-CPT I探针，5′-TCAAGCCGGTCATGGCACATGG-3′；CD36正向，5′-CGGACATTGAGATTCTCC-3′；CD36反面，5′-TCCTTAAGGTCGATTCCAGATC-3′；CD36探针，5′-ACAGCGTAGATAGACCTGCAAATG-3′；ERRγ正向，5′-TGACTTGGCTGACCGAG-3′；ERRγ反转，5′-CCGAGGATCAGAATCC-3′；ERRγ探针，5′-CATATCCCAGTCTCCACACTG-3′；PPARα正向，5′-ACTACGGAGTCACGCATG-3′；PPARα反向，5′-TTGTCGACCTTCAGC-3′；PPARα探针，5′-AGGCTGTAAGGGCTTTCTCGGCG-3；PPARβ正向，5′-TCACCGGCAAGTCCAGCCA-3′；PPARβ逆转，5′-ACACCAGCCCTTCTCTGCCT-3′；和PPARβ探针，5′-AACGCCCTTTGTCATCCACGA-3′。rRNA（VIC）探针组作为内部校正对照被包括在所有反应中，并且校正的数据被标准化为β-肌动蛋白表达（Applied Biosystems）。
电泳迁移率变化分析和染色质免疫沉淀。
对应于HNF-4应答元件（5′GATCCTGGGGGGGCAAAGTTCACATAGGTA-3′）或HNF-4REmut（5′GATCCTGGGGGTG）的双链互补寡核苷酸加利福尼亚州人类GCAAAGTTCACCATAGTA-3′）PPAR（购电协议）利用α启动子生成探针，体外检测ERR亚型结合。探测器32由Klenow填充反应标记的P。用TNT Quick T7偶联翻译试剂盒（Promega）合成了人ERRα和小鼠ERRγ的重组蛋白。在以下反应中验证了适当大小的蛋白质的合成[35S] 随后进行蛋氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和放射自显影检测。电泳迁移率变化分析反应如前所述进行(9).
染色质免疫沉淀分析是按照先前公布的方法进行的，在这些方法中可以找到方案中使用的特定缓冲液配方(4，48)。总之，L6大鼠成肌细胞（1×107至2×107)感染腺病毒构建物Ad-ERRα。在感染后48小时，用1%甲醛孵育细胞（10分钟），然后添加0.125 M甘氨酸，以停止交联，从而进行交联。细胞在低温磷酸盐缓冲盐水中清洗和收集，并通过离心法造粒，然后通过Donce均质化进行裂解和破碎。将细胞核造粒并重新悬浮在1%十二烷基硫酸钠核裂解缓冲液中。用Branson 250声波发生器对染色质进行四个30秒的声波周期剪切。通过琼脂糖凝胶电泳分析等分样品，以验证400-1000-bp亚群的富集。剪切的染色质用牛血清白蛋白嵌段潘索宾（Calbiochem）进行预处理，然后在免疫沉淀稀释缓冲液中稀释小份，并用免疫球蛋白G或抗ERRα的多克隆抗体在4℃孵育过夜(43).
抗体-色素复合物与Pansorbin结合并通过离心造粒。保留一份免疫球蛋白G样品作为“输入”对照。粒剂在透析缓冲液中洗涤两次，然后在500 mM氯化锂免疫沉淀缓冲液中进行四次洗涤。免疫沉淀复合物用洗脱缓冲液通过两次15分钟的培养进行洗脱。通过在65℃下培养样品来逆转交叉链οC处理5小时，在此期间，样品也接受RNase A处理。样品为苯酚和CHCl三提取、沉淀过夜，然后处理蛋白酶K。最终酚-CHCl三进行纯化和沉淀以获得PCR模板（标准温度条件下30个循环）。引物设计用于扩增与大鼠区域对应的310-bp扩增子PPAR（购电协议）HNF-4应答元件侧翼的α启动子（核苷酸−1304至−1613）。引物扩增250 bp的TFIID公司基因用于控制免疫沉淀中基因组DNA的非特异性富集。在1.3%琼脂糖凝胶上分析PCR-扩增带，并通过密度计量化相对带强度。
动物研究。
所有动物方案都得到了华盛顿大学医学院动物研究委员会的批准。ERRα−/−最近有人描述过老鼠(32)。ERRα的原始背景应变−/−小鼠为杂交株（C57BL/6/SvJ129）。对于基线比较，同窝野生型和ERRα−/−小鼠由杂合育种家产生，以控制菌株背景。从喂食的野生型和ERRα中分离出心脏和骨骼肌（腓肠肌和比目鱼肌）−/−白天（1000到1200小时）。ERRα−/−用PPARα的C57BL/6菌株回交到C57BL/6−/−老鼠(三，27)产生双杂合小鼠，然后交叉产生ERRα−/−PPARα−/−用于分离原代成纤维细胞的（双敲除）小鼠系。
棕榈酸酯氧化分析。
用[9,10测量棕榈酸酯的氧化速率-三H] 如上所述的棕榈酸(10)。电池（≈5×10三)在24孔培养板中培养，24小时后感染表达GFP（Ad-GFP）、Ad-ERRα、Ad-PGC-1α或Ad-PPARα的腺病毒。感染后84小时，进行棕榈酸酯氧化试验。为了证明脂肪酸氧化测定的特异性，在一半的标记反应中加入50μM依托莫西钠（CPT I抑制剂）。在37°C下进行2小时的培养。将数据归一化为背景值和通过双钦酸法定量的总细胞蛋白。速率计算为纳米[三H] 每小时每毫克蛋白质氧化的棕榈酸酯。
中性脂质检测。
在添加与牛血清白蛋白结合的35μM油酸之前，用Ad-GFP或Ad-ERRα感染大鼠新生心肌细胞24 h。油红O染色由华盛顿大学医学院消化疾病组织学核心进行，如前所述(1).
结果
ERRα诱导细胞脂肪酸摄取、氧化和线粒体呼吸相关基因的表达。
为了表征ERRα对细胞代谢的调节作用，在三个独立试验中，ERRα在原代大鼠新生心肌细胞中过度表达，并使用Affymetrix大鼠U34A阵列分析基因表达变化。在三个独立试验中，至少有两个试验中，ERRα调节基因的指定标准是表达ERRα的心肌细胞中的一个当前调用，信号强度是表达GFP的心肌细胞的两倍或更高。总的来说，ERRα诱导了90个不同的基因，其中大量编码参与细胞能量代谢途径的酶（表)。作者提供了ERRα上调基因的完整列表（未发表数据）。
值得注意的是，我们发现了许多与脂肪酸的细胞摄取和线粒体氧化有关的基因。此外，参与线粒体呼吸功能的几个基因也被激活。这些结果很有趣，因为线粒体脂肪酸氧化是成人心脏的主要能量来源。具体而言，大鼠心肌细胞中编码脂蛋白脂肪酶、脂肪酸转运体、CD36/脂肪酸转运体和心脏特异性脂肪酸结合蛋白FABP3的基因上调。此外，在ERRα过度表达的情况下，诱导了脂肪酰辅酶A合成酶，该合成酶通过偶联转运促进脂肪酸在质膜上的酯化吸收。
如前所示，ERRα增加了编码MCAD的基因，MCAD是脂肪酸氧化循环中的关键酶。编码线粒体（超长链酰基辅酶A脱氢酶、长链羟酰基辅酶A脱氢酶）和过氧化物酶体（酰基辅辅酶A氧化酶）β-氧化酶的其他基因也与MCAD并行激活。编码线粒体电子传递和氧化磷酸化相关酶和蛋白质的基因子集也被诱导，包括细胞色素c（c）肌特异性细胞色素氧化酶VIIIh亚单位、NADH（泛醌）脱氢酶和黄素蛋白-泛醌氧化还原酶。其他与线粒体相关的酶，如参与血红素合成的氨基乙酰丙酸合酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、肌酸激酶和醛脱氢酶，也因ERRα过度表达而诱导产生。值得注意的是，其他代谢途径的组成部分，如糖酵解和胆固醇代谢，也被ERRα激活。然而，与脂肪酸摄取和氧化相关的代谢途径相比，ERRα似乎对心肌细胞中的代谢途径的调节更为一致。最后，在表达ERRα的心肌细胞中，一些与收缩器相关的肌肉特异性基因上调，包括Ca2+-运输ATP酶、磷蛋白和肌球蛋白重链异构体。总之，这些结果表明ERRα上调了与细胞脂肪酸利用和线粒体氧化有关的基因。
假设的ERRα靶点通过独立的分析方法进行了验证（图。)。在心肌细胞中进行的独立过表达试验制备的RNA中证明了表达ERRα的肌细胞中脂蛋白脂肪酶、CD36/脂肪酸转运蛋白和FABP3的上调（图。)。将ERRα介导的参与线粒体能量产生的基因调节与PGC-1α的调节进行比较，PGC-1α已被证明可增加许多细胞核和线粒体编码的参与线粒体脂肪酸氧化和电子传输/氧化磷的基因的表达（图。) (28)。编码线粒体脂肪酸氧化酶（肌肉肉碱棕榈酰转移酶I[M-CPT I，CPT Iβ]和MCAD）和过氧化物酶体酶酰基辅酶A氧化酶的基因表达随着ERRα或PGC-1α的表达而增加。此外，ERRα适度诱导细胞色素氧化酶IV、细胞色素的表达c（c）和ATP合成酶β。虽然不太稳健，但这些结果与PGC-1α介导的调节作用相似。对ERRα过度表达细胞的全细胞蛋白提取物的分析证实了ERRα对MCAD、酰基辅酶A氧化酶和脂肪酰基辅酶A合成酶1蛋白的诱导作用（图。)。总之，结果表明ERRα调节PGC-1α靶点的一个子集，主要是与线粒体氧化脂肪酸分解代谢或呼吸功能有关的基因。
与细胞脂肪酸利用和线粒体呼吸途径有关的推测ERRα靶基因的验证。（A） 脂肪酸摄取酶基因的表达分析。用从Ad-GFP（GFP）或Ad-ERRα（ERRα）感染的心肌细胞中分离的15μg总RNA进行Northern印迹。将斑点与ERRα、脂肪酸转运体（FAT）/CD36、FABP3和脂蛋白脂肪酶（LPL）特异性探针依次杂交。（B） ERRα或PGC-1α诱导线粒体酶表达。用PGC-1α、MCAD、酰基辅酶A氧化酶（ACO）、M-CPT I、细胞色素氧化酶IV（COXIV）、细胞色素c（c）（Cyt.c）和ATP合成酶β，如图所示，心肌细胞RNA过度表达GFP、ERRα或PGC-1α。（C） Western分析从感染表达GFP或ERRα的腺病毒载体的大鼠新生心肌细胞制备的30μg全细胞提取物（WCE）。FACS-1，脂肪酰辅酶A合成酶1。
ERRα增加心肌细胞脂肪酸的摄取和氧化。
接下来，我们研究了观察到的ERRα诱导脂质转运和摄取以及线粒体氧化酶基因的生理相关性。将过度表达GFP（对照）或ERRα的心肌细胞与与牛血清白蛋白络合的油酸孵育，并用油红O染色以检测细胞内中性脂质（图。). . ERRα过度表达的心肌细胞显示小脂滴积聚增加。在PGC-1α或PPARα过度表达的心肌细胞中，在相同浓度的牛血清白蛋白-油酸中也观察到脂质积累增加，这些细胞被纳入阳性对照组（数据未显示）。
ERRα的表达导致原代心肌细胞脂质积聚。表达GFP（Ad-GFP）或ERRα（Ad-ERRα）并在35μM牛血清白蛋白复合油酸存在下培养的原代大鼠新生心肌细胞的油红O染色。红色液滴（插图）代表中性脂质的积聚。放大倍数，×400。
为了确定脂肪酸的利用是否也增加[三测定了H-9,10]棕榈酸（表)。与GFP相比，ERRα过度表达细胞中的平均棕榈酸酯氧化率显著增加（49.3±7.8%）。CPT I抑制剂埃托莫西尔将氧化速率抑制了85%（±0.4%），验证了该试验是专门测量线粒体脂肪酸氧化的（数据未显示）。在相同的测定中，PPARα或PGC-1α的过表达分别使棕榈酸氧化增加41%和92%，正如预期的那样（表)。这些数据与观察到的PPARα/PGC-1α对NIH 3T3细胞脂肪酸氧化的影响一致(46)。这些生理效应反映了观察到的基因表达变化，并证明ERRα增加心肌细胞脂肪酸摄取和氧化能力。
表2。
| 感染 | 平均值±SEM[三H] 棕榈酸氧化率（nmol[mg蛋白质]−1小时−1) | 平均%变化一（相对于GFP）±SEM |
|---|
| 腺病毒 | 11.25 (± 0.83) | 100 |
| Ad-ERRα | 16.80 (± 0.88) | 149.3 (± 7.8)* |
| Ad-PGC-1α | 21.58 (± 1.66) | 191.7 (± 14.8)* |
| Ad-PPARα | 15.90 (± 0.70) | 141.3 (± 6.2)* |
ERRα基因缺失对心肌和骨骼肌脂肪酸利用基因体内表达的影响。
ERRα基因敲除小鼠最近被描述(32)。ERRα基因敲除小鼠的表型包括白色脂肪细胞脂质代谢紊乱，表现为对饮食诱导肥胖的抵抗。上述结果表明，ERRα在体内参与骨骼肌和心脏能量代谢的基因调控中发挥作用。为了探索这种可能性，对野生型和同窝ERRα基因敲除动物的心肌和骨骼肌中与细胞脂肪酸摄取和氧化有关的几个推测ERRα靶基因的表达进行了表征（图。)。与野生型对照组相比，ERRα基因敲除小鼠心脏中编码MCAD或PPARα的转录物水平没有差异（图。)。有趣的是，与野生型心脏相比，ERRα基因敲除心脏中PGC-1α和ERRγmRNA的水平显著增加，表明ERRγ/PGC-1α复合物介导的代偿反应。
删除错误α基因对小鼠心脏和骨骼肌脂肪酸利用酶基因的表达有差异性影响。（A） 用从野生型（WT）或ERRα心脏分离的15μg总RNA进行Northern blot研究−/−老鼠。将印迹依次与对应于MCAD、PGC-1α、PPARα和ERRγ的探针杂交。右侧显示了北方信号强度的磷光图像量化。数据表示归一化为野生型值（=1.0）的平均强度值（±标准误差）。（B） Northern分析总RNA，比较ERR亚型、PGC-1α、PPARα和MCAD在主要由快速抽搐糖酵解纤维组成的股外侧肌和由慢开关氧化纤维组成的比目鱼肌中的表达。（C） （左）野生型比目鱼肌和ERRα总RNA的Northern分析−/−老鼠。显示了每个基因型的代表性样本对。（右）野生型比目鱼鱼基因表达的实时PCR（Taqman）分析(n个=6）和ERRα−/−(n个=6）小鼠。除了在Northern面板中检测到的转录物外，还对编码细胞脂肪酸利用酶M-CPT I和PPARβ亚型的mRNA进行了定量分析。数据表示校正为β-肌动蛋白转录物并归一化为野生型（=1.0）的平均任意单位（±标准误差）。星号表示显著差异(P（P）<0.05）。
影响错误骨骼肌中α基因缺失对ERRα靶基因表达的影响与心脏不同。作为初步步骤，在野生型小鼠中评估了ERR亚型在股外侧肌和比目鱼肌中的相对表达水平（图。)。比目鱼肌ERR亚型、PPARα、PGC-1α和MCAD（用作线粒体脂肪酸氧化能力的标记物）的表达显著高于野生型小鼠的vastus。这些结果表明，ERRα缺失对推测ERRα靶点表达的任何影响都很可能在比目鱼肌中观察到。
与心脏相比，已知PPARα基因靶点MCAD的转录水平在ERRα中较低−/−比目鱼与野生型对照比目鱼相比。然而，与野生型小鼠相比，ERRα阴性的比目鱼肌中观察到其他几个已知的PPARα靶点（CD36/脂肪酸转运体或M-CPT I）没有变化（图。)。关于可能的代偿性变化，PGC-1α的表达显著增加，与心脏ERRα缺失的影响相似。然而，ERRγ和PPARα在ERRα中没有变化−/−老鼠比目鱼。这种独特的补偿性基因调控模式，尤其是ERRγ基因缺乏诱导，可能导致ERRα缺失对比目鱼肌PPARα靶点与心脏的差异影响。总之，ERRα缺失和过度表达研究的结果支持ERRα在调节肌肉线粒体氧化代谢中的作用。
ERRα激活PPARα基因调控途径。
上述ERRα过表达研究揭示了参与脂肪酸利用途径的许多基因的上调，其中大多数是已知的脂肪酸应答核受体PPARα的靶基因(8)。这些结果表明，ERRα驱动与PPARα重叠的代谢调节程序，或者ERRα可能调节PPARα信号通路。为了探讨这一潜在机制，我们研究了ERRα对PPARα和相关转录激活物表达的影响。
阵列分析中称PPARα转录物缺失，表明该分析不够敏感，无法检测心肌细胞中的内源性PPARα水平。因此，我们使用更敏感的Northern和实时PCR分析来观察PPARα表达的变化（图。)。ERRα的强制表达使心肌细胞内源性PPARα转录水平增加了8.3倍。尽管我们也观察到ERRα过度表达的心肌细胞中PPARβ表达增加了约两倍，但ERRα介导的调节对PPARα亚型最为稳健（图。)。在C细胞中，ERRα也上调了PPARα的表达2C类12肌管。内源性PGC-1α的表达不受ERRα影响，表明ERRα的代谢效应不是通过已知的PGC-1β协同激活PPARα的效应介导的（图。) (46)。相反，PGC-1α的强制表达导致心肌细胞ERRα和PPARα的表达上调，表明可能存在涉及PGC-1β、ERRα、PPARα等的前馈调节。
ERRα诱导内源性PPARα表达。（A） Northern分析以表征表达GFP、ERRα或PGC-1α的心肌细胞中线粒体脂肪酸氧化调节器、PPARα、PGC-1β和ERRα的表达。（B） 心肌细胞和C细胞ERRα过度表达对PPARα和PPARβmRNA水平的影响2C类12实时PCR检测肌管。数据表示校正为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）转录物并标准化为表达GFP的肌细胞中的值的平均任意单位（±标准误差）（=1.0）。
为了确定ERRα是否直接调节PPAR（购电协议）α基因，人类PPAR（购电协议）在不存在或存在PGC-1α的情况下，将含有1664bp 5′-侧翼区的α启动子报告子构建体pα（H-H）pGL3与ERRα共转染到CV1细胞中。ERRα单独联合转染激活了PPAR（购电协议）α启动子几乎是5倍（图。)。正如预期的那样，辅活化剂PGC-1α的加入显著增强了ERRα介导的PPAR（购电协议）α启动子。我们还测试了与ERRα共享许多靶基因的相关亚型ERRγ（图。)。ERRγ激活了PPAR（购电协议）α启动子的大小与ERRα相似。尽管我们已经证明PGC-1α和ERRγ形成功能复合物(19)ERRγ的活性仅通过在PPAR（购电协议）α启动子。
ERR亚型激活PPAR（购电协议）α基因启动子通过一个保守的核受体结合位点。（A） CV1细胞瞬时共转染研究以分析ERR的调节PPAR（购电协议）α启动子。（左）报告者构建了pα（H-H）-pGL3，包含人类的−1664到+83区域PPAR（购电协议）α基因启动子与空表达载体（−ERRα）或pcDNA3.1-hERRα（+ERRα。（右）在与ERRα相同的条件下分析ERRγ的激活。共转染β-半乳糖苷酶（β-gal）表达结构以控制转染效率。（B） 用野生型进行瞬时转染PPAR（购电协议）α启动子-报告子结构或在HNF-4应答元件（HNF4-REmut）或法尼类X应答元件（FXREmut，farnesoid X-responsive element）位点突变的结构。按照面板A所述进行实验。所有条形图表示β-半乳糖苷酶的平均（±标准误差）校正相对光单位（RLU），并将其归一化为与pcDNA3.1（−）（=1.0）共同转染的报告者的活性。数据代表至少三项独立试验，一式三份。（C） 电泳迁移率变化分析采用32与人体内含有的野生型HNF-4响应元件相对应的P标记探针帕帕α启动子或突变的HNF-4应答元件（Mut）。Mut探针包含与B中分析的HNF4 REmut启动子报告子相同的核苷酸取代。将探针与1或3μl在兔网织红细胞裂解物中合成的重组人ERRα（左）或小鼠ERRγ（右）孵育。控制反应包括单独探针（−）和与未编程网织红细胞裂解物（rl）孵育的探针。（D） （Top）L6成肌细胞感染Ad-ERRα48 h。用非特异性抗体（免疫球蛋白G）或抗人ERRα（ERRα）抗体免疫沉淀交叉染色质。对应于310-bp区域的放大器PPAR（购电协议）用PCR扩增含有HNF-4反应元件（PPARα）的α启动子或TFIID启动子（对照，Cont）的210-bp非特异性区域。输入值占免疫沉淀反应中使用的总染色质的0.2%。显示了多个实验的代表性试验。（底部）染色质免疫沉淀实验的带强度通过密度测定法进行量化。数据表示三个独立试验的平均条带强度，以任意单位表示（±标准误差），PCR以三份为标准，以免疫球蛋白G（=1.0）为标准。星号表示与对照组（免疫球蛋白G）相比有显著差异。
人类PPAR（购电协议）α基因启动子包含两个独立的核受体反应元件，位于1664-bp的区域，对ERRα有反应。远端位点包括直接重复序列1（DR1），通过DR1几个受体，包括肝细胞核因子4（HNF-4）和鸡卵清蛋白上游启动子转录因子I，以及PPARα本身，激活或抑制启动子的活性(36)。近端部位结合法尼体X受体，使胆汁酸反应性增强PPAR（购电协议）α启动子(35)。为了确定先前表征的核受体结合位点是否参与ERRα/PGC-1α介导的PPARα基因激活，用全长突变PPARα启动子结构重复共转染实验，其中HNF-4或法尼类X受体被破坏（图。)。FXREmut被ERRα/PGC-1α激活，激活程度与野生型启动子相同。然而，HNF-4反应元件（HNF4-REmut）的破坏破坏了人类的诱导PPAR（购电协议）ERRα/PGC-1α启动子。有趣的是，HNF4-REmut结构体的基础活性比野生型高20倍，这表明HNF-4应答元件被CV1细胞中的阻遏物占据，该阻遏物质被ERRα或HNF-4等激活物取代。尽管HNF4-REmut的基线活性增强，但仍观察到法尼类X受体配体鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的诱导作用，这种诱导作用是通过下游法尼类X受体发生的，这表明改变的基线活性不会阻止通过其他元素的进一步激活（数据未显示）。
然后我们试图确定ERR亚型是否直接与PPAR（购电协议）α启动子。电泳迁移率变化分析使用与野生型和突变的HNF-4响应元件对应的放射性标记探针以及在网织红细胞裂解液中合成的重组ERRα和ERRγ蛋白进行。ERRα和ERRγ以浓度依赖的方式结合到HNF-4响应元件（图。)。相比之下，突变的HNF-4应答元件，包含与ERRα应答相同的突变，并没有与ERR亚型形成复合物。使用野生型和突变法尼类X反应元件探针进行平行结合分析，但未观察到与ERRα或ERRγ的结合（数据未显示）。
为了确定ERRα是否与PPAR（购电协议）在细胞中的α启动子，对从表达ERRα的L6成肌细胞分离的交联染色质进行染色质免疫沉淀分析（图。)。与与非特异性抗体（免疫球蛋白G）平行进行的沉淀相比，用富含HNF-4反应元件的染色质的ERRα抗体沉淀（约三倍）。总之，这些研究表明ERRα激活PPAR（购电协议）通过核受体反应元件转录调节α基因表达，该元件在人类和啮齿动物中是保守的PPAR（购电协议）α基因。
ERRα介导的脂肪酸氧化酶基因的激活依赖于PPARα的存在。
我们的数据表明，ERRα过度表达诱导PPARα靶点参与细胞脂肪酸利用，并能够直接激活PPAR（购电协议）α基因转录。因此，观察到的对ERRα的代谢调节可能通过直接调节代谢靶基因或通过调节PPARα途径发生。为了确定某些ERRα介导的调控事件是否依赖于PPARα，我们评估了ERRα过度表达对PPARα靶基因表达的影响（无论是否存在PPARα）。
为此，ERRα在从ERRα分离的原代成纤维细胞中被腺病毒过度表达−/−（ERRα基因敲除）小鼠或PPARα−/−ERRα−/−（双敲除）小鼠（图。)。ERRα敲除细胞被用作PPARα表达对照，以最大限度地检测ERRα介导的下游靶点激活。正如预期的那样，ERRα在ERRα基因敲除细胞中诱导了脂肪酸氧化、MCAD和酰基辅酶A氧化酶中已知PPARα靶点的表达（图。)。与此形成鲜明对比的是，在双敲除细胞中，ERRα并没有诱导这些脂肪酸氧化靶基因的表达。尽管ERRα在ERRα基因敲除细胞中的诱导需要ERRα辅活化因子PGC-1α的共表达，但在另一个PPARα靶点M-CPT I中也观察到类似的结果（图。)。正如预期的那样，与GFP对照组相比，表达ERRα的ERRα敲除成纤维细胞中诱导了内源性PPARα（数据未显示）。此外，PPARα靶基因（MCAD和酰基辅酶A氧化酶）在双敲除细胞中过度表达PPARα时被诱导（数据未显示）。因此，ERRα介导的诱导至少一部分参与细胞脂肪酸利用的基因需要PPARα。
β-氧化酶基因的ERRα诱导依赖于PPARα的存在。从ERRα分离的原代成纤维细胞−/−PPARα−/−（双淘汰，DKO）或ERRα−/−如图所示，用表达GFP（−）或ERRα（+）的腺病毒构建物感染ERRKO小鼠。在某些条件下加入PGC-1α以增强ERRα活性。实时PCR用于量化从这些细胞分离的总RNA中内源性MCAD和酰基辅酶A氧化酶（ACO）（A）或M-CPT I（B）的表达。数据以平均值（±标准误差）任意单位报告，标准化为GFP条件（=1.0），用于三次独立试验，一式三份。（C） 在与上述表达GFP或ERRα的原代成纤维细胞相同的原代成纤维细胞中测量棕榈酸酯氧化率。数据被归一化为GFP（=1.0），数值代表对来自两个独立分离的细胞进行的三个过度表达试验的平均值（±标准误差）。星号表示与对照组相比有显著差异（减去ERRα）。
在ERRα敲除和双敲除成纤维细胞中也测量了ERRα过表达对棕榈酸氧化速率的影响（图。)。在ERRα基因敲除细胞中，ERRα过度表达使氧化速率增加63%。相反，ERRα的表达仅导致双敲除成纤维细胞中棕榈酸氧化率增加15%。有趣的是，PGC-1α过表达（用作阳性对照）能够诱导ERRα敲除细胞和双敲除细胞中的棕榈酸氧化（数据未显示），这表明除ERRα和PPARα外，另一个PGC-1β伙伴能够介导脂肪酸氧化的激活。这些结果与基因表达研究一致，证明了由RRα介导的成纤维细胞脂肪酸氧化诱导需要PPARα。
讨论
尽管ERR是第一个克隆的孤儿核受体家族，但其生物学功能仍不确定(12，13)。最近的证据表明ERRα和ERRγ参与细胞能量代谢的转录调控。ERRα在具有高氧化代谢能力的成年哺乳动物组织中富集，如心脏、缓慢转换的骨骼肌和棕色脂肪。ERRα和ERRγ最近也被证明是PGC-1辅活化子家族的功能性伴侣(17，19，21，42)已成为线粒体代谢和生物生成的关键调节器(23，37)。我们假设ERR亚型是PGC-1α下游心脏和骨骼肌能量代谢的关键调节器。为此，在心肌细胞中进行了基因表达谱实验。ERRα过度表达可增加参与细胞脂肪酸利用的多种途径的基因表达，包括脂肪酸摄取、细胞内结合和线粒体氧化。此外，ERRα上调了参与线粒体电子传递和氧化磷酸化的基因子集。
心脏和慢开关骨骼肌主要通过线粒体中脂肪酸的氧化来满足高ATP需求。我们的结果表明ERRα是心肌细胞氧化代谢的激活剂，这与心脏和慢切换骨骼肌中该核受体的丰富表达一致。事实上，ERRα缺失小鼠心脏中PGC-1α和ERRγ的表达呈现代偿性增加，比目鱼肌中MCAD（一种关键脂肪酸代谢靶基因）的表达降低，而ERRγ表达没有变化。这些发现强烈表明，ERR亚型有助于氧化组织中脂肪酸利用基因的高水平基础表达。
与这一结论一致，最近在一项蛋白质组学和基因表达谱联合研究中显示，ERRα与与线粒体物理相关的蛋白质和酶协同调节，进一步支持其作为能量代谢调节器的作用(33)。有趣的是，ERRα阴性动物的白脂肪（主要是糖酵解组织）的代谢功能受损，并且与MCAD表达增加有关(32)。这些明显不同的结果支持ERRα具有复杂的组织选择性代谢调节功能，ERRα的活性依赖于特定组织中共存的辅因子的补体。然而，我们的体内基因表达数据并不排除间接影响，例如与ERRα缺陷状态相关的代谢紊乱，影响一些假定基因靶点的表达。
我们发现，心肌细胞中ERRα过度表达的代谢调节效应与核受体PPARα的代谢调节作用有相当大的重叠。以下证据表明，这种重叠至少部分是由于ERRα直接激活PPARα基因表达所致：（i）ERRα诱导心肌细胞PPARα表达过度，C2C类12骨骼肌肌管和原代小鼠成纤维细胞；（ii）ERRα直接激活PPAR（购电协议）α基因启动子通过保守的核受体反应元件在体外和细胞内结合进行瞬时共转染检测；和（iii）ERRα介导的对原代成纤维细胞中脂肪酸氧化靶标子集的调节绝对需要PPARα的存在。具体而言，在PPARα阴性成纤维细胞中ERRα的过度表达对PPARα靶点的表达没有影响，包括M-CPT I、MCAD或酰基辅酶A氧化酶，但ERRα激活了PPARα表达细胞中的这些靶点。这些结果强烈表明，在ERRα和PPARα共存的组织中，如骨骼肌和心脏，ERRα激活PPARα是控制参与细胞脂肪酸代谢的某些基因表达的重要机制。
总之，我们的数据和最近发表的研究结果表明，ERRα通过激活几个下游转录调控级联来调节线粒体代谢。在审查这份手稿时，两项研究提供了额外证据，证明ERRα是PGC-1α介导的线粒体代谢调节的关键成分。Schreiber等人证明，通过RNA干扰抑制ERRα表达，PGC-1α诱导线粒体增殖和呼吸链酶基因表达受到损害(41)，表明ERRα是PGC-1α的下游，在调节某些线粒体生物起源程序中。Mootha等人的研究发现，在C中PGC-1α下游的ERRα也有类似的作用2C类12肌管(34)。后一项研究表明，ERRα通过直接激活NRF级联加布（Gabba）基因启动子，其编码NRF-2复合物的一种成分。这些数据与我们的研究结果一致，表明ERRα通过汇合PPARα调节途径激活心肌细胞线粒体脂肪酸氧化。
我们的数据并不排除这样的可能性，即除了激活PPARα外，ERRα在某些靶基因的调节中发挥直接作用。我们的基因表达谱研究结果表明，除了脂肪酸氧化酶基因外，ERRα还激活了许多参与细胞脂肪酸摄取和线粒体呼吸的基因。这些基因中有许多可能直接受ERRα调控。事实上，我们以前的工作证明ERRα与PGC-1α直接激活MCAD公司通过NRRE-1进行瞬时转染试验中的基因启动子，NRRE-1是一种多效性核受体反应元件，已被证明能结合PPARα和ERRα(14，19，43，47)。我们还观察到脂蛋白脂肪酶ERRα启动子（J.Huss，未发表的观察结果）。此外，最近的研究表明，ERRα与PGC-1α直接激活ATP合成酶β和细胞色素c共有ERRα反应元件的基因启动子(41)。因此，ERRα可能通过多种途径调节细胞代谢，包括通过其他转录因子的间接调节和代谢靶基因的直接调节。
我们的结果和其他人的研究表明，在培养细胞中，ERRα的表达被PGC-1α上调（图。) (42)以及在小鼠体内过度表达PGC-1α(39; L.Russell和J.Huss，未发表的评论）。这些结果将ERRα置于PGC-1α调节网络的中心位置（图。)。我们建议ERRα将PGC-1α衍生信号转导给转录因子，如PPARα和NRFs，以及直接转导到参与能量代谢的靶基因(34，41)。ERR亚型在介导PGC-1α对细胞代谢和生理作用中的作用程度尚不清楚。然而，禁食、运动和冷暴露对PGC-1α的诱导作用表明，该调节回路在心脏和骨骼肌能量代谢的生理调节中起着关键作用。鉴于线粒体氧化代谢紊乱发生在骨骼肌胰岛素抵抗和心肌肥大等病理生理状态，ERR可能被证明是糖尿病和心力衰竭等常见人类疾病的一个有吸引力的治疗靶点。
ERRα在调节细胞氧化能力中的作用。PGC-1α协同激活和调节许多转录因子的表达，包括ERRα、PPARα和NRFs，这些转录因子参与调节PGC-1对细胞代谢的影响。PGC-1α对ERRα和NRF-2表达的调节涉及交叉和自身调节机制(25，34)。当前研究中的数据表明，ERRα可能引导PGC-1α上调PPARα。作为对PGC-1α的反应，NRF级联的激活调节线粒体呼吸和生物发生相关的基因，而PPARα途径的激活调节脂肪酸摄取和线粒体氧化酶。ERRα也可能直接调节这两条途径中的代谢靶基因。FAO，脂肪酸氧化；酰基辅酶A氧化酶；线粒体转录因子A；氧化物。磷酸盐。，氧化磷酸化。
