实体瘤是一种独特的组织类型，其特点是缺氧、低pH值和缺乏营养(45). 虽然氧张力降低对正常人类细胞有潜在的毒性，但癌细胞会获得遗传和适应性改变，使其能够在缺氧的微环境中生存和增殖。肿瘤内缺氧导致许多生理过程发生深刻变化，包括糖代谢改变、血管生成上调、侵袭能力增强和凋亡程序失调(37).
从临床角度来看，许多研究已确定低氧是头颈部、颈部或软组织（肉瘤）肿瘤患者的独立不良预后变量(三,26). 关于肿瘤中观察到的缺氧程度，有人提出，实体肿瘤缺氧区域内的细胞通常从上调的糖酵解途径中获得几乎所有的代谢能量需求。这种现象被称为巴斯德效应(34)并对肿瘤微环境中暴露于严重缺氧的肿瘤细胞的生存能力提供了部分生理学解释。用于直接测量癌症患者氧分压的极谱针电极研究表明，相当大比例的乳腺癌（高达40%）包含氧分压严重降低的区域（0至2.5毫米汞柱，而正常组织范围为24至66毫米汞柱），同时仍支持活的肿瘤细胞(40). 此外，缺氧细胞对放疗和化疗更具抵抗力；这种耐药性是实现最大治疗效果的一个重大挑战(32). 总之，这些研究强调了在分子水平上阐明缺氧影响的重要性，以及这种情况导致更具侵袭性的表型和肿瘤进展的机制。
肿瘤进展与遗传不稳定性有特别的相关性(27). 此外，长期以来，人们一直认为，在恶性细胞中发现的大量突变不能用体细胞中观察到的低突变率来解释，这导致了癌症细胞在肿瘤发生过程中呈现突变表型的说法(23). 我们和其他人已经提出肿瘤微环境会导致这种遗传不稳定性(31). 事实上，几项同时使用报告基因和内源性基因座的研究表明，与培养的相同细胞相比，肿瘤细胞的突变率增加(22,29,31). 缺氧似乎是基因不稳定发展的关键微环境因素。研究表明，它与DNA损伤增加、突变增强和DNA修复途径中的功能损伤有关。关于DNA损伤，缺氧和随后的复氧会导致DNA链断裂和氧化碱损伤，如8-氧鸟嘌呤和胸腺嘧啶二醇(47). 培养细胞暴露于缺氧条件下会增加报告基因位点的点突变频率(31). 低氧-再氧循环也与其他遗传变异有关，包括基因扩增和DNA过度复制，尽管其发生的机制尚未完全阐明(7,46). 我们实验室的研究也证实了缺氧会导致核苷酸切除修复（NER）途径的功能性降低(48). 此外，此前有报道称，严重缺氧（0.01%O2)特异性下调DNA错配修复基因的表达MLH1型导致突变率增加(25). 总之，这些现象构成了缺氧诱导的遗传不稳定的来源，从而可能加速肿瘤进展的多步骤过程。
鉴于在缺氧条件下观察到的动态和复杂的基因表达变化，我们一直在研究其他DNA修复基因的表达变化是否也会在缺氧反应中发生，从而在缺氧诱导的遗传不稳定性中发挥作用。在本研究中，我们利用转录组分析来确定可能受缺氧调节的DNA修复途径。我们报告称RAD51系列哺乳动物细胞中同源重组（HR）的关键介质，在mRNA水平上被缺氧特异性下调，导致该基因的蛋白表达显著降低。在各种组织的许多细胞系中观察到低氧条件下Rad51蛋白表达降低，重要的是，即使在再氧后的低氧期，这种降低也持续存在。这一发现与实体肿瘤尤其相关，实体肿瘤通常经历波动的血管灌注，导致氧张力在空间和时间上发生变化。对蛋白质稳定性、信使核糖核酸稳定性和启动子活性的分析表明，缺氧通过抑制RAD51系列基因启动子。Rad51下调似乎与细胞周期和缺氧诱导因子（HIF）无关，因为Rad51表达与细胞周期或HIF诱导之间没有相关性。我们还检测到缺氧和缺氧后细胞的HR显著降低，表明缺氧介导的RAD51系列基因表达具有功能性后果。体内肿瘤微环境中也证实了低氧介导的Rad51下调：通过对宫颈癌和前列腺癌异种移植物的免疫荧光图像分析，我们观察到低氧标记物（EF5）染色与体内Rad51蛋白表达之间存在一致的反向关联。我们提出实体肿瘤中存在缺氧和缺氧后表型，其特征是关键DNA修复基因表达减少，这是肿瘤微环境中获得性遗传不稳定性的一种新机制。
材料和方法
细胞。
MCF-7（HTB-22）、A549、RKO、SW-480、HeLa（CCL-2(4). 786-0细胞系是W.G.Kaelin的礼物，按照前面的描述进行培养(24).
质粒和转染。
HIF-1α表达载体pCEP4-HIF-1α是G.Semenza慷慨赠送的礼物，已在前面描述过(12). 5X-HRE荧光素酶报告质粒是由中云赠送的，之前已经描述过(35). 根据制造商的建议，使用Fugene 6试剂（罗氏诊断公司，印第安纳波利斯）进行转染。
缺氧暴露。
如前所述，细胞在体外暴露于缺氧(6). 简言之，对于0.2%至0.5%的氧气实验，NAPCO培养箱（Precision Scientific，Winchester，Va）配备有PROOX 710传感器（BioSphereix，Redfield，NY），以调节100%N的流量2低压（<25 lb/in2)以便在指定的时间内在整个培养箱内实现恒定的氧气浓度。首席执行官2通过使用规定的内部CO将浓度维持在5%2监管体系。严重缺氧（0.01%O2)如前所述建立(31)通过使用95%N的增湿混合物的连续流动2和5%CO2经认证的气体中O含量低于10 ppm2（美国康涅狄格州柴郡东北航空公司）。甲磺酸去铁胺（DFX）（西格玛，密苏里州圣路易斯）处理通过在常压条件下补充250μM浓度的培养基24小时来进行。
转录组分析。
使用GenCompass通用微阵列系统（Agilix Corporation，New Haven，Conn.）进行微阵列分析。最近描述了这项技术的具体细节(33). 数据参考UniGene数据库Build 161（马里兰州贝塞斯达国家生物技术信息中心）。通过平均每个低氧暴露条件下标签的信号强度与来自对照（常氧）细胞的标签的信号密度的比值来计算基因调控。
蛋白质印迹分析。
如前所述，制备放射免疫沉淀分析蛋白裂解物，并进行Western blot分析(4,25). 使用以下抗体进行分析：抗VHL（克隆IG32）和抗Rad51（BD Pharmingen，新泽西州富兰克林湖）、抗tubulin（克隆B-512；Sigma）、抗β-肌动蛋白（研究诊断，新泽西法兰德斯）、抗HIF-1α（克隆54；BD转导实验室，新泽西省富兰克林湖）、，和抗Glut1（阿尔法诊断国际，德克萨斯州圣安东尼奥）。使用NIH图像（版本1.63；马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院[NIH]）对色带进行量化。用辣根过氧化物酶结合的抗鼠或抗兔免疫球蛋白G和增强化学发光检测系统（英国白金汉郡小查方市Amersham Biosciences）观察蛋白质条带。
半定量RT-PCR和qPCR分析。
使用SuperScript一步法RT-PCR试剂盒（加州卡尔斯巴德生命科技公司）进行半定量逆转录酶PCR（RT-PCR）分析。下一节列出了所有分析中使用的每个基因的引物序列。通过使用之前通过Northern印迹分析的100-ng常氧和缺氧RNA样品，确定每个基因的线性扩增范围。根据制造商的建议进行RT-PCR扩增。如有要求，可提供有关优化RT-PCR协议的其他信息。通过使用NIH图像（1.63版）分析SYBR Gold（分子探针，俄勒冈州尤金市）或溴化乙锭（西格玛）染色凝胶定量条带。对于定量实时PCR（qPCR），使用Beacon Designer 2.06（Premier Biosoft International，Palo Alto，Calif.）设计引物和探针，并使用MX400多重定量PCR系统（Stratagene，La Jolla，Calif）进行分析，如前所述(33). 如有要求，可提供用于所有分析的底漆和探针。
Northern印迹分析。
总RNA通过使用TRIzol RNA分离系统（Life Technologies）分离，然后进行酚氯仿提取。如前所述进行Northern印迹分析(25). 以下引物对用于构建探针：RAD51系列5′-TGGCCCACACACACATTTCAC-3′（正）和5′-TCAATGTACACTCTCTCAC-3′（反义）；血管内皮生长因子基因(血管内皮生长因子)，5′-CTTCACTGGATGATTTGACTGCTGTGG-3′（有义）和5′-GCTTAGTGACTCACCGATGGAG-3’（反义）。β-肌动蛋白引物来自Ambion。通过放射自显影术对斑点进行可视化，并通过荧光成像仪分析或使用NIH Image软件进行定量。
蛋白质和mRNA稳定性分析。
将细胞置于直径为10-cm的培养皿中，并让其附着24小时，然后在有无DFX（250μm）的条件下培养24小时。然后将作为蛋白质合成抑制剂的环己酰亚胺（CHX）（10μg/ml；Sigma）或作为转录抑制剂的放线菌素D（ActD）（5μg/ml。在添加抑制剂后的指定时间采集细胞，通过Western和Northern印迹法分别测定Rad51蛋白和mRNA的表达水平。RAD51系列根据mRNA降解图从回归线推断mRNA半衰期。
荧光素酶报告基因分析。
对于荧光素酶报告基因分析RAD51系列该基因通过UCSC基因组浏览器（加州大学圣克鲁斯分校）进行鉴定，通过基因组PCR进行分离，然后亚克隆到pGL3-基本载体（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。底漆可根据要求提供。亚克隆片段包含真核启动子数据库中描述的核心启动子区域(30)以及使用Genomatix启动子识别算法PromoterInspector进行的电子分析(44). 用于转染，5×105将RKO细胞一式两份接种到6孔培养板中，并使用Fugene 6试剂（罗氏诊断公司）转染1μg每个报告构建物。萤火虫和雷尼利亚根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告分析系统试剂盒（Promega）测量荧光素酶活性。雷尼利亚将来自共转染的pRL-SV40对照载体（5ng/孔）的萤光素酶活性用于标准化。
细胞周期和荧光激活细胞分选仪（FACS）分析。
如前所述进行细胞周期分析(2). 染色细胞在Becton Dickinson FACS-Calibur流式细胞仪上进行分析。使用BD CellQuest Pro软件（Becton Dickinson）进行数据捕获、密度图和直方图构建，并使用ModFit LT软件（Verity House software，Topsham，Maine）确定细胞周期分布曲线。
对于FACS实验，在37°C的黑暗条件下，用10μg Hoechst 33342（分子探针）/ml在常氧和缺氧细胞中培养1小时。还向培养基中添加维拉帕米（100 mM；Sigma）以抑制培养过程中的染料流出。然后将细胞胰蛋白酶化，并将其重新悬浮在补充有0.1%胎牛血清、10μg Hoechst 33342染料/ml和100 mM维拉帕米的培养基中，以进一步提高染料吸收。特定G的相等数1-使用BD FACSvantage流式细胞仪和紫外激光，根据DNA含量对S期细胞群进行分类，并在添加10%胎牛血清的0.5ml培养基中收集细胞。然后使用改进的TRIzol方案从分离细胞中提取RNA。最近有报道称，这项技术有助于从细胞周期不同阶段的活细胞中恢复完整的mRNA(20).
HR分析。
穿梭载体质粒pSupFG1/G144C含有supFG1（支持FG1）之前已经描述过144位G:C-C:G点突变失活的基因(5). 在所有穿梭试验中，将5μg pSupFG1/G144C质粒DNA与10μg PCR生成的1-kb同源供体片段混合，该供体片段包含野生型supFG1（支持FG1）基因在50mM Tris（pH 6.8）中。将质粒供体混合物转染到细胞中指定时间后，如前所述，使用改良的Hirt裂解物程序回收质粒DNA(5). 纯化后的质粒用于转化大肠杆菌SY302细胞通过电穿孔，然后在指示板上生长细胞进行遗传分析supFG1（支持FG1）如前所述的基因功能(5).
人类异种移植体内的缺氧免疫染色。
对于每个细胞系，肿瘤细胞悬浮液（50μl）含有5×105将细胞注入SCID小鼠腓肠肌。当肿瘤直径达到4至5 mm时，静脉注射硝基咪唑低氧标记物EF5（俄亥俄州贝德福德Ben Venue Laboratories，Bedford）（200μl 10 mm储备溶液），3小时后切除肿瘤，放置在Tissue-TekOCT化合物中（加州托伦斯Sakura Finetek），并在液氮中冷冻snap。如前所述进行免疫荧光分析(42). 冷冻切片在4°C下与单克隆抗Rad51抗体（Affinity Biochents，Inc.，Golden，Colo.）孵育过夜，然后与驴抗鼠Cy3-结合二级抗体孵育（稀释1:400；Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，Pa.）。组织结合EF5通过使用1:30稀释的单克隆抗体ELK3-51（由费城宾夕法尼亚大学Cameron Koch提供）直接标记Cy5进行标记。然后，使用安装在配备有计算机控制的电动舞台（Ludl Electronic Products，Hawthorne，N.Y.）的外荧光显微镜（Olympus，Melville，N.Y）上的冷却电荷耦合设备相机（Quantix，Photometrics，Tucson，Ariz.）对切片进行成像。
结果
转录组对缺氧的反应。
已经发表了一些报告，其主要目的是评估缺氧条件下的基因表达模式(37). 这些研究大多集中于短暂暴露于轻度或中度缺氧期间诱导的表达模式。在这项工作中，我们试图进一步描述更长时间暴露于低氧环境下（0.5%氧气下24小时）的基因表达模式2)通过使用基于转录组分析的方法筛选缺氧调节的已知和新基因。
通过转录组分析在人类MCF-7乳腺癌细胞中检测到约48000个转录物（三个生物复制中16000个独特转录物）的缺氧/常压（H/N）表达比率，结果表明绝大多数基因（～85%）的表达水平不会因缺氧24小时（0.5%）而改变2)（图。); 在≥2倍调节的阈值下，大约5%的检测到的基因表现出缺氧的上调，而10%的基因表现出缺氧的下调。这些发现来源于两个独立的低氧-缺氧实验中获得的三份分析的混合RNA样品。有趣的是，当分析阈值增加到≥6倍的变化时，更多的基因似乎被缺氧上调而不是下调（分别为0.3%和0.1%）。这些结果表明，缺氧反应中会出现特定的上调和下调模式，并且它们表明，在确定缺氧细胞的表型时，某些基因的表达减少可能与表达增加同样重要。
MCF-7细胞暴露于0.5%O 24小时后对缺氧的转录组反应2（A）基于H/N表达比率（对数2). （插图）在两倍、四倍和六倍阈值下上调和下调基因的百分比。（B） 选择GenCompass微阵列检测到的先前被确定为受缺氧调节的基因。提供了接入号码供参考。H/N比是三个独立实验的平均值。国家发改委1,N-千年一遇下游调控基因1。（C） 所选DNA修复基因的GenCompass H/N表达比率，列出了各自的途径。H/N比是两个实验的平均值。BER，基底切除修复；MMR，不匹配修复。ERCC1型切除修复交叉互补组1；APEX2型无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子2；PMS2型染色体后分离增加2个；RAD51系列，RAD51同源。
正如预期的那样，低氧暴露导致几个已知HIF靶基因的表达增加（图。)例如葡萄糖转运蛋白1(SLCA21型，或葡萄糖转运蛋白1)和血管内皮生长因子(17). 糖酵解相关基因先前被证明受缺氧上调，如磷酸甘油酸激酶I(PGK1系列)和醛缩酶C(醛糖)，也显著上调。此外，最近还报道了其他几个可诱导缺氧的基因，如DEC1(BHLHB2型)和低氧诱导基因2(高强度气体2)显示了显著的海拔高度，H/N比值分别为9.1倍和9.3倍。图中所示基因的H/N倍数变化。经qPCR验证（数据未显示）。
缺氧条件下DNA修复基因的表达。
鉴于之前尚未对长期缺氧条件下DNA修复基因的表达进行全面分析，我们试图确定这类基因中是否存在通过缺氧表现出新调节的特异基因。微阵列检测到直接在DNA修复中发挥作用的基因的50多个转录物的表达，图中显示了来自几个修复途径的代表性基因。大多数检测到的DNA修复基因的表达水平没有因缺氧而发生实质性改变，包括NER和碱基切除修复等通路中的基因，这与我们实验室以前通过Western blot分析检测这些通路中因子的表达模式的工作相一致(48). 一份来自这些途径的更全面的DNA修复基因列表，包括其中几个基因的qPCR表达验证，可根据要求提供。我们确实检测到MLH1型缺氧条件下的表达（1.3倍[数据未显示]）。之前已经证明MLH1型缺氧会降低表达，特别是在长时间（>24小时）严重缺氧（<0.1%O）后2)因此发现MLH1型mRNA在中度缺氧24小时时仅略有下降（0.5%2)与以前的数据一致(25).
有趣的是，我们检测到RAD51系列缺氧（4.3倍）。qPCR证实了这种减少，并且是针对RAD51系列基因；我们没有发现低氧诱导的其他HR基因表达减少RAD52型上位群(38)，包括RAD51B型,RAD54B型,RAD52型、和RAD50型（未显示数据）。因此，我们推断，关键HR相关基因的减少可能会损害缺氧细胞的重组修复。
低氧或铁导致Rad51蛋白表达减少2+螯合剂DFX。
我们试图确定在微阵列和qPCR实验中观察到的变化是否也在蛋白质水平上表现出来。为了说明蛋白质稳定性的影响，我们不仅在微阵列实验中使用的24小时时间点检测了Rad51蛋白的表达水平，而且在缺氧48小时后也检测了Rad51蛋白的表达水平。如图所示。Western blot分析显示，在缺氧48小时后（约三倍）（第4通道），Rad51蛋白水平显著降低，缺氧24小时后（第2通道），最低程度降低。HIF-1α及其下游靶点谷氨酸1（在37和75 kDa之间表现为多种亚型）的表达进行比较，以确认生理相关的缺氧水平。此外，微管蛋白水平保持不变，并作为标准来确认细胞蛋白样品的等负荷。
细胞系中Rad51蛋白水平降低，以应对缺氧或铁2+螯合剂DFX，以及在DFX存在下测定Rad51蛋白的稳定性。（A） 进行蛋白质印迹分析以确定暴露于常氧（泳道N）、缺氧（0.5或0.01%O）后MCF-7细胞中HR相关蛋白Rad51的表达2)（通道H）或DFX（250μM）。显示了细胞在每种条件下保持的时间（24或48小时）。HIF-1α和谷氨酸1的表达用于比较，以验证处理细胞中存在生理相关的缺氧水平。请注意，谷氨酸1表现为我们的抗体检测到的几种亚型。Tubulin表达也用于确认相等的样本加载。（B） 正常氧或缺氧暴露48小时后A549、HeLa、SW480和A431细胞中Rad51蛋白表达的Western blot分析（0.01%O2). Tubulin的表达是为了确认HeLa和SW480细胞的样品负载相等，而β-actin被用作A549和A431细胞的负载控制。（C） 缺氧48小时后Rad51蛋白水平的平均降低（0.01%O2)，由重复（RKO、A431、SW480和PC3细胞）或三次（MCF-7、A549和HeLa细胞）缺氧实验产生的Western blot的密度测定分析确定。显示了每个细胞系的起源组织。减少量表示为H/N比值，该比值标准化为β-肌动蛋白和微管蛋白的表达，并给出了每个比值的标准误差。（D） 为了评估Rad51蛋白的稳定性，MCF-7细胞要么暴露于DFX（250μM），要么未经处理24小时，然后与CHX（10μg/ml）混合以阻止新的蛋白合成。（上面板）在添加CHX后的指定时间采集细胞，并通过Western blotting测定Rad51蛋白的表达。HIF-1α的表达证实了化学缺氧的诱导和新蛋白合成的成功取消。此外，微管蛋白水平保持不变，并作为标准来确认细胞蛋白样品的等负荷。（下面板）在暴露于DFX或未经处理的细胞中加入CHX后每个时间点的Rad51蛋白表达分析，如面板C图例中所述进行量化。每个数据点是在指定时间DFX处理或未处理细胞中剩余Rad51蛋白的百分比（归一化为微管蛋白水平后）。
如前所述，我们之前曾报道过MLH1型基因长期暴露于更严重的缺氧环境。基于这一发现以及这些条件与肿瘤中慢性缺氧区域的相关性，我们将MCF-7细胞置于更严重的缺氧（0.01%O2)以确定Rad51蛋白表达是否会有更大的降低。如图所示，暴露于0.01%O中48小时2导致Rad51蛋白表达大幅下降（约六倍）（图。，车道8）。正如预期的那样，Mlh1蛋白表达也下降，但其他几种DNA修复蛋白的表达没有下降，包括Msh2和Msh6（数据未显示）。因此，中度低氧和重度低氧都与细胞内RAD51系列MCF-7细胞中的基因。
低氧状态可以通过使用铁螯合剂DFX在细胞培养中进行模拟，DFX被提议通过抑制血红素-Fe来破坏哺乳动物细胞中的正常氧感应通路2+相互作用(43). 如图所示。MCF-7细胞暴露于DFX 24小时也导致Rad51蛋白表达降低（第10道）。此外，在DFX处理的MCF7细胞中，HIF-1α和Glut1水平增加，证实这种化学处理模拟了气体诱导的缺氧。这些结果表明，Rad51蛋白的表达不仅在真正的缺氧细胞中降低，而且在通过干扰正常细胞的氧感应模拟缺氧的细胞中也降低。
鉴于低氧应激后Rad51蛋白表达的大幅下降可能对肿瘤微环境中的遗传不稳定性产生广泛影响，我们试图确定这种现象是否也可以在来自其他组织的肿瘤细胞系中检测到。在缺氧和常压条件下培养来自不同组织的肿瘤细胞系，然后进行Western blot分析以评估Rad51蛋白水平。如图所示。缺氧48小时后，在包括A549上皮性肺癌细胞系和HeLa宫颈癌细胞系在内的多种人类细胞系中观察到Rad51蛋白表达显著降低。基于三次缺氧实验和β-肌动蛋白或微管蛋白表达的归一化，密度分析用于估算本研究中评估的几个细胞系的H/N蛋白表达比率。如图所示。，A549和MCF-7细胞表现出最高水平的下调，H/N比值分别为−13和−6。综上所述，在许多来源于广泛组织的人类细胞系中观察到Rad51蛋白的显著低氧介导下调。
为了确定观察到的Rad51蛋白表达减少是否可以由蛋白降解增加来解释，MCF-7细胞要么未经处理，要么暴露于DFX，然后与CHX共培养以阻止新的蛋白合成。然后在添加CHX后的不同时间收集细胞，并通过Western blotting测定Rad51蛋白的表达。如图所示。虽然24小时的DFX暴露导致Rad51蛋白表达减少了三倍（比较通道1和6），但在添加CHX后，未经处理的细胞和暴露于DFX的细胞之间的Rad51蛋白稳定性没有显著差异。相反，在DFX存在下，HIF-1α的表达显著增加，并且在添加CHX后，HIF-α迅速降解，证实了化学缺氧的诱导和新蛋白合成的成功取消。此外，微管蛋白水平保持不变，并作为标准来确认细胞蛋白样品的等负荷。这些发现表明低氧介导的RAD51系列基因不发生在翻译后水平。
长时间缺氧导致RAD51系列mRNA表达。
为了确定严重缺氧后观察到的Rad51蛋白表达减少是否也与mRNA水平降低有关，对暴露于0.01%氧气中24小时和48小时后从MCF-7和A549细胞中提取的总RNA进行Northern blot分析2.RAD51系列mRNA水平在48小时时显著降低，MCF-7和A549细胞的h/N比值分别约为−8和−9（图。）。从多个实验中求出比率的平均值，并将其归一化为28S rRNA或β-肌动蛋白信使核糖核酸水平。两种细胞系在24小时时也观察到显著下降。的表达式血管内皮生长因子如图所示，以验证生理水平缺氧的诱导，以及β-肌动蛋白和28S rRNA作为负荷控制。与蛋白表达水平一致，MCF-7细胞暴露于DFX 24小时也会导致RAD51系列mRNA（图。，车道6），这一发现也通过qPCR分析进行了验证（数据未显示）。此外，低氧诱导的RAD51系列在许多其他人类细胞系中观察到mRNA表达，包括SiHa、RKO和DU145（图。; 还有未示出的数据）。这些发现提供了一致的证据，证明缺氧调节RAD51系列mRNA水平的基因。
转录抑制RAD51系列基因缺氧。（A） Northern blot分析在暴露于常氧（N道）、缺氧（0.01%O2)（泳道H）或DFX（250μM）。给出了细胞在每种条件下保持的时间（24或48小时）。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平，并显示28S rRNA的表达以确认相等的样本负荷。（B） Northern印迹分析RAD51系列缺氧24或48小时后A549、SiHa和RKO细胞的mRNA表达（0.01%2).血管内皮生长因子为了进行比较，显示了表达，以验证处理后的细胞中存在与生理相关的缺氧水平。28S rRNA（MCF-7、SiHa和RKO细胞）和β-肌动蛋白mRNA（A549细胞）用于确认样品装载量相等。（C） 评估RAD51系列mRNA，MCF-7细胞未经处理或暴露于DFX（250μM）24小时，然后与ActD（5μg/ml）共培养以阻断转录。在添加ActD后的指定时间采集细胞，并且RAD51系列用Northern印迹法测定mRNA表达。的表达式血管内皮生长因子证实了化学缺氧的诱导和转录的成功取消。此外，28S rRNA水平保持不变，并作为标准，以确认相同的样本加载量。（D） 分析RAD51系列通过Northern印迹的磷光成像仪分析确定，在加入ActD后的每个时间点，暴露于DFX或未经处理的细胞中的mRNA表达。值是RAD51系列每个时间点DFX处理或未处理细胞中残留的mRNA，误差条基于重复实验计算的标准误差。（E） 5′侧翼区域示意图RAD51系列基因，描述用于荧光素酶报告基因分析的启动子片段（pGL3-Rad51p）。核心启动子区域的大致位置如真核启动子数据库（EPD）中所述，并由使用Genomatix启动子识别算法PromoterInspector进行的电子分析确定，以供参考。外显子2上方的弯曲箭头表示ATG翻译起始密码子。（F） 确定缺氧对RAD51系列基因启动子活性，即pGL3-Rad51p荧光素酶（萤火虫）报告质粒在常氧或缺氧暴露前4 h瞬时转染到RKO细胞中（48 h），然后立即测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶值标准化为雷尼利亚共转染pRL-SV40控制载体的荧光素酶活性和误差条基于重复实验计算的标准误差。荧光素酶报告质粒5X-HRE包含五个HRE，分别连接到人类巨细胞病毒最小启动子，其活性显示为确认生理相关缺氧水平的对照。无启动子的荧光素酶报告基因构建体pGL3-Basic的活性也显示为对照。
转录抑制RAD51系列基因缺氧。
接下来，我们试图确定低氧降低稳态水平的机制RAD51系列mRNA。测试可能的影响RAD51系列mRNA稳定性，MCF-7细胞暴露于DFX，然后与ActD共培养以阻断转录。然后在添加ActD后的不同时间收获细胞，并且RAD51系列用Northern印迹法测定mRNA表达。如图所示。，而24小时DFX暴露导致RAD51系列mRNA表达（比较通道1和6），在接触DFX的细胞和未经处理的细胞之间，添加ActD后mRNA稳定性没有观察到显著差异（图。).RAD51系列mRNA半衰期在DFX暴露细胞和未处理细胞中分别约为20和15小时，这些值基于重复的ActD实验。相反，血管内皮生长因子在DFX的存在下，表达显著增加，并且血管内皮生长因子添加ActD后，mRNA迅速降解，证实了化学缺氧的诱导和转录的成功抑制。此外，28S rRNA水平保持不变，并用作确认相等样品装载量的标准。这些数据表明低氧诱导的RAD51系列mRNA表达不能用mRNA稳定性的降低来解释；因此，他们认为调控发生在转录水平。
为了测试RAD51系列缺氧条件下的mRNA依赖于RAD51系列启动子调节，缺氧对RAD51系列用启动子荧光素酶报告系统检测启动子活性。如图所示。，一个1.8kb的片段，来自RAD51系列包含真核启动子数据库中描述的核心启动子区域的基因(30)以及使用Genomatix启动子识别算法PromoterInspector进行的电子分析(44)，已隔离。在常氧或缺氧暴露（48 h）前4 h，将含有该片段的萤火虫荧光素酶报告质粒（pGL3-Rad51p）瞬时转染到RKO细胞中，然后立即测量荧光素酶活性。雷尼利亚来自共转染pRL-SV40控制载体的荧光素酶活性用于归一化。荧光素酶报告质粒5X-HRE包含五个低氧反应元件（HRE），并与人巨细胞病毒最小启动子串联，用作对照，以确认生理相关的低氧水平。如图所示。低氧暴露导致pGL3-Rad51p报告活性的五倍抑制。相反，在缺氧细胞中，5X-HRE报告活性增加了约50倍，在无启动子控制质粒pGL3-Basic中未观察到活性变化。在这些研究中使用RKO细胞是因为它们易于转染，并且因为它们能够支持高水平的RAD51系列启动子活性。RAD51系列MCF-7和A549细胞中的启动子活性也被缺氧抑制，H/N比值分别为−1.8倍和−1.5倍（数据未显示）。综上所述，这些发现表明缺氧会下调RAD51系列基因通过一种涉及转录抑制的机制。
缺氧后Rad51表达持续下调。
考虑到我们在RAD51系列缺氧48小时后，我们试图确定这些变化在复氧后持续的程度。MCF-7细胞暴露于缺氧48小时，随后恢复常压状态数天。在整个时间过程中每隔24小时制备细胞裂解物，并进行Western blot分析以评估低氧暴露期间和之后的Rad51表达水平。有趣的是，我们检测到在缺氧期间Rad51蛋白的最低水平。如图所示。，Rad51水平在复氧后24小时（称为72小时时间点）（通道4）时最低，这些水平直到96小时时间点（通道6）后才恢复到正常的低氧前表达水平，这相当于缺氧后48小时。HIF-1α蛋白在常氧条件下迅速降解，因此在所示的任何缺氧后时间点的复氧后均未检测到该蛋白。此外，我们还观察到，在复氧后，谷氨酸1的表达迅速下降，这是该基因在从低氧向常氧过渡过程中的一种反应。在48小时和72小时的时间点，Rad51蛋白表达水平分别降低了约6倍和12倍，这些值基于三次实验。在较短的24小时缺氧暴露20小时后，也观察到Rad51蛋白表达减少，尽管这些减少并不明显（数据未显示）。此外，在A549细胞的蛋白质水平上也观察到类似的趋势，在复氧后蛋白质水平的恢复速度稍快（图。).
缺氧后Rad51表达持续下调。（A） Western blot分析测定缺氧培养48 h（0.01%O2)（通道H），然后再进行复氧（R），如所示时间线所示。在缺氧后24小时间隔（通道R）采集样本，72、96和120小时的时间点分别代表复氧后24、48和72小时。作为对照，显示Rad51水平在常氧条件下在同一时间段内不会发生变化，显示了每个时间点（通道N）在恒氧条件下平行生长的细胞中的Rad51蛋白表达。显示HIF-1α和Glut1的表达进行比较，以验证在处理的细胞中观察到缺氧和复氧的生理相关状态。Tubulin表达也用于确认相等的样本加载。（B） 进行Northern blot分析以确定RAD51系列MCF-7细胞中的mRNA在相同的时间进程和面板A所述的相同条件下。如所示时间线所示，RAD51系列在缺氧24小时和48小时（通道h）评估mRNA表达。此外，还对缺氧后24小时（R道）的RNA样本进行了分析，72小时和96小时的时间点分别代表24小时和48小时的复氧周期。作为控件显示RAD51系列在同一时期内，在常压下，表达没有变化，RAD51系列在每个时间点（车道N）显示平行生长的正常氧细胞中的mRNA表达。血管内皮生长因子为了进行比较，显示了表达，以验证在处理过的细胞中获得了缺氧和复氧的生理相关状态。28S rRNA的表达也用于确认相等的样本装载量。
Rad51表达减少与细胞周期状况无关。（A） 暴露于缺氧（0.01%O）的四种细胞系的细胞周期谱的定量评估2)或常压48小时。根据三次缺氧实验，使用流式细胞仪分析PI染色细胞和直方图分析软件，将计算出的比例表示为百分比。（B） G中细胞百分比的折叠变化1相和Rad51蛋白水平在缺氧和常压下的比较，如面板A和图。分别是。（C） 半定量RT-PCR分析RAD51系列分离G中mRNA的表达1-正常和缺氧细胞的S期细胞群。通过用重要荧光染料Hoechst 33342对细胞进行DNA染色，然后进行流式细胞术分析和细胞分选，获得相同数量的细胞周期特异性群体。还显示了并行处理的未分类单元格，以供参考（通道1和2）。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证正常和缺氧细胞群中缺氧的生理相关状态，以及β-肌动蛋白用于确认相等的样本加载。（D） A549细胞暴露于常氧或缺氧48小时，以及A549细胞在缺氧后立即复氧指定时间的细胞周期曲线，如基于DNA含量PI染色的直方图所示。G的近似范围1-、S-和G2/M期人群仅供参考。（插图）相应时间点A549细胞中Rad51蛋白的表达。（E） 通过BrdU掺入评估正常氧A549细胞或A549细胞在指定时间复氧后的S期增殖。虚线表示阳性BrdU掺入的阈值，基于在每个时间点未经BrdU孵育的平行分析细胞。每个时间点细胞周期曲线的定量评估显示在每个面板中，并按照面板A图例中的描述进行计算。括号中给出了包含BrdU的每个样本中总细胞的百分比。
Northern杂交分析显示RAD51系列mRNA水平在72小时时也最大程度下降，代表缺氧后24小时（图。，车道6）。此外，来自三个独立实验的mRNA和蛋白表达数据表明，低氧诱导的Rad51蛋白水平下降之前始终是下降的RAD51系列mRNA水平（数据未显示）。正如所料血管内皮生长因子在复氧后迅速降低到无法检测到的水平，从而控制从缺氧到常压的生理转变。综上所述，这些结果表明缺氧会导致RAD51系列mRNA水平，随后Rad51蛋白水平相应降低。重要的是，这些减少在缺氧后复氧阶段最为明显，并在此后的一个重要时期内持续存在。
缺氧介导的RAD51系列基因与细胞周期无关。
RAD51系列mRNA表达水平在S和G中最高2细胞周期的各个阶段，G期最低0和G1，在哺乳动物细胞中(11). 因此，我们试图确定观察到的Rad51表达减少是否可以由缺氧诱导的细胞周期剖面的特定变化来解释。为此，我们使用流式细胞仪分析来确定图中列出的几个人类细胞系的细胞周期曲线。暴露于缺氧条件下。如图所示。在缺氧条件下，所研究的四种细胞系中观察到了一系列细胞周期的变化。我们推断，如果Rad51表达减少可以通过G细胞比例的增加来解释1例如，低氧诱导的G1所评估的细胞系中Rad51表达的位移和H/N比。如图所示。，未观察到此类相关性；MCF7、A549和HeLa细胞的G1-低氧暴露后的相细胞（分别为1.3-、1.2-和1.2倍）仍显示出Rad51表达的实质性（但可变）H/N比率（分别为−6.0、−13.0和−2.9）。相反，A431细胞没有检测到G1缺氧条件下的变化显示H/N表达比率与HeLa细胞相似（-2.4倍）。
为了进一步证实细胞周期的独立性RAD51系列低氧条件下基因表达，G的特定群体1-从常氧和缺氧A549细胞中分离和S期细胞，然后进行分析RAD51系列通过半定量RT-PCR进行mRNA表达。通过使用重要的荧光色素Hoechst 33342对细胞进行DNA染色，然后进行流式细胞仪分析和细胞分选，获得细胞周期相特异性细胞群。最近有报道称，这项技术有助于从细胞周期不同阶段的活细胞中恢复完整的mRNA(20). 如图所示。，大幅减少RAD51系列在两个G组均观察到mRNA表达1-缺氧48小时后的S期细胞（分别为第4和第6通道），h/N比值分别为−3.2和−2.7。这些H/N比值的大小与在并行处理的未分类缺氧细胞中观察到的相似（图。，车道1和2），显示H/N比约为−3.4。血管内皮生长因子显示表达以进行比较，以验证个体常压和缺氧G中缺氧的生理相关状态1-和S期细胞群，以及β-肌动蛋白还提出了确定等样本加载的方法。这些数据直接证明了RAD51系列缺氧引起的基因表达在两个G1细胞周期的S期，因此不能归因于细胞周期剖面的变化。
根据碘化丙啶（PI）对DNA含量的分析和溴脱氧尿苷（BrdU）掺入技术评估S期增殖率，在缺氧-复氧期还观察到细胞周期相与Rad51表达降低之间缺乏相关性。如图所示。，A549细胞在S和G细胞中的比例显著增加2/缺氧24小时后观察到M期（分别为58%和12%），但这些细胞中的Rad51水平持续下降。此外，细胞明显进入S期，并在缺氧后早期进行DNA复制，此时Rad51的表达保持在最低水平。例如，缺氧后3小时和24小时的S期增殖率分别为25%和46%（图。). 总之，这些数据表明缺氧后A549细胞恢复S期复制并进入G期2/细胞周期的M期仍然显示Rad51蛋白表达显著下降，进一步表明Rad51的下调不受G期细胞比例的控制1或S期，并证明细胞增殖和DNA修复基因表达之间不耦合。综合来看，这些发现提供了强有力的证据，证明RAD51系列基因表达比细胞周期相依赖性更具缺氧特异性。
Rad51表达减少与HIF表达无关。
HIF蛋白家族已被证明可以调节许多基因的表达，这些基因在血管生成、糖酵解、侵袭和缺氧转移中发挥作用(17). 最近还证明HIF-1α可以诱导转录阻遏物的表达，如DEC1，我们的微阵列分析显示该基因是由缺氧诱导的（图。). 因此，我们测试了缺氧诱导的RAD51表达下降是否可能由HIF-1α或HIF-2α介导。HIF蛋白在正常氧张力下高度不稳定，因为HIF-1α和HIF-2α通过与von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白（pVHL）的相互作用而泛素化，随后在正常氧条件下被26S蛋白酶体降解(19). pVHL缺陷细胞系786-0特异性地过度表达HIF-2α，从而过度表达HIF-2α下游靶基因，包括葡萄糖转运蛋白1和血管内皮生长因子(24). VHL cDNA在这些细胞中的表达恢复了HIF-2α的正常毒性调节。因此，我们检测了用VHL cDNA或空载体补充的786-0细胞中Rad51蛋白的表达。如图所示。，Rad51的表达不受VHL状态或HIF-2α表达的影响。VHL和谷氨酸-1蛋白的表达分别证实了这两种细胞系中的VHL状态和构成性缺氧表型。Northern印迹法也显示稳态下无差异RAD51系列VHL突变体和野生型细胞之间的mRNA水平（数据未显示）。有趣的是，表达野生型或突变VHL的786-0细胞暴露于低氧环境下，导致Rad51表达的类似减少（图。). 综上所述，这些数据表明低氧介导的Rad51表达下调独立于HIF-2α发生。这也表明下调不需要HIF-1α的表达，因为786-0细胞缺乏HIF-1β的表达(19). 作为评估HIF-1α在低氧调节Rad51表达中作用的另一种方法，我们在正常毒性HeLa细胞中短暂过度表达全长HIF-1 acDNA。图表明HIF-1α的外源性过度表达与Rad51的表达降低无关。总的来说，这些数据表明低氧诱导的RAD51系列基因表达不受HIF依赖性途径介导。
Rad51表达减少与HIF表达无关。（A） Western blot分析用于测定表达野生型（+VHL）或突变型（−VHL）VHL基因的对数期786-0细胞中Rad51蛋白的表达。显示VHL和谷氨酸1的表达以进行比较，以验证这些细胞的状态。还提出了微管蛋白表达，以确认相同的样品负载。（B） 缺氧后表达野生型或突变VHL的786-0细胞中Rad51蛋白表达的Western blot分析（0.01%O2)（C）转染HIF-1α表达载体pCEP4-HIF-1α48 h后，Western blot分析HeLa细胞中Rad51和HIF-1β的表达水平。
缺氧和缺氧后细胞HR降低。
接下来，我们试图确定低氧诱导的Rad51蛋白表达减少是否与HR功能性降低相关。我们利用穿梭载体重组试验，将含有突变报告基因和野生型供体片段的质粒瞬时转染到暴露于常氧或缺氧的MCF-7细胞中，以评估HR的频率supFG1（支持FG1）琥珀色抑制tRNA基因，supFG1（支持FG1）-144，用作重组底物。包含野生型的同源片段supFG1（支持FG1）该基因被用作重组供体。的功能supFG1（支持FG1）通过从MCF-7细胞中回收外体穿梭载体质粒，然后转化为携带琥珀色终止密码子的指示细菌，可以检测该基因lacZ公司基因。以这种方式，supFG1（支持FG1）-144例报告了导致基因恢复到蓝/白菌落筛查中检测到的功能序列的重组事件(5). 该报告系统的示意图如图所示。供参考。该测定的重要特征是载体复制和重组独立于细胞周期，我们实验室先前的研究已经提供了证据，证明该测定中的重组事件依赖于Rad51(8).
缺氧和缺氧后细胞HR降低。（A） 用于评估HR的穿梭载体质粒和供体DNA片段示意图。质粒pSupFG1/G144C包含一个supFG1（支持FG1）在144位发生失活G:C-C:G点突变的基因。供体是一个含有部分野生型的同源DNA片段supFG1（支持FG1）基因。缩写：amp第页氨苄西林耐药基因；WT，野生型。（B） 与穿梭载体和供体片段共同转染的MCF-7细胞中的重组频率，然后在常氧条件下（72小时）或缺氧条件下（0.01%O）培养2)48小时后立即复氧，24小时常氧（缺氧+缺氧后）。括号中给出了每个样本中的蓝色菌落总数/菌落总数。误差条基于重复实验计算的标准误差。（C） 与穿梭载体和供体片段共同转染的MCF-7细胞在常氧或缺氧（0.01%O2)（缺氧后）。
如图所示。在缺氧暴露前（48小时），将穿梭载体和野生型片段共同转染到MCF-7细胞，然后在缺氧24小时后恢复质粒，结果表明，缺氧细胞中的重组频率比在相同总时间内常压培养的MCF-7电池中的重组频率降低了约3倍。有趣的是，当细胞在缺氧后转染时，我们观察到HR频率显著降低。图结果表明，在缺氧（48小时）后立即将穿梭载体和供体片段转染到MCF-7细胞中，HR几乎降低了五倍，这与在整个正常氧条件下观察到的细胞频率有关。因此，观察到的HR下降与低氧和缺氧后Rad51蛋白表达的变化平行。综上所述，这些数据提供了证据，表明低氧导致的Rad51表达减少与低氧暴露后48小时内细胞在低氧期间和之后进行HR的能力大幅延长相关。
宫颈癌和前列腺癌异种移植物中缺氧和Rad51表达之间的负相关。
接下来，我们试图确定是否可以在体内肿瘤微环境中检测到低氧诱导的Rad51表达减少。为此，从PC3、Me180和SiHa6细胞系中生成小鼠前列腺癌和宫颈癌异种移植瘤。这些细胞株在培养中均表现出低氧诱导的Rad51表达减少（图。和; 数据也未显示）。通过免疫荧光分析肿瘤组织切片中Rad51的表达，并用低氧标记物EF5染色。EF5与细胞大分子的结合是细胞硝酸还原酶进行低氧依赖性生物还原的结果，因此可用于检测实体肿瘤中的低氧(10). 如图所示。，我们在所有三种细胞系的异种移植物中检测到Rad51蛋白表达和EF5染色之间的反向关联。根据Eppendorf pO测定，所有肿瘤均含有缺氧区域2取下探针进行免疫染色（数据未显示）(9). 这种反向关联沿着图1所示的Me180宫颈异种移植物的切片的上边界特别显著。其中Rad51的表达在强EF5染色区域内显著降低。在合并的图像中，Rad51表达式和EF5绑定的重叠显示了大部分部分的最小重叠（图。). 图也证明了PC3和SiHa6异种移植物中Rad51表达和EF5染色之间的一致反向关联。总之，这些发现表明肿瘤微环境中的缺氧与Rad51表达降低有关；因此，他们将我们的体外观察扩展到肿瘤的体内情况。
宫颈癌和前列腺癌异种移植物中缺氧标记物染色和Rad51表达之间的反向关联。所示为用低氧标记物EF5（红色）和Rad51表达（绿色）对来自Me180宫颈癌细胞（A）、PC3前列腺癌细胞（B）和SiHa6宫颈癌细胞的肿瘤异种移植物进行染色的免疫荧光分析。单独的EF5、Rad51和DAPI染色（蓝色）以及Rad51-EF5合并染色（黄色）如面板A所示。面板A中的箭头表示在强EF5染色区域内Rad51表达显著降低。
讨论
在本研究中，我们已经证明缺氧特异性地下调RAD51系列在体外细胞培养和体内肿瘤微环境中，HR的关键介质。在缺氧暴露期间和缺氧暴露后，多种细胞类型的Rad51表达均显著降低，其调节机制似乎与细胞周期和HIF表达无关。对蛋白质稳定性、mRNA稳定性和启动子活性的分析表明，缺氧调节RAD51系列通过涉及转录抑制的机制进行基因表达。我们检测到缺氧应激期间和缺氧应激后细胞的HR降低，表明缺氧对Rad51表达的下调对DNA修复具有功能性后果。这些发现扩展到肿瘤微环境；我们检测到Rad51在宫颈和前列腺肿瘤异种移植物的缺氧区域中的表达降低。总之，我们提出了一种通过低氧诱导抑制HR通路介导的肿瘤微环境中遗传不稳定性的新机制。
在最近一篇关于遗传不稳定性和肿瘤发生的综述中，Loeb及其同事提出了一种范式转变，认为哺乳动物细胞中的DNA修复途径受到调控(23). 传统观点认为，DNA修复基因是在细胞中组成性表达的，因此当外源性损伤或内源性过程（如复制错误或氧化代谢）引起新的DNA损伤损伤时，它们可能随时可用。癌症中这些通路的失活被认为主要是通过基因突变或启动子甲基化沉默而发生的，从而导致不可逆的突变表型。然而，最近的研究支持了这样一个概念，即基因不稳定性可能是由DNA修复途径的失调而非完全失活引起的(13). 我们的结果与这种范式转变相一致，因为我们检测到Rad51表达的实质性但可逆的低氧诱导减少，这与重组修复的重大功能后果有关。
维持遗传稳定性的HR途径。
尽管进行了广泛的研究，但很少有报道描述RAD51系列人类肿瘤中的基因(18). 然而，最近的研究表明，一种显性负性形式的RAD51系列基因(dnRAD51型)而非野生型与中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的致瘤性增加有关(1)，表明RAD51系列确实起到了抑癌作用。此外，最近的研究表明巴西航空公司1，一个有充分证明的肿瘤抑制剂(41)，可能专门用于促进高保真度HR，同时抑制容易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径(49). 沿着这些思路，一些报告已经证明，在HR受损的情况下，NHEJ修复活动上调，反之亦然(39). 因此BRCA1-RAD51型该通路可能代表了一个肿瘤抑制轴，其中基因组的完整性通过高保真的HR介导的修复来维持。就继承的情况而言巴西航空公司1缺乏，低氧诱导获得性减少RAD51系列因此，通过改变HR和NHEJ之间的平衡，可能导致遗传不稳定。我们目前正在进一步详细调查这种可能性。
缺氧、DNA损伤和遗传不稳定性。
如前所述，缺氧与多种多样的DNA损伤和基因畸变有关。特别是，低氧再氧循环与氧化应激和活性氧的产生有关，这被认为会导致高水平的单链断裂和双链断裂。研究表明，短时间缺氧后的复氧可导致高水平的DNA损伤（以双链断裂的形式），与暴露于4-5 Gy电离辐射（IR）后观察到的损伤相当(15). 尽管低氧暴露后可能会出现大量DNA链断裂，但令人惊讶的是，我们在同一时间段内观察到Rad51的表达显著下降，因为Rad51是负责此类DNA损伤无错误修复的通路中的中心蛋白。此外，研究表明，Rad51是哺乳动物细胞正常S期进展所必需的，因为Rad51在解决停滞和崩溃复制叉中的作用(36). 因此，缺氧后细胞在Rad51表达降低的情况下恢复DNA复制的发现表明，缺氧诱导的Rad51下调可能对肿瘤微环境中的基因组完整性产生重大影响。增殖和Rad51表达的这种解耦可能在肿瘤区域中特别重要，这些区域经历了波动灌注，因此反复缺氧循环，然后再复氧。缺氧本身已被证明会导致S期阻滞，这种阻滞在复氧后是可逆的，可能与停滞的复制叉有关(14,16). 在这种情况下，低氧诱导的Rad51表达减少将再次对肿瘤细胞维持基因组完整性的能力产生重大影响。
DNA修复基因表达的调控。
本研究的微阵列数据进一步证明，在准确表征与缺氧相关的基因表达谱方面，缺氧对特定基因的下调与上调同样重要。这里的数据表明，低氧诱导的Rad51表达减少是通过HIF-非依赖性途径发生的，该途径涉及转录抑制RAD51系列发起人。对HR通路相关基因启动子的初步分析揭示了调控元件的复杂图景，其中许多元件在小鼠和人类中似乎是保守的(18). 有趣的是RAD51系列该转录本包含一个未翻译的第一外显子（图。)提示mRNA水平的基因调控。而5′调控区RAD51系列该基因含有富含CpG的区域，但缺乏TATA盒（许多家政基因中的典型排列），最近的分析表明该基因的核心启动子区域中存在许多潜在的调控元件(18). 在Levy-Lahad等人的一项研究中，未翻译的RAD51系列基因与乳腺癌风险增加相关巴西航空公司2突变携带者(21). 这些分析强烈表明RAD51系列可能受特定启动子元件的调节以响应各种刺激，它们代表了肿瘤发生和肿瘤微环境中的潜在失调位点。
癌症治疗的意义。
已经证实，由于氧介导的自由基损伤的增强作用减弱，缺氧细胞比氧合良好的细胞对IR的抵抗力更强，许多研究已定量地将肿瘤氧合与放射治疗反应联系起来(32). 然而，有趣的是，也有报道称，在缺氧后立即在常压条件下照射的细胞实际上比未经缺氧预处理的细胞对辐射更敏感(50). 当时，这种敏感性的潜在机制尚不清楚。在许多细胞系中观察到了这种现象，包括本研究中使用的两种细胞系，HeLa和A431细胞。有趣的是，含有失活HR成分的细胞对DNA损伤剂（包括IR）表现出超敏反应(38). 具体地说，一些研究已经证明，在许多细胞类型中，Rad51表达下调与放射敏感性增加之间存在关联(28). 我们认为，本文报道的低氧后Rad51表达持续下降可能是低氧后相关放射敏感性现象的部分原因。这些发现表明，缺氧后持续的基因表达变化可能会显著影响癌细胞对治疗的反应。每日分割放射治疗被认为优先杀死氧合细胞并促进先前缺氧细胞的复氧。因此，缺氧后立即复氧的细胞的额外敏感性（可能是由于RAD51系列其他DNA修复基因的表达和失调）可能为分次放射治疗的疗效提供依据。
目前已有大量证据表明肿瘤缺氧与侵袭性肿瘤表型的发展有关。最近的研究进一步阐明了这种联系，结果发现缺氧上调了许多参与侵袭和转移的基因(37). 我们和其他人已经证明肿瘤微环境有助于遗传不稳定性和肿瘤进展，本研究中的数据为这一现象提供了机制基础。此外，Rad51的失调也可能在肿瘤细胞间的DNA损伤反应中产生异质性，这可能与癌症治疗反应有关。
