ΔN-Plakoglobin对表皮生长和分化的β-连环蛋白依赖性和非依赖性影响

培养角质形成细胞并转染。

Pam212角质形成细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（Gibco BRL，Life Technologies s.A.，Cergy Pontoise，France）中生长，补充10%胎牛血清（Seromed，Biochrom KG，Berlin，Germany），2 mM我-谷氨酰胺（Gibco BRL）和青霉素-链霉素（Gibco BRL）。

根据制造商的说明，使用Geneporter试剂（加州圣地亚哥Gene Therapy Systems Inc.）进行瞬时转染实验。细胞以5×10的密度分裂成24孔培养皿⁴细胞/孔。48小时后，用125 ng的pTOPtk荧光素酶（TOPFLASH）或pFOPtk荧光素酶（FOPFLASH）转染细胞，62.5 ng的雷尼利亚报告人构建（威斯康星州麦迪逊市普罗米加），62.5 ng Lef-1，125 ngΔN57-β-catenin(43)质粒，并且当指示时，具有62.5、125或250ng的ΔN122-PG或全长广场球蛋白质粒。

培养48小时后，将细胞刮入100μl被动裂解缓冲液（Promega）/孔中，在两个冻融循环后，通过10000×克在Lumat 9501光度计（德国普福尔哲姆Berthold）中，使用萤火虫和雷尼利亚基板（Promega）。萤火虫荧光素酶的值通过使用雷尼利亚荧光素酶活性。每种情况下至少进行三次独立实验，一式三份。

全贴装皮肤染色。

将6个月大的雄性野生型和转基因小鼠的爪子皮片铺在显微镜载玻片上，在Methacarn（60%甲醇、30%氯仿、10%乙酸）中固定过夜，再水化，并用胭脂红明矾染色数天。样品脱水并在二甲苯中清除以进行观察。

BrdU掺入分析、组织学和免疫染色。

为了评估细胞增殖，小鼠在处死前2 h腹腔内注射0.25 mg 5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）/g体重。根据制造商的说明，使用细胞增殖试剂盒（Amersham）对皮肤切片进行核BrdU检测。

皮肤样品用4%的多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲盐水或甲叉戟烷中，并处理后包埋在石蜡中。为了进行组织学分析和免疫组化，切下7μm的切片。对于免疫组织化学，切片在1%H中孵育₂O（运行）₂阻断内源性过氧化物酶活性。为了提取石蜡包埋皮肤切片上的核抗原，将载玻片在90°C、pH 6.0的10 mM柠檬酸钠缓冲液中培养10分钟。

从Tissue-Tek（印第安纳州埃尔克哈特Miles Diagnostic Division，Elkhart）中嵌入的皮肤切片上切下冷冻切片（7μm），并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。染色前，冷冻切片在−20°C的丙酮中固定10分钟。

将皮肤切片在5%胎牛血清中孵育60分钟，然后用一级抗体孵育过夜，并在室温下用适当的二级抗体孵育2小时。细胞核用每毫升1μg DAPI（4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚）（Sigma）染色用于免疫荧光研究，或用苏木精复染用于免疫组织化学。

德克萨斯州红荧光素异硫氰酸盐（1:100；Jackson Immunoresearch Laboratories）或AlexaFluor（1:1000；分子探针）结合二级抗体用于免疫荧光标记，Envision⁺系统HRP试剂盒（Dako）用于免疫组化。

用石蜡包埋的组织样品进行核β-连环蛋白、斑球蛋白、HA-tag、c-Myc和Engrailed-1的免疫组织化学检测；用甲硫氨酸固定石蜡包埋组织检测C/EBPβ、BrdU和cyclin D1，并要求抗原回收。所有抗角蛋白抗体均用于冷冻切片或石蜡包埋切片；在冰冻切片上使用抗E-钙粘蛋白和抗esmoplakin。

RNA分离、cDNA阵列和实时逆转录（RT）-PCR。

用RNA-Plus试剂从冷冻的小鼠背部刮毛皮肤片中分离出总RNA（法国蒙特勒苏斯-博伊斯生物探针系统公司）。根据制造商的说明，使用信号转导通路探测器基因阵列（SuperArray Inc.，Bethesda，Md.），通过cDNA阵列技术分析了五个微图RNA样本。使用荧光成像仪（分子动力学）和ImageQuant程序对结果进行定量分析。

对于实时RT-PCR，将c-Myc mRNA的水平标准化为GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）的水平。使用以下引物：小鼠c-Myc、CAC CAG CGA CTC TGA和CCC GAC TCC GAC CTC TTG；针对GAPDH、CCA ATG TGT CCG TCG TGG ATC和GTT GAA GTC GCA GGA GAC AAC。

透射电子显微镜。

将皮肤样本固定在磷酸盐缓冲盐水中的2%戊二醛中，然后将2%戊二酸固定在0.1 M二羧酸钠中（pH 7.4），用0.1 M二氯酸钠清洗（pH 7.4.），用1%OsO固定₄在0.15 M碳酸钠-HCl（pH 7.4）中，在分级系列乙醇和环氧丙烷溶液中脱水，并嵌入Araldite树脂中。用Ultracut设备（Reichert Jung）制备超薄（60-80nm）切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行对比染色，并用透射电子显微镜（LEO 912）进行观察。

蛋白质分析。

对于Western印迹，刮干净的背部皮肤片（2至3厘米²)将野生型和转基因小鼠置于液氮中速冻，均质，并在Laemmli的样品缓冲液中煮沸。上清液在10%丙烯酰胺凝胶中进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P；Millipore），并用抗体进行检测。使用ECL检测系统（Amersham）开发免疫印迹。为了检测E-钙粘蛋白和连环蛋白的亚细胞分布，将2个月大小鼠的皮肤样本均质化，并用1ml 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、含有100 mM NaCl、2 mM Ca2Cl、1%NP-40、1%Triton X-100、2 mM-苯甲基磺酰基氟化物和20μg抑肽酶的缓冲液每ml提取，在15000×克温度为4°C。为了提取不溶于洗涤剂的部分，将颗粒放在0.5 ml莱姆利样品缓冲液中煮沸。通过Western blotting分析洗涤剂可溶性蛋白质组分（0.1 mg）和同等数量的洗涤剂不溶性组分。对于免疫沉淀，使用0.5 mg洗涤剂-可溶性组分。

ΔN122-PG的表达诱导滤泡间表皮增生。

K5启动子驱动的ΔN122-PG的表达导致表皮增厚，特别是在尾巴、枪口和背爪表面观察到（图。​（图22和​和3）。三). 在野生型皮肤中，K6仅在毛囊中检测到，而K5-ΔN122-PG小鼠表皮中的大多数基底细胞对K6呈阳性染色（图。​（图3A）。3A级). 表皮分化不受转基因产物的影响，因为K10在基底层上被检测到（图。​（图3A），3A级)，另外两个终末分化标记物-loricrin和fillagrin在表皮的上层表达（数据未显示）。在K5-ΔN122-PG小鼠的表皮基底层滤泡间区发现BrdU结合细胞的病灶，表明其增殖率很高（图。​（图3B）。第3页). 在K5-ΔN122-PG表皮滤泡间带的基底角质形成细胞中发现了含有细胞周期蛋白D1阳性细胞核的大细胞簇。在野生型皮肤中检测到的细胞周期蛋白D1阳性细胞核少得多（图。​（图3C）。3C公司). 与野生型动物相比，K5-ΔN122-PG小鼠皮肤蛋白提取物中的细胞周期蛋白D1含量始终较高（图。​（图3D三维).

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图3。

K5-ΔN122-PG小鼠表皮的增生。（A） 对6个月龄小鼠背部爪子皮肤进行连续冷冻切片。在野生型皮肤中，K5表达于基底层，K10表达于基底上棘层，而K6仅限于毛囊，表皮中不存在。在K5-ΔN122-PG皮肤（第44行）中，K6在基底层角质形成细胞中表达，而K5和K10分别在基底层和基底层上角质形成细胞中正常表达。用抗HA-tag抗体在基底细胞中检测到转基因产物。hf，毛囊。面板A和C中的虚线表示基底膜的位置。（B） 野生型和K5-ΔN122-PG（品系12）6月龄雄性小鼠尾部表皮BrdU-incoming细胞的免疫组织化学。（C） 免疫荧光染色分析cyclin D1（Cyc D1）在野生型和K5-ΔN122-PG（品系12）6月龄雄性小鼠尾部表皮的分布。注意，在转基因小鼠皮肤中经常观察到含有核细胞周期蛋白D1的基底角质形成细胞簇。（D） cyclin D1在野生型和K5-ΔN122-PG小鼠皮肤中的表达。使用抗细胞周期素D1抗体对2只野生型和3只K5-ΔN122-PG（品系12）3个月龄雄性小鼠的皮肤蛋白提取物进行Western blot分析。去除印迹并用抗-HA-抗体重制，以确定转基因产品水平，并用抗K5抗体作为负荷控制。棒材=50μm（A）和25μm（B和C）。WT，野生型。

ΔN122-PG的表达诱导毛囊增生和真皮囊肿。

在K5-ΔN122-PG皮肤中，从先前存在的毛囊的外根鞘和表皮形成了新的毛囊芽（图。2C和D和图。4A和B). 在异常毛囊的最外层细胞层中用抗-HA抗体检测到转基因产物（图。​（图4A）。4A级). 增生的毛囊被连续的基底膜包围，并用抗层粘连蛋白抗体染色（图。​（图4B）。4B类). 异常毛囊周围的基底膜通常增厚，并含有未经处理的γ2-层粘连蛋白链，该链未沉积在野生型皮肤的基底膜中（数据未显示）。

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图4。

K5-ΔN122-PG转基因小鼠皮肤毛囊增生。（A） 用抗HA-tag对K5-ΔN122-PG 6月龄雄性小鼠（第12行）的背爪皮肤冷冻切片进行双重免疫荧光染色，显示ΔN122-PG和抗E-cadherin抗体。转基因产物存在于异常毛囊的外层细胞层。注意扩张的毛囊，大量异常的毛胚，以及由先前存在的毛囊形成的毛囊。（B） 抗层粘连蛋白抗体染色K5-ΔN122-PG 6个月大雄性小鼠（12系）足背皮肤增生毛囊周围的基底膜。（C） En1在野生型和K5-ΔN122-PG（第51行）皮肤中的表达。用免疫组织化学方法对含有石蜡的石蜡包埋皮肤样品进行检测。野生型小鼠背部皮肤切片，显示生长期（a）和休止期（b）的毛囊。En1仅在毛囊的低周期部分发现。在K5-ΔN122-PG小鼠尾部皮肤（c）中，在异常毛囊中检测到大量En1-阳性细胞。含有异位皮脂细胞的头发细菌和肿瘤没有En1染色。（D和E）K5-ΔN122-PG转基因小鼠皮肤中的皮肤囊肿（第44行）。在K5-ΔN122-PG小鼠（D）背爪皮肤的卵泡囊肿中，许多细胞被抗毛囊角蛋白抗体AE13（绿色）染色。K1（红色）是早期表皮角质形成细胞终末分化标志物，未检测到。DAPI染色显示为蓝色。在K5-ΔN122-PG小鼠口吻皮肤表皮样囊肿中，外壁层细胞表达K5（绿色），而最内层细胞表达K10（红色）。c、 囊肿；dhf，毛囊扩张；ec，表皮样囊肿；表皮；fc，滤泡囊肿；hhf，增生性毛囊；hg，毛囊胚；m、 矩阵；前皮质；s、 皮脂细胞。棒材=50μm（A、B、c、D和E的框架A和c）和25μm（c、框架B）。

cDNA微阵列分析显示En1的mRNA水平果蝇属在所有测试的K5-ΔN122-PG皮肤样本中，基因工程转录因子均较高。在野生型动物中，En1主要存在于毛囊的下部循环部分，在皮质前细胞和基质细胞中具有特别强的信号（图。​（图4C，4摄氏度，框架a和b）。在K5-ΔN122-PG小鼠中，增大的毛囊和毛囊囊肿样结构含有大量En1阳性细胞（图。​（图4C，4摄氏度，框架c）。增生组织中En1的表达表明其可能来源于毛囊下部。与这一观点一致，在表皮形成的异常毛胚和皮脂细胞增生的毛囊中很少或没有检测到En1染色（图。​（图4C，4摄氏度，框架c）。

最后，许多多层真皮囊肿有助于皮肤体积的增加。其中一些囊肿用识别毛发特异性细胞角蛋白的AE13抗体染色（图。​（图4D），4D（四维）)而其他人表达表皮分化标记（图。​（图4E第4页).

ΔN122-PG在转基因小鼠皮肤中的定位。

为了通过ΔN122-PG表达评估β-catenin信号的可能激活，我们分析了ΔN22-PG和β-catentin在K5-ΔN122-PG小鼠皮肤中的细胞内分布。在表皮中，ΔN122-PG位于细胞-细胞边界，其分布与结蛋白相关（图。​（图5A），5A级)表明转基因产物位于桥粒中。在K5-ΔN122-PG小鼠的表皮基底细胞层中仅检测到少数HA-tag阳性细胞核（数据未显示）。

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图5：。

转基因产物在K5-ΔN122-PG皮肤中的细胞内分布。（A） 共焦显微镜下，通过K5-ΔN122-PG小鼠（第12行）表皮，用抗结蛋白（DP）和抗HA-tag抗体对冷冻切片进行双重免疫荧光染色，以检测ΔN122-PG。在表皮中，在与结蛋白共定位的细胞-细胞边界处发现ΔN22-PG。虚线表示基底膜的位置。（B和C）通过K5-ΔN122-PG小鼠背爪皮肤毛囊肿瘤对石蜡包埋切片进行双重免疫荧光染色（第12行）。B组显示用抗体标记斑球蛋白的C末端部分，显示内源性蛋白和转基因产物，并用抗体标记HA-tag，检测ΔN122-PG。在K5启动子不活跃的内层细胞中，仅用抗斑球蛋白抗体染色细胞-细胞边界，而这两种抗体都染色了基底细胞层的大量细胞核。箭头表示斑球蛋白和HA-tag阳性细胞核。注意，只有HA-阳性细胞核用抗血小板球蛋白抗体染色。C组显示用抗β-连环蛋白和抗HA-tag抗体标记。箭头表示细胞核被β-catenin强烈染色。DAPI染色细胞核。棒材=5μm（A）和12μm（B和C）。

在K5-ΔN122-PG皮肤形成的增生性毛囊中，在细胞-细胞边界和外（基底）细胞层的细胞核中观察到HA-tag染色（图。​（图5B）。第5页). β-连环蛋白也存在于许多基底细胞的细胞核中（图。​（图5C），5摄氏度)表明ΔN122-PG的表达导致β-catenin的稳定和核转位。

在β-catenin-null表皮中，ΔN122-PG不诱导新毛胚的形成，而是恢复分化。

表皮中ΔN122-PG表达的观察到的影响可能完全归因于β-catenin，由于转基因产物的存在，β-catentin在细胞核中稳定并积累，或者至少部分归因于ΔN122-PG通过Lef/Tcf或其他因素激活转录的内在能力。为了检验这些可能性，我们将ΔN122-PG引入β-catenin-null表皮（小鼠称为K14-βcat^−/−-K5-ΔN122-PG）。

K14-βcat的表型特征^−/−-表中总结了K5-ΔN122-PG小鼠​表1。1K5启动子驱动的ΔN122-PG在显示β-catenin基因条件性失活的小鼠中的表达增加了存活率，在2个月的观察期内，11只K14-βcat中有6只^−/−小鼠和8只K14-β猫中只有1只^−/−-K5-ΔN122-PG小鼠死亡。K14-βcat^−/−小白鼠的体重比野生型同窝小白鼠轻30%至60%，眼睛只部分睁开，可能是由于眼睑表皮的缺陷。相比之下，八种K14-βcat中有六种^−/−-K5-ΔN122-PG小鼠仅比野生型小鼠小10%至15%，眼睑大体正常。然而，像K14-βcat^−/−小鼠，K14-β猫^−/−-K5-ΔN122-PG窝友出现脱发。

对2个月龄和6个月龄小鼠皮肤样本的组织学分析证实，β-catenin-null表皮中ΔN122-PG的表达既没有诱导正常的毛囊循环，也没有导致在K5-ΔN122-PG小鼠皮肤中检测到的新的毛胚或毛囊肿瘤的形成（图。​（图6A）。6A级). 这些结果表明，β-连环蛋白介导的事件而非固有的血小板球蛋白信号活动诱导了K5-ΔN122-PG小鼠的皮肤损伤。

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图6：。

通过野生型和突变型（K14-βcat）部分恢复表达ΔN122-PG.（A）的β-catenin-null表皮的分化^−/−和K14-βcat^−/−-K5-ΔN122-PG）1个月龄雄性小鼠背部皮肤用苏木精和伊红染色。注意K14-βcat表皮异常增厚^−/−小鼠皮肤与K14-β猫表皮结构的改善^−/−-K5-ΔN122-PG小鼠。在野生型皮肤中，毛囊处于生长期，而在突变小鼠皮肤中，毛囊循环停止。（B） 野生型和突变型（K14-βcat）中增殖和分化标记的表达^−/−和K14-βcat^−/−-K5-ΔN122-PG）小鼠表皮。从1个月大的小鼠身上切下甲硫氨酸固定石蜡包埋的背部皮肤。注意，β-catenin-null表皮中ΔN122-PG的表达降低了增殖和K6和K14的表达，恢复了K10的表达以及表皮基底层中C/EBPβ的核定位。箭头表示β-catenin-null表皮基底层上的BrdU阳性细胞核。（C） C-Myc在野生型和突变2个月龄小鼠表皮中的表达。含副甲醛的石蜡包埋背部皮肤部分。在K14-βcat中，核c-Myc染色可见大量基底和基底上角质形成细胞^−/−-K5-ΔN122-PG皮肤。箭头表示c-Myc阳性细胞核。棒材=60μm（A）和15μm（B和C）。WT，野生型。

在幼年动物中，发现β-catenin-null表皮异常厚且过度增殖(23). 在4-5个月大的动物中，这种表型不太明显。由于早期一篇描述β-catenin-null皮肤表型的论文侧重于毛囊缺陷，因此在本研究中，我们更详细地检查了滤泡间β-catentin-null表皮。在β-catenin-null表皮中，基底层和基底层上存在增殖细胞，而在所有细胞层中都观察到基底细胞K14和K6的染色，这是一种过度增殖标记（图。​（图6B）。6亿). 此外，在K14-βcat的表皮中发现了许多缺乏K10的区域，K10是角质形成细胞终末分化的标志^−/−鼠标（图。​（图6B）。6亿). 转录因子C/EBPβ调节K10的表达(29,50)，我们比较了C/EBPβ在突变型和野生型表皮中的分布。在野生型皮肤中，C/EBPβ集中在基底层和一些基底层上角质形成细胞的细胞核中，而在β-catenin-null表皮中，抗C/EBP？抗体还染色了所有细胞层的细胞质（图。​（图6B）。6亿). 这种异常的细胞内定位表明，β-catenin-null表皮中C/EBPβ的激活可能受损。

在K14-βcat中^−/−-K5-ΔN122-PG表皮、BrdU掺入细胞多见于基底层。表皮上层K6和K5或K14的表达下调，而K10的表达恢复正常；C/EBPβ的细胞内分布与在野生型皮肤中观察到的非常相似，C/EBPα主要存在于基底上细胞的细胞核中（图。​（图6B）。6亿). 因此，ΔN122-PG的表达显著恢复了β-catenin-null滤泡间表皮的分化。

ΔN122-PG的表达导致β-catenin-null表皮c-Myc上调。

c-Myc，显示在一些过度表达广场球蛋白的细胞中被激活(27)也是表皮角质形成细胞分化的重要调节因子(4,16,17,48). 因此，我们通过实时RT-PCR检测了ΔN122-PG对表皮c-Myc表达的影响。野生型表皮中ΔN122-PG的表达和β-catenin基因的失活并没有改变c-Myc mRNA水平。相反，在K14-βcat中^−/−-K5-ΔN122-PG表皮、c-Myc水平高出两倍（表​（表2）。2). 1-2个月龄K14-β猫的免疫荧光分析^−/−-使用抗c-Myc抗体的K5-ΔN122-PG小鼠皮肤切片在许多基底层和基底层上的角质形成细胞中检测到核c-Myc，而在β-catenin-null表皮中仅观察到弱扩散染色和罕见的c-Myc阳性核（图。​（图6C6摄氏度).

我们感谢Avri Ben-Ze'ev鼓励我们在体内研究斑球蛋白的信号功能，并就原稿提出建议。我们特别感谢C.Goujet和维勒朱夫动物与转基因实验服务中心的工作人员，特别是R.Duchteau和A.Loeuillet，他们照顾了转基因小鼠。我们还感谢J.L.Jorcano提供K5启动子构建物，感谢T.T.Sun和H.Clevers捐赠试剂。我们感谢F.Gaill和M.J.P.Lechaire进行了透射电子显微镜检查，并感谢M.A.Deugnier和D.Medina进行了宝贵的讨论。

这项工作得到了癌症研究协会（ARC 4440）的支持，以及法国Recherche部长2001年的ACI拨款。J.T.得到了癌症研究协会的资助。M.M.F.是皇家医学院院长，M.A.G.是医学研究院院长。