美国国家科学院程序。2004年8月31日；101(35): 12986–12991.
C/EBPβ靶点的正交分析体内在肝脏增殖期间
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约书亚·R·弗里德曼
以下部门*遗传学，†儿科学，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
布莱恩·拉里斯
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
菲利普·P·勒
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
T.Harshani Peiris公司
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阿萨纳西奥斯·阿森利斯
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心，以及∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
乔纳森·舒格
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心，以及∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
约翰·托拜厄斯
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
克劳斯·凯斯特纳
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琳达·E·格林鲍姆
以下部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
部门*遗传学，†儿科，以及§医学，¶生物信息学中心∥宾夕法尼亚大学医学院生物信息学核心基因组研究所，费城，PA 19104
‡J.R.F.和B.L.对这项工作做出了同等贡献。
编者：Peter K.Vogt，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA，于2004年7月27日批准
- 补充资料
支持表格
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摘要
CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，是生理生长和癌症信号的重要效应器。直接C/EBPβ靶点的识别体内受到其他C/EBP家族蛋白的功能补偿和一致序列的低严格性的限制。在这里，我们利用表达谱和高通量染色质免疫沉淀的联合作用来确定C/EBPβ的直接和生物相关靶点。我们确定了25个潜在的C/EBPβ靶点，其中88%的受试者被证实为体内C/EBPβ结合位点。其中6个基因在C/EBPβ中也显示出差异表达–/–肝脏。计算分析表明，真正的C/EBPβ靶基因可以通过在C/EBP？位点附近存在特定额外转录因子的结合基序来区分。这种方法通常适用于发现哺乳动物转录因子的直接生物相关靶点。
CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPs）构成了一个碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族，对许多生物过程的调节至关重要，包括分化、代谢稳态、增殖、肿瘤发生、炎症和细胞凋亡(1–9). C/EBP蛋白在多个水平上受到调节，包括基因转录、翻译和磷酸化，以响应各种刺激，包括激素、细胞因子和生长因子信号通路(1). C/EBP蛋白能够与其他C/EBP家族成员形成异二聚体和同二聚体复合物，从而在靶序列识别中创造额外的多样性。
C/EBPβ在生理和肿瘤生长、急性酶反应和代谢稳态的实验模型中是生长信号的重要效应器(1–11). C/EBPβ的生命–/–小鼠表现出迟钝的再生反应，与长期低血糖和几个细胞周期相关基因表达的改变有关(10). 此外，最近对人类肿瘤的微阵列分析表明C/EBPβ是细胞周期蛋白D的下游介体(12). 尽管这些研究为C/EBPβ作为细胞生长调节器的作用提供了有力的支持，但目前，C/EBP？调节细胞周期蛋白D1生长效应的机制以及C/EBP。
多种方法已被用于鉴定C/EBPβ结合位点，包括细胞培养系统、C/EBPβ–/–小鼠和启动子序列分析。然而，一些障碍限制了直接C/EBPβ依赖性转录靶点的识别体内除C/EBPξ外，所有C/EBP家族成员都拥有相同的在体外C/EBP共识序列的DNA结合亲和力，表明其他C/EBP家族成员可能能够补偿C/EBPβ的丢失(13). 第二，计算序列分析在识别C/EBP启动子序列中的应用受到了阻碍，因为可以容忍与最佳C/EBP结合序列的显著差异，从而限制了C/EBP一致序列的区分能力。此外，C/EBPβ与其他碱性亮氨酸拉链（bZIP）和非bZIP转录因子异源二聚体的能力与反式激活和DNA-结合特异性的改变有关，这些改变可能无法根据一致的C/EBP结合序列进行预测(14–17). 在这里，我们利用表达谱和高通量染色质免疫沉淀（ChIP）的联合作用来表征C/EBPβ的直接和生物相关靶点。
材料和方法
动物。小鼠C/EBPβ空突变纯合子的推导已被描述(2). 按照描述进行小鼠部分肝切除(10).
炸薯条。将小鼠肝脏放入冷PBS中切碎，然后穿过一根21号的针。将切碎的组织在1%甲醛/PBS中交联15分钟，并不断摇晃。通过将甘氨酸添加到0.125 M的最终浓度，并持续摇晃5分钟，来淬灭交联。在PBS中冲洗组织，并使用Dounce均质机均质。细胞以13000×克在细胞裂解缓冲液中再次悬浮5分钟（5 mM管道，pH 8.0/85 mM KCl/0.5%Nonide P-40/10μM抑肽酶/10μM-leupeptin/1mM PMSF），并在冰上培养15分钟。在13000×克将其重新悬浮在核裂解缓冲液（50 mM Tris·Cl，pH值8.1/10 mM EDTA/1%SDS/10μM抑肽酶/10μM亮氨酸蛋白酶/1 mM PMSF）中5 min，并在冰上培养10 min。将裂解液分为500μl等分，并使用100型声波分解器（Fisher Scientific）进行声波分解将微型探针设置为4–6 W的功率输出，每次循环三次，每次20 s。通过离心去除不溶性碎片，收集上清液并在液氮中快速冷冻。对输入的DNA部分进行定量PCR，以确保在所有免疫沉淀中使用等量的染色质DNA。按照说明进行免疫沉淀(18). 靶基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）相对于28S rRNA基因的富集度计算如下：富集度=2^[（28S）炸薯条–派克炸薯条)–（28秒输入–派克输入)]. 通过使用转录元件搜索系统（TESS）程序搜索小鼠启动子微阵列上的区域以及两端各500 bp，确定候选靶基因中的潜在C/EBPβ结合位点(19). 可根据要求提供引物序列。
小鼠启动子微阵列。通过将Refseq基因集合与胎儿和成人胰腺和肝脏中表达的基因交叉，构建小鼠启动子微阵列。将Refseq序列在小鼠基因组上的Golden Path BLAT比对的第一个核苷酸作为转录起始位点（TSS）。底漆3用于设计PCR引物，扩增TSS（–2000，+200）区域的≈1kb基因组启动子序列，包括可能的TSS(20). 这些引物用于从CD1小鼠基因组DNA中产生PCR产物。所有PCR产物均使用Qiaquick PCR试剂盒（Qiagen，Valencia.CA）纯化，用去离子无菌水洗脱，用等量的二甲基亚砜（Sigma）稀释，并打印在聚乙烯上-我-带有生物机器人微格网II（Genomic Solutions，密歇根州安阿伯）的赖氨酸涂层载玻片。
全基因组定位分析。免疫沉淀DNA的扩增和标记如所述进行(21)修改如下。用T4 DNA聚合酶处理从ChIP获得的纯化DNA以产生钝端，然后连接到退火的接头上并通过PCR扩增。扩增后，每个杂交标记≈1μg扩增的ChIP DNA。使用QIA-快速PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。根据制造商的说明，使用Ready-To-Go标记珠（Amersham Pharmacia）进行标记。每个50μl反应包括5μl Cy3-或Cy5-dCTP（Amersham Pharmacia）。每种杂交包括一个用Cy3标记的非免疫IgG ChIP和一个用Cy5标记的C/EBPβ特异性ChIP。使用Minelute PCR纯化试剂盒（Qiagen）汇总和纯化每个玻片的标记反应。如下所述进行杂交、洗涤和扫描。野生型和C/EBPβ强度不同的基因–/–不超过背景强度的被排除在外。所有幻灯片在全球范围内标准化为相同的平均强度。具有野生型/C/EBPβ比率的基因–/–信号≥1.2纳入定位和表达组合芯片分析。
基因表达的微阵列分析。从四种野生型和四种C/EBPβ中分离出肝脏RNA–/–小鼠部分肝切除术后0、2、16h。通过异硫氰酸胍和氯化铯超速离心，为每个样品制备20微克RNA。此外，200μg RNA含有野生型和C/EBPβ–/–RNA被用作每次杂交的共同对照。使用Nano 6000生物分析仪（安捷伦科技公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托）对所有样品进行分析，以确定样品的完整性和浓度。用氨基烯丙基dUTP和d（T）标记RNA21启动逆转录。将荧光标记偶联到cDNA，并将cDNA杂交到pancchip v.5.0版(22,23). 安捷伦扫描仪使用genepix公司软件。这些数据通过使用打印笔尖宽度归一化进行归一化，并在所有进一步的比较中使用比强度与普通对照强度的比值。对于组合定位和表达微阵列分析，我们包括表达改变的基因（C/EBPβ变化>50%–/–突变型肝与野生型肝）和肝切除术后异常诱导基因。后者被定义为野生型小鼠肝部分切除术后2或16小时表达水平变化50%，但C/EBPβ相应时间点表达水平变化<25%的基因–/–老鼠。
定量实时PCR。根据制造商的说明，使用Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix（Stratagene）、10μM引物和1:200稀释的参考染料组装PCR反应混合物。在Mx4000多重定量PCR系统（Stratagene）上使用SYBR Green（带离解曲线）程序进行反应。循环参数为95°C 10分钟，然后进行40次95°C（30 s）、58°C或60°C（1 min）和72°C（30s）循环，然后进行熔化曲线分析。所有反应都是通过两到六个生物复制品和三个技术复制品以及参考染料归一化进行的。采用中位循环阈值进行分析。可根据要求提供引物序列。
DNA-结合位点检测。中的所有674个位置敏感评分矩阵（PSSM）transac v7.3根据15个ChIP确认的C/EBP靶基因和138个阴性对照基因的训练集进行评分。在我们的研究中，阴性对照基因的选择是基于缺乏与小鼠启动子微阵列的结合，以及根据我们的研究结果，mRNA表达对C/EBPβ缺乏依赖性薄片5.0微阵列实验。考虑对数似然比得分至少为5.0的站点。如果需要，这个阈值被调高，以确保每个启动子的平均预测位点不超过三个。对于每个PSSM，我们通过计算每个组中包含得分至少与阈值一样高的位点的基因分数，创建了一个受体操作特征（ROC）图，该阈值介于最小和最大观察得分之间。然后我们计算ROC图（AUC）下的面积，范围为0到1；较高的数字表明PSSM对C/EBPβ结合扩增子有较强的偏好性。根据其AUC评分对PSSM进行排名，排除那些在成年小鼠肝脏中未表达的PSSM（基于基因表达数据库GXD）。我们保留了前三个PSSM（M00624/DBP_Q6、M00258/ISRE_01和M00763/PPAR_DR1_01）和C/EBP PSSM（M 00109、CEBPB_02），并计算了三个或四个PSSM的所有对和组的ROC图。在所有情况下，我们都允许PSSM以任何顺序和方向发生。我们通过改变个体得分阈值和最大允许距离（从5′最大到3′最大PSSM）来计算ROC图。我们注意到ROC曲线上的点的得分和距离阈值，这使得15个C/EBPβ靶基因（真阳性，TP）和阴性对照组之间的阳性差异最大。然后，我们计算了启动子芯片上代表的2122个基因的数量，该启动子芯片包含一个超过这些阈值的PSSM集（芯片阳性，CP）。使用超几何分布，我们计算了P（P）从包含CP标记实例的2122个总体中抽取15个样本时，至少看到TP的值匹配。我们通过将每个测试效果相乘来补偿多个测试效果P（P）通过两个、三个或四个PSSM的组数（重复）得出的值，这些PSSM包括C/EBP的八个PSSM中的至少一个。
结果
为了确定正常肝脏和肝再生过程中C/EBPβ调控的靶基因，我们结合全基因组定位分析和mRNA表达谱进行了正交分析。鉴定这些靶基因的先决条件是检测小鼠肝脏中的C/EBPβDNA结合活性，因为培养的细胞无法再现对生长刺激作出反应的肝细胞状态。我们使用成年小鼠肝脏制备的染色质，并用C/EBPβ特异性抗体免疫沉淀，证实了C/EBP？与PEPCK基因中特征明确的结合位点的结合()为了量化C/EBPβ靶序列的富集程度，我们对免疫沉淀材料进行了实时PCR(). C/EBPβ抗体从野生型肝染色质中富集了17.4倍的PEPCK DNA，而当使用非免疫性IgG时，富集程度最低。为了进一步证实C/EBPβ抗体的特异性，我们使用从C/EBP–/–肝染色质。观察到PEPCK DNA富集3.1倍()表明所用抗体对其他C/EBP家族成员或其他因子具有轻微的非特异性结合活性。因此，在整个定位分析中使用突变染色质作为对照是至关重要的（见下文），因为这会增强真正的C/EBPβ结合DNA序列的特异性。
小鼠肝脏中C/EBPβ的ChIP与PEPCK基因结合。由野生型或C/EBPβ制备的交联染色质–/–如图所示，用抗C/EBPα、抗C/EBP-β或非免疫IgG免疫沉淀小鼠肝脏。(A类)用PEPCK或阴性对照基因HPRT的特异性引物扩增输入染色质和沉淀物质。(B类)使用C/EBPβ或非免疫抗体对ChIP进行实时定量PCR分析。使用28S rRNA基因作为非特异性对照，计算目标基因PEPCK的富集度。
C/EBPβ靶基因的正交分析。我们进一步确定了与C/EBPβ结合的基因和肝再生过程中依赖C/EBPβ进行适当诱导()为此，我们在肝脏中表达的2122个基因的启动子附近，通过PCR扩增约1 kb的基因组序列，制作了小鼠启动子微阵列。使用该微阵列，我们对从静止的成年小鼠肝脏中获得的染色质和部分肝切除术后2小时获得的染色蛋白进行了定位分析。C/EBPβ基因无突变纯合小鼠的肝脏作为抗体特异性的阴性对照。使用C/EBPβ抗体从ChIP中纯化的DNA通过连接介导的PCR扩增，荧光标记，并与小鼠启动子微阵列杂交。与C/EBPβ相比，野生型中信号强度至少高20%的基因–/–样本被视为阳性。选择这种低严格性是为了最大限度地提高位置分析的灵敏度；通过应用表达谱提供的额外筛选增强了特异性(). 此外，我们注意到，与未扩增ChIP样品的定量PCR相比，扩增、标记和微阵列杂交导致富集压缩（P.P.L.、J.R.F.和K.H.K.，未发表的结果）。为了进行表达谱分析，对四种野生型和四种C/EBPβ进行了部分肝切除–/–突变小鼠，在部分肝切除术后0、2和16 h提取肝脏RNA。这种RNA被反转录，荧光标记，并杂交到薄片5.0 cDNA微阵列(22). （完整的结果薄片表3和表4列出了5.0和小鼠启动子微阵列杂交，发布为支持信息在PNAS网站上。）我们重点分析了需要C/EBPβ才能在静止肝脏中正确表达的基因（即C/EBP–/–突变肝脏与野生型）和肝切除术后异常诱导基因。后者被定义为野生型小鼠肝部分切除术后2或16小时表达水平变化50%，但C/EBPβ相应时间点表达水平变化<25%的基因–/–老鼠。通过这种联合筛查方法确定的静止和再生肝脏中的直接C/EBPβ靶基因列于.其中三个[Aldh1a1型(24),佩普克(25,26)，以及Saa1公司(27–29)]已被报道为C/EBPβ的靶点，为我们的正交分析的实用性提供了支持。
结合定位和表达微阵列分析。(A类)实验方法的示意图。对野生型和C/EBPβ进行部分肝切除–/–老鼠。在部分肝切除术后0、2和16小时（仅RNA）制备RNA和交联染色质。通过使用C/EBPβ特异性抗体进行ChIP，并通过连接介导的PCR扩增所得材料（参见材料和方法)，荧光标记，并与小鼠启动子微阵列杂交。RNA被反转录，cDNA被标记并杂交到全片5.0.(B类)部分肝切除术后C/EBPβ直接调控的候选基因被定义为那些位于通过定位分析确定的一组基因交叉点内的基因，这些基因在静止或部分肝切除后（post-PH）肝脏中表达改变（参见材料和方法).
表1。
静止和/或再生肝脏中的候选直接C/EBPβ靶基因
| | 表达式分析
| 位置分析
|
|---|
| 基因名称 | 功能 | 静止的肝脏 | 产后2小时、16小时 | 静止的肝脏 | 产后2小时 |
|---|
| Aldh 1a1（醛脱氢酶1a1） | 维甲酸合成，异源转化 | -2.5 | -2.3, -2.1 | 8.5 | 1.1 |
| Anxa5（Anx5，annexin V） | 未知 | 1.5 | 1.9, -1.1 | 6.7 | 1 |
| Bcap37（B细胞受体相关蛋白37） | 信号转导 | 1.4 | -1.1, 1.4 | 1.3 | 1.2 |
| Car3（碳酸酐酶3） | 一氧化碳2/碳酸氢盐转化 | -2.5 | -3.1, -3.9 | 2.1 | 1.9 |
| Cln8（mnd，运动神经元变性） | 神经酰胺/脂质合成 | 1.1 | 1.1, 1.3 | 0.8 | 2 |
| Clic4（氯化物细胞内通道4，线粒体） | 未知 | 1.4 | 1.4, 1.0 | 1.5 | 0.9 |
| 变更1 | 染色质修饰还是RNA剪接？ | 1 | 1.6、1.1 | 1.5 | 1.6 |
| Csrp1（CRP1） | 未知 | 1.5 | 1.4, 1.4 | 1.6 | 0.6 |
| Dnm2（动态2） | 细胞骨架组织 | 3.3 | 4.9, 1.8 | 1.3 | 1.3 |
| Es1（Ee-1、Es-1、Es-4、Es-N） | 羧酸酯酶 | 2.1 | 1.9, 1.6 | ND（无损检测） | 1.5 |
| Fad2（脂肪酸辅酶A连接酶，长链2） | 脂肪酸代谢 | -2.5 | -2.1, 1.6 | 1.5 | 1.3 |
| 前kbp11 | FKBP型肽基丙基-顺-反式-异构酶 | 1.2 | 1.1, 1.7 | 1.8 | 1 |
| Foxa3（Hnf3g、Tcf-3g） | 转录因子 | 1.7 | 1.2, 1.9 | 0.7 | 1.2 |
| Gstt1（Gstt1-1） | 谷胱甘肽-S公司-转移酶 | -1.3 | 1.4, -1.6 | 0.7 | 1.3 |
| Grb2（生长因子受体结合蛋白2） | SH2/SH3适配器 | -1.4 | 1.0, -2.6 | 1.8 | ND（无损检测） |
| Krt1-18（角蛋白复合物1，酸性，基因18） | 结构蛋白 | 6.2 | 10.7, 1.8 | 1.2 | 1.1 |
| 第1包（PEPCK，第1包） | 糖异生 | 1.4 | 1.4, 2.1 | ND（无损检测） | 2.8 |
| Arhb（Arh6，RhoB） | Ras同源，多功能 | 1.5 | 1.1, 1.5 | 1.6 | 1.2 |
| RIKEN cDNA 2310008M10 | 未知 | 1.2 | -1.1、1.5 | 1.2 | 1 |
| RIKEN cDNA 2010203J19 | 未知 | 1.4 | 1.2, 1.3 | 1.8 | 1.1 |
| RIKEN基因2900019C14 | 未知 | 1.1 | 1.1, 1.9 | 1.4 | 1.4 |
| RIKEN cDNA 3930402F23 | 未知 | 1.8 | 1.6, 1.2 | 1.7 | 1.1 |
| Rnf19型 | 中心体蛋白 | 1.2 | -1.1, 1.3 | 1.3 | 0.9 |
| S 100a 10（附录II，p11，Cal11） | 未知 | 1.7 | 2.0, 1.1 | 1.2 | 3 |
| Saa1（血清淀粉样蛋白A1） | 高密度载脂蛋白 | 92.7 | 24.9, 101.9 | 1.4 | 1.2 |
C/EBPβ靶基因的确认。选择17个靶基因进行进一步确认。为了确定所选基因启动子是否直接与C/EBPβ结合，我们进行了常规的ChIP(). 15个（88.2%）基因在野生型ChIPs中特异性富集，而不是C/EBPβ–/–小鼠肝脏染色质。这一发现可能被低估了，因为一些阴性基因可能在离ChIP PCR扩增子太远的位置被C/EBPβ结合，而无法用这种方法检测。使用定量逆转录/实时PCR，我们发现在静止的肝脏或野生型小鼠肝部分切除术后，所选基因以多种模式被诱导或抑制()其中6个基因（35%）在C/EBPβ中的表达模式和/或时间显著改变–/–小鼠相对于野生型小鼠。然而，我们已经证明与C/EBPβ结合的几个基因在C/EBP–/–小鼠，说明复杂调控网络中存在冗余。我们的结论是，结合位置分析和表达谱分析，可以确定不仅与C/EBPβ直接结合的基因，尤其是与静止和/或再生肝脏中的这种结合功能相关的基因。
通过正交分析确定C/EBPβ靶点。(A类)C/EBPβ靶基因的常规ChIP。染色质由静止野生型或C/EBPβ制备–/–突变小鼠肝脏，并使用C/EBPβ或非免疫抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物和输入染色质通过使用指定基因的特异性引物进行PCR。给出了重复实验的典型结果。(B类)静止和再生肝脏中C/EBPβ靶点的表达。使用从野生型和C/EBPβ获得的反转录RNA进行定量实时PCR–/–部分肝切除术前和术后2、16、24、40和48h的突变小鼠肝脏。每个基因的表达以与TATA结合蛋白的表达的比例表示。误差条表示平均值的标准误差。*,P（P）≤ 0.05.
潜在C/EBPβ结合伙伴的识别。随机寡核苷酸结合选择已确定一致的C/EBP家族DNA-结合序列为ATTCGGCAAT(13). 这种和密切相关的位点在哺乳动物基因组序列中出现频率很高；事实上，C/EBPβ结合的分析在体外基因组DNA的随机片段暗示有3×107大鼠基因组中的C/EBPβ位点(30). 很可能只有这些站点的一个子集实际绑定体内我们假设这种特异性部分来自于其他转录因子与邻近位点的结合。这些因子的结合可能通过与C/EBPβ的直接相互作用或通过解除抑制性染色质结构来促进C/EBP？的结合。我们发现15个结合基因体内通过C/EBPβ提供了识别其中一些位点的机会。使用TRANSFAC数据库中的所有674个转录因子结合位点，我们对C/EBPβ结合基因集中更常见的位点进行了计算搜索(n个=15）而不是在我们的定位分析中既不与C/EBPβ结合也不依赖C/EBP？表达的基因中(n个= 138). 排名最高的位点是干扰素刺激反应元件、过氧化物酶体增殖物激活受体直接重复1位点（PPAR-DR1）和白蛋白D位点结合蛋白共识位点()值得注意的是，相对于小鼠启动子微阵列上的总序列，C/EBPβ位点和这三个位点的高阶组合在C/EBP？结合基因中的频率显著增加（80%对4-12%）。这些结果表明体内C/EBPβ与靶基因的结合由多个额外的组织特异性因子的结合决定。
表2。
与C/EBPβ结合位点相关的转录因子结合位点体内
| 绑定站点 | 最大总长度，bp | C/EBP目标的频率(n个= 15), % | 微阵列集合中的频率(n个= 2,122), % | P（P）值（已更正） |
|---|
| C/EBPβ，DBP | 342 | 80 | 16 | 4.0 × 10-4 |
| C/EBPβ，ISRE | 608 | 80 | 14 | 7.7×10-5 |
| C/EBPβ，PPAR-DR1 | 736 | 73 | 19 | 0.04 |
| C/EBPβ、DBP、ISRE | 790 | 80 | 6.4 | 1.9 × 10-6 |
| C/EBPβ、DBP、PPAR-DR1 | 963 | 80 | 12 | 3.5 × 10-3个 |
| C/EBPβ、ISRE、PPAR-DR1 | 663 | 80 | 9.3 | 1.9 × 10-4 |
| C/EBPβ、DBP、ISRE、PPAR-DR1 | 768 | 80 | 4.2 | 2.7 × 10-6 |
讨论
我们研究中确定的直接C/EBPβ靶点分为两类：在静止肝脏中依赖C/EBP？但通常在部分肝切除术后诱导的靶点，以及仅在部分肝切术后依赖C/EB？的靶点。前一类中的两个基因（Car3和Saa1）参与氧化损伤的预防(31,32)C/EBPβ也参与了这一过程(33–35). 部分肝切除术后对Car3和Saa1的C/EBPβ依赖性诱导强化了这样一个概念，即基因调节是一个动态过程，在这个过程中，不同的转录因子可能根据细胞的状态调节单个基因。
第二类C/EBPβ靶点包括Foxa3和Rnf19。将Foxa3确定为再生肝脏中的直接C/EBPβ靶点特别有趣，因为Foxa3在长时间禁食期间是维持葡萄糖稳态所必需的(36). 可想而知，Foxa3激活减少可能导致C/EBPβ中观察到的长期低血糖–/–小鼠肝部分切除术后。我们的分析确定的另一个C/EBPβ靶点是Rnf19，一种定位于体细胞中心体的泛素连接酶(37,38). 其中心体定位和泛素连接酶活性表明，Rnf19可能在微管组织中心（MTOC）发挥作用。泛素连接酶介导的MTOC中心体相关蛋白的降解是中心体复制所必需的，中心体重复是G的必要组成部分1/S相变(39). Rnf19在C/EBPβ中的表达显著降低–/–肝部分切除术后16小时的肝脏，对应于中期G1肝细胞周期的阶段。这种表达的减少可能导致对G的抑制蛋白水平增加1/S期进展，可能导致C/EBPβ中观察到的DNA合成减少–/–肝部分切除术后的肝脏。
预测C/EBPβ结合位点的高频率在体外和计算分析(13,30)提示其他特征必须区分真正的C/EBPβ靶基因。这种额外的特异性可以通过要求C/EBPβ位点周围区域的其他因子结合来实现。这些其他因素可能与C/EBPβ直接相互作用，并在DNA结合中协同作用。在前一种情况下，DNA的环化可能允许C/EBPβ与自身的DNA结合位点和其他DNA结合转录因子同时相互作用；这类似于转录激活物结合到远处增强子元件将RNA聚合酶II复合物带到靶基因启动子的机制。本研究中发现的靠近C/EBPβ位点的ISRE的频繁出现支持了这一模型，因为C/EBP？和IFN反应因子1（IRF-1）已被证明在物理上相互作用并共同调节IL-18结合蛋白启动子(40). 我们的研究表明，IRF-1和C/EBPβ可能以类似的方式协同激活肝脏特异性基因。
C/EBPβ与其一致序列的结合也可能被促进体内通过其他结合转录因子诱导的染色质结构的局部变化，如Foxa3和GATA-4结合后在胚胎肝发育过程中白蛋白增强子处发生的变化(41). 因此，靠近C/EBPβ位点的PPAR-DR1位点的高频率特别具有提示性，因为PPAR家族成员已被证明与SWI/SNF染色质重塑复合物相互作用(42). C/EBPβ和PPAR位点的联合存在也符合这两个因子在肝脏脂肪代谢和脂肪生成中基因调控的协同性(43,44). D位点结合蛋白和C/EBPβ位点的一致性也与之前关于这两个因子在激活因子IX基因中协同作用的发现一致(45). 最后，我们惊讶地发现C/EBPβ位点与其他两个或三个转录因子结合位点的组合频率很高。这一发现表明，可同时使用多种机制实现C/EBPβ与靶基因的组织特异性结合。
总之，我们利用了表达谱分析和高通量ChIP的综合能力来确定C/EBPβ的直接和生物相关靶点。筛选方法的组合确定了26个潜在的C/EBPβ靶点。其中，17人接受了测试并确认为体内通过常规ChIP检测到的C/EBPβ结合位点，其中6个通过其在C/EBP–/–老鼠。我们希望这项技术能够普遍应用于发现其他转录因子的生物学相关靶基因。
致谢
我们感谢张丽萍（Liping Zhang）在定量PCR方面的帮助，感谢佩吉·法纳姆（Peggy Farnham）实验室的艾米·温曼（Amy Weinmann）提供的技术援助。这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所拨款DK056669（给L.E.G.）、DK49210（给K.H.K.）和DK56947（给K.S.H.K.K.）的支持。J.R.F.获得了国家普通医学科学研究所资助5T32GM008638。
笔记
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
缩写：C/EBP、CCAAT增强子结合蛋白；ChIP，染色质免疫沉淀；PSSM，位置敏感评分矩阵；ROC，接收器操作特性；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；PPAR，过氧化物酶体增殖物激活受体。
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