多靶点植物治疗概念在疟疾药物发现中的应用：生物标记物鉴定的系统生物学方法

植物的选择

选择植物作为试验材料仍然是植物疟疾药物研发过程中最具挑战性和决定性的因素。在这个过程中，有各种各样的方法来选择植物材料，这些方法包括随机选择、民族药理学、化学系统学（系统发育）、生态学和计算方法。

当样品来源于生物多样性高和疟疾地方性强的地区时，根据其可用性随机选择不同植物物种的提取物和/或组分可能是非常有利的[19]。这是因为天然产物的化学多样性可以反映其来源生物的生物多样性。随机选择植物材料可能会导致无法预料的生物活性鉴定，而这些生物活性是无法根据本地或现有知识预测的[20].

民族药理学是选择植物进行生物测定的经典方法，它涉及收集植物在当地使用的数据，作为选择植物的依据。这通常涉及对传统药物及其对人类的影响进行观察、描述和实验评估。它代表了自然科学（植物学、化学、生物化学、药理学和生药学）和社会科学（人类学、考古学、历史学和语言学）之间的跨学科概念[12,21]。这种方法导致了一些重要的抗疟疾药物的显著发现。例如，从1820年的金鸡纳物种中分离出奎宁及其衍生物，20年取代它的氯喹和甲氟喹^第个世纪[22]。青蒿素是从一年生Artemisa annua1971年，是目前广泛使用的青蒿素类联合疗法（ACT）及其衍生物青蒿琥酯和蒿甲醚的核心[23]。最近引进的一种植物源抗疟药物是阿托伐醌，它是一种以拉帕霍尔为基础的合成萘醌，是一种戊基萘醌，首次从斑叶钟花树，Bignoniaceae家族的南美成员[4]。在传统中医（TCM）和阿育吠陀（Ayurveda）等成熟的传统卫生系统中，可以很容易地获取民族药理学数据，这些系统拥有数百年的现有文献证据。然而，非洲传统卫生系统等其他卫生系统的情况并非如此，在非洲传统卫生体系中，知识是通过口头一代传给另一代的，使用的配方通常由老年医生保密，因此很难获得相关信息[21,24]。因此，根据要研究的植物，有各种各样的信息来源，如药用植物学书籍、不同地理区域或文化中使用的药用植物的综述文章[25]以及计算机数据库[26].

化学系统或系统发育方法是基于化学分类学和系统发育，考虑到一些属或科的植物物种已知会产生与特定生物活性或治疗潜力相关的化合物和化合物类别[20]。系统发育信息和民族植物学知识的结合可以成为天然产物药物发现的有力工具。在系统发育框架内探索跨文化民族医学模式可以带来高成功率[27,28].

生态学方法基于对生物体与其环境之间相互作用的观察，考虑到植物次生代谢物具有生态功能，可以从中获得潜在的人类治疗用途[20]。例如，可以从野生黑猩猩和狒狒所吃的植物中分离出具有抗疟疾活性的化合物[29].

计算方法依赖于生物信息学某些植物成分的生物活性预测。这些研究可以集中于草药的主要成分以及直接从文献中检索到的具有抗疟疾作用的其他天然化合物[30].

正确识别并采购了所选植物后，药用植物生物资源增值的下一步是使用多种技术生产草药制剂（提取物），从简单的传统技术到先进的提取技术，具体取决于检测方法的选择。

体外抗疟效果

体外筛选疟原虫实验室菌株和现场分离物对测试化合物的敏感性，可早期显示药物疗效、失效或可能的临床耐药性。这些筛查通常以全细胞为基础，需要筛查红细胞和红细胞外期[37]。它们首先用于鉴定活性提取物，然后进行代谢组学分析，其次用于鉴定植物化学成分的代谢组学特征后的潜在生物标志物。

在红细胞阶段筛查中，通过测量细胞的生长和增殖来监测抑制恶性疟原虫菌株，通常不知道正在筛选的化合物的分子靶点[38]。HTS方法目前用于测量恶性疟原虫体外药物敏感性包括^三次黄嘌呤掺入试验[39]，富组氨酸蛋白-2酶联免疫吸附试验（HRP-2 ELISA）[40,41]，寄生虫乳酸脱氢酶比色法（pLDH）[42]以及最新的SYBR Green-1荧光检测[43,44]。滴定次黄嘌呤摄取分析包括通过记录滴定次黄碱并入寄生虫DNA的水平来测量寄生虫的生长。虽然准确可靠，但其主要缺点是使用放射性，安全处置放射性需要大量资源。HRP-2方法通过ELISA检测评估寄生虫生长恶性疟原虫HRP-2，并在使用非放射性程序检查现场分离株的药物敏感性时提供了更好的结果。与^三H-次黄嘌呤法。pLDH测定是一种间接方法，用于测量恶性疟原虫LDH活性作为比色法评估寄生虫血症。尽管与^三次黄嘌呤法，它是一种ELISA方法，与HRP-2方法一样，取决于特定抗体的可用性。最近开发的SYBR Green-1荧光检测是基于测量荧光SYBR Green-1染料并入寄生虫DNA的情况。这需要DNA染色的一个步骤，与其他方法相比，它的劳动强度更低，成本更低，而且更适合HTS，HTS已成为药物筛选的金标准。本试验证明了一种简单、快速、廉价和易于使用的荧光法的可靠性，该方法可用于恶性疟原虫实验室菌株和临床菌株[45].

红细胞外期或肝脏期是根除计划的一个非常重要的生命周期阶段。最近在开发HTS以鉴定针对该阶段寄生虫的活性化合物方面取得了进展。人类血液期感染中存在数十亿寄生虫，在传播和再感染期间，只有有限数量的钩虫、催眠虫或早期肝脏形式存在，因此如果在这些阶段进行干预，不太可能出现耐药性[46]。注入蚊子唾液的寄生虫进入宿主肝脏，在进入血液前大约一周的无症状潜伏期内，它们以外红细胞形式（EEF）进行无性繁殖。这启动了无性红细胞周期，导致疟疾的出现。与一些人有限的寿命相反疟原虫物种，卵形P和间日疟原虫可以作为休眠催眠剂在肝脏内持续数月。它们的重新激活通常是由一种未知的机制触发的，可以看到快速增长的寄生虫重新聚集血液，从而导致病理学。因此，催眠剂的持续存在是根除进程的巨大障碍[47].

在疟原虫的血液阶段形态中，有一个亚群能够对尚不清楚的线索作出反应，在一个大约需要8-12天的过程中分化为雄性和雌性配子体恶性疟原虫这些寄生虫代谢宿主红细胞血红蛋白，同时通过光学显微镜可以识别的五个不同的形态阶段进行[48]。这些不成熟的配子体细胞在宿主体内可以存活长达55天，成熟的配子体细胞是唯一能够在蚊子中肠中存活、交配、进行减数分裂并产生下一代寄生虫传播给新宿主的形式[49]。大多数对红细胞期有效的化合物对肝期无效，目前一线青蒿素治疗方案不能阻止传播[50]。目前抗疟疾药物研发的一个重点是筛选对肝脏和配子细胞都有效的小分子和HM，以阻止疟疾传播。HMs的复杂化学多样性是一个系统中此类支架的可靠来源。

开发HTS分析来评估肝期活动的主要缺点之一是寄生虫无法在培养物中保持。最近开发的一种检测方法是高含量筛选（HCS），可用于确定具有已知血期活性的HMs的疗效约埃利受感染的肝细胞。为了检测可能的预防活动，P.berghei博士或约埃利将子孢子接种到人类肝癌细胞中，并对感染进行成像[51]或酶法检测[52]。或者，使用中等通量分析，可以使用催眠剂形成猴子模型测试测试化合物的自由基潜力，cynolmolgi猪。cynolmolgi猪将子孢子接种到猴的原代肝细胞中，HCS用于确定快速发育的大裂殖体和休眠的“小形态”（假定为催眠子）之间的比率。包括催眠剂在内的所有寄生虫都将被根治剂清除，而预防性化合物将作用于生长中的裂殖体[53].

尽管可以用测定法筛选具有阻断传播潜力的化合物，但这些测定法特别困难，因为对配子细胞生成的过程还不太了解。第一次配子体筛选是使用阿拉玛蓝进行的，阿拉玛蓝是一种氧化还原指示剂，在配子体代谢活动期间，随着生长介质的化学还原而发出荧光并改变颜色[54]。基于这一原理，其他的筛选都是用乳酸脱氢酶来实现的[55]。在配子细胞从早期到晚期（传播）成熟所需的12天内，它们不会分裂。因此，基于抑制寄生虫增殖检测的方法是有限的[37]。替代的HTS检测技术已被开发用于检测配子细胞死亡，其中大多数使用总ATP水解来测量存活率。因此，这种活性的丧失意味着配子细胞死亡[54]。也可以通过流式细胞术选择性地计数表达配子期特定GFP标记的寄生虫[56]。然而，大多数分析只是试图通过测量配子细胞死亡来预测传播阻断活动。努力集中在更具预测性的测定上，旨在测量不同阶段，特别是后期的生存能力[57]。最近，Plouffe等人[58]开发了一种HTS和经济有效的分析技术，即皂苷裂解性阶段分析（SaLSSA），用于识别具有阻断传播能力的小分子，它明确强调了无性和有性寄生虫之间的实质性生理差异，为发现和开发阻断传播药物提供了工具和起点。

HTS抗疟原虫功效测定相关性的局限性之一是，它们无法提供有关影响体内物质活性的一些因素的信息，如吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADME/T），该信息描述了生物活性化合物在体内系统中的处置。然而，它们仍然是识别和表征活性测试物质的重要工具[59]这应该通过毒理学筛选进行。这对于新药的开发以及现有分子和草药治疗潜力的扩展都非常重要，第一步是筛选细胞系或细胞毒性。

细胞活性和细胞毒性筛选

尽管市场对草药的需求不断增长，但人们不仅对其使用，而且对其安全性仍存在担忧。世界市场上只有不到10%的草药产品真正标准化为已知的活性成分，严格的质量控制措施并不总是得到严格遵守[60]。因此，细胞活性和细胞毒性检测对于药物筛选和抗疟疾药物分子和草药产品的体外安全性至关重要[61]。van Dyk等人强调了将这些分析纳入抗疟疾植物分析的重要性[62]当他们清除了59种南非植物中9种具有抗疟疾活性的有机溶剂提取物时。一种简单、快速、敏感、可靠、安全和经济高效的细胞活力测量方法是体外细胞增殖和细胞毒性的理想测试方法，它不应干扰待测化合物。这些基于细胞的测试是为了预测潜在的毒性，使用可能是正常细胞或转化细胞的培养细胞。该程序通常包括在对整个生物体进行安全性研究之前，将培养细胞短期暴露于测试化合物中，以检测对基础或专门细胞功能的影响。它还可以提供对测试物质致癌或基因毒性处置的见解。植物提取物或测试化合物抑制细胞生长和活性的能力可以作为其毒性的指标，其参数包括抑制细胞增殖、细胞活性标记（代谢和膜）、形态和细胞内分化标记[63]。进行这些分析时需要考虑的一些因素包括细胞培养系统、细胞类型与用于提取的溶剂系统的兼容性以及二甲基亚砜（DMSO）的最终浓度以避免毒性[64]。二甲基亚砜（DMSO）是一种重要的非质子溶剂，由于其两亲性，它可以溶解各种不易溶解的极性和非极性分子。这一点，再加上其浓度<10%时的明显低毒性，导致其广泛使用和广泛应用[65].

另一个需要考虑的重要因素是，由于某些植物提取物具有选择性毒性，因此选择广泛的高质量细胞类型进行测试，包括原始来源的正常细胞和永久性细胞系。使用这些细胞系的优点包括无限制供应，无遗传变异，这有助于结果的再现性和预测能力，以及获得从有关细胞系基因和表型的全球研究中获得的集体知识[66]。然而，与大多数永久性细胞系相比，原代细胞培养具有一个优势，因为它们是最接近于被仔细研究的体内细胞类型的体外表现。因此，原代肝细胞被认为是用于预测毒理学的“金标准”，因为它们通常被用于预期化学品将以与整个器官中发生的相同方式影响或受孤立细胞的影响[67].

基于细胞的分析可用于根据评估的终点预测毒性机制；这些包括细胞死亡/存活、适应性/致死前机制反应，包括线粒体内环境稳定、活性氧（ROS）生成、脂质过氧化、钙²⁺信号转导、酶抑制和转运体终点[66].

毒代动力学

毒代动力学研究由于遗传或潜在的草药-药物相互作用，特别是考虑到疟疾流行国家越来越多地使用抗疟植物进行治疗，草药或其纯化合物的药代动力学处置导致的毒性预测。因此，抗疟成分的毒代动力学对于评估抗疟组分的毒性和药物相互作用至关重要。Chung等人[68]最近报道了抗疟疾青蒿琥酯在大鼠体内的毒代动力学。该试验涉及人类肝微粒体细胞色素P450亚型的使用，旨在早期鉴定已知在细胞组织中引起毒理学调节的代谢物[69]。细胞色素P450是位于小肠、肝脏和其他组织中的含血红素的单加氧酶，在多种外源性物质的解毒和生物活性中起着关键作用[70]。大约75%的已知药物是通过细胞色素P450亚型（CYP3A4、CYP2C9、CYP219、CYP1A2和CYP2D6）催化的混合功能氧化反应在肝脏代谢的，由于它们对结构多样的底物具有广泛的特异性，因此极易受到抑制。细胞色素P450的调节在药物生物转化为活性或非活性形式中具有重要意义。对于依赖于这些酶在消除前通过与化学极性基团结合而失活的药物，任何诱导这些酶的草药都会导致这些药物的快速失活和清除。抑制酶活性的草药会导致药物浓度过高，而药物的失活依赖于酶活性。这可能会对毒性产生严重影响，尤其是如果药物积累的治疗窗口很窄。因此，当草药与联合给药药物的代谢相互作用，或者由于活性代谢物的形成增加而降低其疗效，或者由于代谢物消除减少而增加其毒性时，可以观察到具有临床意义的药物-草药相互作用[71]。这种具有临床意义的影响可以通过分析体外代谢数据并将其与受试物质在体内的代谢处置相关联来预测[72].

毒性试验

虽然基于细胞的分析可以预测潜在毒性，但使用整只动物可以测量受试物的临界毒性，以确定受试物剂量逐渐增加导致的毒性迹象。许多研究小组正在利用植物作为新的抗疟疾化疗药物的主要来源，因为这些植物在非洲传统医学中广泛用于疟疾治疗。然而，它们的使用并没有考虑到它们的安全性[111]。因此，必须建立在动物模型中表现出良好抗疟疾活性的植物及其成分的临床前安全性概况。国际上已经制定了毒性研究中动物护理和使用的标准指南[112]。这些指南涉及试验物质的制备和管理、动物福利考虑、动物选择和监管要求。通常进行的毒性试验包括急性、亚急性/亚慢性和慢性毒性。根据预期用途和/或给药途径，接触途径可以是口服灌胃、吸入、皮肤、腹腔内或肌肉内。

急性毒性试验测量实验生物体对单一或短暂暴露于试验物质的相对毒理学反应[112]。本试验用于计算致死剂量（LD₅₀) [113]观察通常持续14天。亚急性（28–30天）和亚慢性（60–90天）是指每天重复剂量接触试验物质，以评估对试验动物器官系统的生理、生化和组织病理学参数的影响。类似于亚慢性的慢性毒性试验涉及试验动物在六到二十四个月或更长时间内的暴露，以揭示对器官系统的影响[114]。此外，随后可能会进行专门测试，以揭示特定的毒性，如生殖、发育、眼睛、皮肤刺激性、神经和基因毒性[115].

体内抗疟原虫试验

体内试验是评估治疗反应最古老的方法，并且能够确定治疗失败的阈值，这对于调整抗疟疾药物政策至关重要[116]。体外试验中有效的试验物质用于体内评价。自疟原虫导致人类疟疾的物种基本上无法感染非灵长类动物模型，抗疟疾化合物的体内评估始于啮齿动物疟原虫的使用。其中包括伯氏疟原虫,P.约埃利、P.查巴迪、P.文凯（血液和配子细胞阶段筛选）和食蟹猴（肝期筛查）。体内模型通常用于抗疟疾研究，因为它们考虑了可能的前药作用和免疫系统在消灭病原体中可能的参与[117]。这些体内方法已经通过甲氟喹和青蒿素等标准药物的鉴定得到验证[118,119]从而成为草药药物研发的标准。它们可以分为初级、二级和三级生物评估[120]。在所有方法中，寄生虫抑制率的测定是最可靠的参数。与溶媒治疗动物（模拟治疗对照）相比，平均寄生虫血症水平≤90%通常表明试验化合物是活性的[121].

最广泛使用的初级生物测试是P.berghei博士4天抑制试验[122]，这需要受试小鼠感染P.berghei博士，ANKA菌株在第0天。感染后3小时和第1-3天，以氯喹和青蒿素为标准，用受试物治疗小鼠。第四天，准备所有动物的血涂片，并用吉姆萨染色。从第4天到第6天测定寄生虫病，并通过剂量范围、治疗性和预防性试验等多项二级生物评估进一步对活性物质进行检测。

剂量范围测试需要至少四种不同剂量的受试物（“剂量范围，完整的4天测试”）。预计起飞时间₅₀和ED₉₀通过绘制对数剂量与益生菌活性的关系来计算数值，并反映达到50%和90%抑制寄生虫血症的浓度。该测试还可获得与适当标准药物相比的相对效力信息[121].

治愈性试验，也称为Rane试验，涉及每天给小鼠或大鼠服用试验物质，在确定感染后72小时（D3），为期五天。后续的参数是测量血期寄生虫血症的减少和试验动物生存率的提高[123]。然而，在肝期筛查中，试验化合物的根治潜力是使用催眠剂形成猴子模型进行测试的。猴子感染了食蟹猴子孢子，然后用一种能够消除所有血液期寄生虫的化合物进行治疗，然后用试验化合物进行治疗。然后对这些猴子进行几个月的监测，以测量催眠药引起的复发频率的降低，以评估测试化合物的根治潜力[124]。还可以利用配子细胞感染蚊子的能力来检测试验化合物的阻断传播活性；这可以通过使用标准的膜供给分析来测量，使用恶性疟原虫[125]或直接喂食受感染的小鼠[126]。喂食后，计算每只蚊子中肠的卵囊数，以确定试验化合物的功效。

在预防性试验中，通过在感染前三天服用含有治疗性铅的物质来测试其预防活性，并连续三天每天检查涂片，以评估抑制血期寄生虫血症和提高生存率[127].

三级生物评估用于监测交叉耐药性和体内耐药性的产生。交叉电阻监测采用4天抑制试验，以确定是否存在相同的ED₅₀和ED₉₀与对照组相比，啮齿动物疟疾耐药株的价值P.berghei博士ANKA感染[121]。为了确定寄生虫在体内对新化合物产生耐药性的可能性，2%复发法是大多数类别化合物中使用最广泛的方法[128]。这需要给药一定剂量的受试物，在感染前1小时给药，可将2%的寄生虫血症延迟至感染后7-10天左右。当出现这种寄生虫血症时，重复该程序，每天监测达到2%寄生虫血症的时间。阻力程度表示为“延迟时间减少至2%”。这种方法可以扩展到证明药物压力消除后耐药性的稳定性，并选择能够减缓耐药性发展速度的伙伴化合物。

不适用。