Plasma microRNA biomarker detection for mild cognitive impairment using differential correlation analysis

Mitsunori Kayano; Sayuri Higaki; Jun-ichi Satoh; Kenji Matsumoto; Etsuro Matsubara; Osamu Takikawa; Shumpei Niida

doi:10.1186/s40364-016-0076-1

生物标记研究。2016; 4: 22.

2016年12月12日在线发布。数字对象标识：10.1186/s40364-016-0076-1

预防性维修识别码：PMC5151129

PMID：27999671

应用差异相关分析检测轻度认知障碍的血浆微小RNA生物标志物

Mitsunori Kayano公司,^1,² 小久里·平崎（Sayuri Higaki）,² 佐藤俊一,^三松本贤治,⁴ Etsuro Matsubara公司,^5,⁶ Osamu Takikawa先生,⁷和Shumpei Niida公司²

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关联数据

数据可用性声明: 数据将可从NCGG生物库（Medical Genome Center，http://www.ncgg.go.jp/mgc/index.html[准备上传数据]）。如果您在访问网站时有任何问题，请联系作者。

摘要

背景

轻度认知障碍（MCI）是介于正常衰老和包括阿尔茨海默病在内的痴呆之间的一种中间状态。早期检测痴呆症和MCI是二级预防的关键问题。血液生物标志物检测是早期检测MCI的一种可能方法。尽管疾病生物标志物通常通过单分子分析（如t检验）进行检测，但另一种可能的方法是基于分子之间的相互作用。

结果

在病例/对照研究中，对30名年龄组和赛马组对照组以及23名日本MCI患者的血浆microRNA（miRNA）表达谱进行了差异相关分析，以检测两个变量之间的相关性差异。选择由20对miRNAs组成的20对miRNA作为MCI标记。20对miRNAs中的两对（hsa-miR-191和hsa-miR-101，以及hsa-miR103和hsa-miR-222）在MCI检测曲线（AUC）值0.962下达到最高面积。其他两个miRNA对，包括hsa-miR-191和hsa-miR-125b，也获得了≥0.95的高AUC值。对MCI标记进行通路分析，以进一步了解其生物学意义。因此，hsa-miR-191的相关性减弱和hsa-miR-125b的相关性出现可能在MCI和痴呆进展中起关键作用。

结论

差异相关分析是一种生物信息学工具，用于阐明疾病背后复杂且相互依赖的生物系统，可检测单分子分析（如t检验）无法找到的有效MCI标记。

电子辅助材料

本文的在线版本（doi:10.1186/s40364-016-0076-1）包含对授权用户可用的补充材料。

关键词：分子网络、共表达、阿尔茨海默病、痴呆

背景

早期发现痴呆症是二级预防的关键问题。轻度认知障碍（MCI）是介于正常衰老和痴呆（包括阿尔茨海默病）之间的一种中间状态[1–三]。平均而言，超过一半的MCI患者在5年内转化为痴呆，但随着时间的推移，一些MCI患者保持稳定或恢复正常[三–5]。这就是为什么早期检测和治疗MCI极其重要的原因。

血液生物标记物可用于MCI的早期检测。本研究基于这样的假设，即神经突起和突触破坏是AD早期、其他神经退行性疾病和MCI综合征的病理过程特征，可以通过定量分析血液中富含脑细胞的microRNA（miRNA）在体外检测到[6]。MiRNAs是一类内源性小分子非编码RNA，通过与靶mRNAs的3'非翻译区结合，介导蛋白质编码基因的转录后调控，导致翻译抑制或mRNA失稳或降解[7,8]。总的来说，整个人类miRNA调节超过60%的所有蛋白编码基因[9]。重要的是，无细胞miRNA已被证明在血液样本中是稳定的[10]miRNA的异常调节在癌症和神经退行性疾病的病理事件中起着重要作用[11–13].

检测疾病生物标志物的常用统计方法是差异表达分析，通常基于对照组和患者之间的t检验[14]。通过差异表达分析检测了AD的血清和血浆miRNA生物标记物[15,16]。尽管差异表达分析是一种单分子分析，但另一种可能的方法是基于分子之间的相互作用。这种基于分子间相互作用的方法可以检测到更稳定和准确的生物标记物，因为这种相互作用是无阵列和无kit的：平均值的差异很容易受到绝对表达值的微小变化的影响，但基于相互作用的方法在这种变化中可能是稳健的。差异相关分析（Differential co-expression analysis[17,18])这是一种基于交互作用的方法，根据对照组和患者之间的相关性变化，发现不同类型的生物标记物。AD和癌症之间存在差异相关性[19,20].

本文对日本30名年龄匹配的对照组和23名MCI患者的血浆miRNA表达谱进行了差异相关分析。对检测到的MCI生物标记物进行通路分析，以进一步了解MCI标记的生物学意义。

方法

参与者

本研究中使用的人类志愿者得到了日本国家老年医学和老年学中心伦理审查委员会（NCGG）和日本广崎大学医学院医学伦理委员会的批准。我们使用了在NCGG生物银行和Hirosaki大学医学院和医院采集的血样。在研究之前，获得了所有参与者或其家人的书面知情同意书。参与者的特点如表所示表1：1：参与者为30名年龄和种族匹配的对照组（正常，12名男性和18名女性，平均年龄70.4岁）和23名日本MCI患者（11名男性和12名女性，年均年龄72.8岁）。在NCGG中，健忘症MCI（MCI）是根据Petersen等人定义的标准诊断的[5].

表1

我们研究的参与者摘要。显示了小型心理状态检查（MMSE）的样本量、平均年龄和平均分数

等级		总计	男性	女性
年龄匹配的控件	#共个参与者	30	12	18
（诺纳尔）	年龄	70.4	69.3	71.1
	MMSE公司	28.6	28.9	28.4
MCI患者	#共个参与者	23	11	12
	年龄	72.8	70.8	74.6
	MMSE公司	24.3	24.6	24

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样品制备

根据制造商的说明，使用miRNeasy迷你试剂盒（Qiagen）从血浆中提取总RNA，并进行以下修改。血浆在冰上解冻，并在4°C微型离心机中以3000×g离心5分钟。200份的等分μ将每个样品的L血浆转移到一个新试管中μL含1.25的Qiazol混合物μ向血浆中添加g/mL MS2噬菌体RNA（罗氏应用科学公司）。混合试管并孵育5分钟，然后添加200μL氯仿。将试管混合，孵育2分钟，并在4°C微型离心机中以12000×g离心15分钟。将上层水相转移到新的微型离心管中，并添加1.5体积的100%乙醇。内容物彻底混合，750μ将L样品转移到收集管中的Qiagen RNeasy迷你旋转柱中，然后在15000×g室温下离心30秒。重复该过程，直到装载完所有剩余的样品。用700冲洗旋转柱μL Qiagen RWT缓冲液，在室温下以15000×g离心1分钟，然后用500再次冲洗μL Qiagen RPE缓冲液，室温下15000×g离心1分钟。一个冲洗步骤（500μL Qiagen RPE缓冲液）重复两次。将旋转柱转移到新的收集管中，并在室温下以15000×g离心2 min。将旋转柱转移到新的微量离心管中，并将盖子打开1分钟以使柱干燥。通过添加50洗脱总RNAμL无RNase水至旋转柱膜上，孵育1分钟，然后在室温下以15000×g离心1分钟。RNA储存在-80°C的冰箱中。

microRNA实时qPCR

对于逆转录，19.2μ总共使用了80 L RNA洗脱液μ使用miRCURY LNA™通用RT cDNA合成试剂盒（Exiqon）进行L反应。cDNA产物被稀释57.25倍（80μL cDNA反应+4500μL水）并在10中进行分析μ根据miRCURY LNA™通用RT microRNA PCR系统的协议进行L PCR反应；每个microRNA通过qPCR在microRNA Ready-to-Use PCR上进行一次分析，人类组I和组II，V2。以与其他样品相同的方式对不包括模板的反转录反应阴性对照进行分析和分析。扩增在LightCycler®中进行；384个孔板中的480个实时PCR系统（罗氏）。使用Roche LC软件（版本1.5）分析放大曲线，用于测定Cp（通过二阶导数法）和熔融曲线分析。

数据筛选

原始数据是从Light cycler 480软件中提取的。GenEx软件（Exiqon）用于数据过滤分析。任何分析数据值必须低于Cp<37或至少低于阴性对照值3 Cp才能纳入数据分析。未通过这些标准的数据被从任何进一步分析中删除。使用LinRegPCR软件计算扩增效率。扩增效率低于1.6的反应也被去除。将所有数据归一化为每个样品中检测到的分析平均值（-dCp=平均Cp[<37]–分析Cp）。然后我们在745个miRNA中采用了85个miRNAs（表（表2）2)在两种比较条件中的任何一种条件下，80%以上的样本中检测到，然后过滤掉低表达值（<20%）。

表2

本研究中有85个miRNAs

hsa-let-7b	hsa-miR-142-5p	hsa-miR-186	hsa-miR-24	hsa-miR-374b
hsa-let-7d*	hsa-miR-143	hsa-miR-18a	hsa-miR-25	hsa-miR-378
hsa-let-7f型	hsa-miR-144	hsa-miR-191	hsa-miR-26a	hsa-miR-423-3p
hsa-let-7g	hsa-miR-145	hsa-miR-192	hsa-miR-26b	hsa-miR-423-5p
hsa-let-7i	hsa-miR-146a	hsa-miR-197	hsa-miR-27a	hsa-miR-424
hsa-miR-101	hsa-miR-148a	hsa-miR-1979	hsa-miR-27b	hsa-miR-425
hsa-miR-103	hsa-miR-148b	hsa-miR-199a-3p	hsa-miR-29a	hsa-miR-425*
hsa-miR-106a	hsa-miR-150	hsa-miR-199a-5p	hsa-miR-29c	hsa-miR-451
hsa-miR-107	hsa-miR-151-3p	hsa-miR-19b	hsa-miR-30b基因	hsa-miR-484
hsa-miR-122	hsa-miR-151-5p	hsa-miR-20a	hsa-miR-30c	hsa-miR-486-5p
hsa-miR-125b	hsa-miR-152基因	hsa-miR-21	hsa-miR-30e	hsa-miR-505
hsa-miR-126	hsa-miR-15a	hsa-miR-22	hsa-miR-320a基因	hsa-miR-590-5p
hsa-miR-126*	hsa-miR-15b	hsa-miR-221	hsa-miR-320b	hsa-miR-652
hsa-miR-139-5p	hsa-miR-16	hsa-miR-222	hsa-miR-324-3p	hsa-miR-92a
hsa-miR-140-3p	hsa-miR-17	hsa-miR-223	hsa-miR-335	hsa-miR-93
hsa-miR-140-5p	hsa-miR-181a	hsa-miR-23a	hsa-miR-338-3p	hsa-miR-99a
hsa-miR-142-3p	hsa-miR-185	hsa-miR-23b基因	hsa-miR-342-3p	hsa-miR-99b

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微分相关分析

通过差异相关分析可以找到有效的MCI标记物，该分析调查了两类对照组和MCI患者之间相关系数的差异。在我们研究的差异相关分析中，所有可能的miRNA对都是根据两个相关系数的差异进行排序的

|第页₁ − 第页₂|,

1

哪里第页 ₁,第页 ₂分别是对照组和MCI患者的miRNA对的Spearman秩相关性。MiRNA配对得分高(1)是MCI标记的候选。

我们研究中的微分相关分析还提供了对-一对miRNAs的值作为相关系数差异的统计显著性的参考。为此，标准化秩相关[21,22],第页 _n个，用作稳健的Pearson型相关系数：

\begin{array}{lcr} {第页}_{n个} = \frac{\sum_{我} Φ^{- 1} {{R（右）}_{我} / (n个 + 1)} Φ^{- 1} {问_{我} / (n个 + 1)}}{\sum_{我} {[Φ^{- 1} {我 / (n个 + 1)}]}^{2}}, \end{array}

2

哪里Φ是标准正态分布的分布函数R（右） _我和问 _我是表达式值的等级x个 _我和年 _我分别为两个miRNAs。在我们的研究中，归一化秩相关的值第页 _n个与Spearman秩相关非常相似：在我们的数据集中，所有miRNA对的归一化秩相关和Spearman的秩相关之间的差异平均值只有0.001。然后根据中的似然比检验应用假设检验来研究两个归一化秩相关系数的相等性[23,24]。这个对-值可以通过假设检验来计算。我们使用斯皮尔曼秩相关对相关系数进行差分计算(1)并将归一化秩相关用于对-价值计算。

对miRNA对作为MCI标记物的性能的评估不是直接的。在这里，我们对带有两个miRNAs相互作用项的logistic回归应用了受体-算子特征（ROC）分析：

\begin{array}{lcr} 日志 \frac{对}{1 - 对} = β_{0} + β_{1} {X（X）}_{1} + β_{2} {X（X）}_{2} + β_{12} {X（X）}_{1} {X（X）}_{2} \end{array}

三

哪里对是样本处于MCI类的概率，β ₀,β ₁,β ₂,β ₁₂是回归系数和X（X） ₁,X（X） ₂分别是两个miRNA的表达值。相互作用项β ₁₂ X（X） ₁ X（X） ₂对于评估通过差分相关分析检测到的两个miRNA至关重要。如果X（X） ₁和X（X） ₂在控件和MCI类之间发生改变，则交互项显著影响MCI与控件的区分。曲线下面积（AUC）值（=0至1）通过基于估计概率的ROC分析进行估计 ${\hat{对}}_{1}, 。。。。, {\hat{对}}_{n个}$ 所有对照组和MCI患者的样本。如果对照组和MCI患者的估计概率相差很大（例如。， $\hat{对} < 0.5$ 用于控件和 $\hat{对} > 0.5$ 对于MCI患者），则AUC值将为1（完全分离）。为了评估几对miRNA作为MCI标记物的性能，可以使用具有多个相互作用项的逻辑回归：

\begin{matrix} 日志 \frac{对}{1 - 对} & = β_{0} + β_{1} {X（X）}_{1} + β_{2} {X（X）}_{2} + \dots \\ + β_{k个} {X（X）}_{k个} + \sum_{(我, j个) \in C类} β_{ij公司} {X（X）}_{我} {X（X）}_{j个} \end{matrix}

4

哪里C类是一组在对照组和MCI患者之间存在差异相关性的miRNA对。例如，四个miRNA对（miRNA 1-2、1-3、3-4和4-5）和五个miRNA可以合并到逻辑回归模型log中对/(1−对)=β ₀+β ₁ X（X） ₁+β ₂ X（X） ₂+β _三 X（X） _三+β ₄ X（X） ₄+β ₅ X（X） ₅+β ₁₂ X（X） ₁ X（X） ₂+β ₁₃ X（X） ₁ X（X） _三+β ₃₄ X（X） _三 X（X） ₄+β ₄₅ X（X） ₄ X（X） ₅，其中C类={相互作用项中的（1,2），（1,3），（3,4），（4,5）} $\sum_{(我, j个) \in C类} β_{ij公司} {X（X）}_{我} {X（X）}_{j个}$ ROC分析同时评估五种miRNAs作为MCI标记物的性能。

结果

微分相关分析

对30名对照和23名MCI患者的年龄匹配样本的85个miRNA数据集进行差异相关性分析（表（表11和和2）。2). 根据对照组和MCI患者之间相关系数的差异，对85个miRNAs中的3570个可能对进行排序。20对miRNAs的相关系数差异|第页 ₁−第页 ₂|>0.8，被选为区分MCI患者和对照组的生物标记物（表（表3）。三). 20对miRNA的AUC值为0.800±0.051，范围在0.718和0.880之间。图图11显示了通过正常和MCI之间的差异相关性选择的前五个miRNA对的散点图和ROC曲线（另请参阅附加文件1对于剩余的miRNA对）。图图22显示了20个miRNA对的相关网络。

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图1

通过差分相关分析选择的前五对miRNA的散点图和ROC曲线。左侧：正常，中部：MCI，赖特：ROC曲线

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图2

通过差分相关分析检测到的20个miRNAs的相关网络。每个箱用表中的字母表示miRNA表5。5例如，A:hsa-miR-191、B:hsa-mi R-590-5p、C:hsa-miR-125b、D:hsa-mii R-18a、E:hsa-mi-R-140-3p和F:hsa-miR-103。在正常和MCI中，10个miRNAs（A、B、E、F、G、J、K、N、P、R）和11个miRNA（C、D、H、I、L、M、N、O、Q、R、S、T）分别高度相关。上部：相关系数为的所有边|第页|>0.40.下部：相关系数为的边|第页|>0.40仅适用于表中差异相关的miRNA对表3。三.固体和虚线分别表示正相关和负相关

表3

通过正常和MCI之间的差异相关性检测到的20对miRNAs摘要。miRNA对根据相关系数的差异进行排序。20对miRNA的平均AUC值为0.800±0.051

排名	一对miRNAs		\|第页 ₁−第页 ₂\|	日志10	AUC公司	相关性	系数
				对-价值		正常(第页 ₁)	微控制器(第页 ₂)
1	hsa-miR-191	hsa-miR-590-5p	0.963	-3.76	0.880	0.764	-0.200
2	hsa-miR-125b	hsa-miR-18a	0.930	-3.55	0.733	-0.218	0.712
三	hsa-miR-140-3p	hsa-miR-191	0.921	-2.85	0.800	0.540	-0.381
4	hsa-miR-103	hsa-miR-19b	0.917	-3.56	0.797	0.776	-0.141
5	hsa-miR-192	hsa-miR-197	0.912	-3.61	0.867	-0.281	0.631
6	hsa-miR-191	hsa-miR-19b	0.911	-4.10	0.854	0.826	-0.085
7	hsa-miR-152	hsa-miR-191	0.892	-3.42	0.863	0.772	-0.121美元
8	hsa-miR-103	hsa-miR-590-5p	0.888	-3.24	0.749	0.614	-0.275
9	hsa-miR-191	hsa-miR-320a基因	0.873	-3.38	0.872	0.691	-0.182
10	hsa-miR-125b	hsa-miR-20a	0.871	-3.80	0.801	-0.090	0.781
11	hsa-miR-106a	hsa-miR-125b	0.869	-3.94	0.785	-0.083	0.786
12	hsa-miR-101	hsa-miR-103	0.865	-3.65	0.768	0.805	-0.060
13	hsa-miR-125b	hsa-miR-24	0.840	-3月42日	0.801	-0.073	0.768
14	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.831	-3.96	0.871	0.822	-0.009
15	hsa-miR-103	hsa-miR-222	0.828	-3.24	0.745	0.622	-0.207
16	hsa-miR-197	hsa-miR-378	0.820	-2.78	0.810	-0.234	0.586
17	hsa-miR-103	hsa-miR-223	0.815	-3.79	0.786	0.840	0.025
18	hsa-miR-125b	hsa-miR-223	0.815	-3.49	0.765	-0.015	0.800
19	hsa-let-7b	hsa-miR-125b	0.811	-3.75	0.718	-0.056	0.755
20	hsa-miR-125b	hsa-miR-484	0.801	-3.52	0.739	-0.078	0.723

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粗体：前五个miRNAs

20个miRNA对中所有两对的AUC值也通过使用(4). 表表44显示了190对可能的miRNAs中前10对的汇总。两个miRNA对（hsa-miR-191和hsa-miR-101，以及hsa-miR103和hsa-milR-222）在MCI检测中获得最高AUC值0.962（图。（图3）。三). 其他两个miRNA对包括hsa-miR-191和hsa-miR-125b也达到了≥0.95的高AUC值（表（表44).

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图3

ROC曲线基于通过差分相关分析选择的四个miRNAs（hsa-miR-191、hsa-miR101、hsa-miR-103和hsa-miR222）的miRNA的前两部分。四种miRNAs的AUC值最高，为0.962

表4

表中通过差分相关分析检测到的20对miRNA中前10对miRNA的汇总表3。三.miRNAs的两倍按AUC值排序

排名	AUC公司	原件	原件	两对miRNAs		相关性	系数
		排名*	AUC公司*			正常(第页 ₁)	MCI公司(第页 ₂)
1	0.962	14	0.871	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.822	-0.009
		15	0.745	hsa-miR-103	hsa-miR-222	0.622	-0.207
2	0.959	5	0.867	hsa-miR-192	hsa-miR-197	-0.281	0.631
		14	0.871	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.822	-0.009
三	0.958	6	0.854	hsa-miR-191	hsa-miR-19b	0.826	-0.085
		17	0.786	hsa-miR-103	hsa-miR-223	0.840	0.025
4	0.957	1	0.880	hsa-miR-191	hsa-miR-590-5p	0.764	-0.200
		17	0.786	hsa-miR-103	hsa-miR-223	0.840	0.025
5	0.957	14	0.871	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.822	-0.009
		16	0.810	hsa-miR-197	hsa-miR-378	-0.234	0.586
6	0.952	12	0.768	hsa-miR-101	hsa-miR-103	0.805	-0.060
		13	0.801	hsa-miR-125b	hsa-miR-24	-0.073	0.768
7	0.951	5	0.867	hsa-miR-192	hsa-miR-197	-0.281	0.631
		9	0.872	hsa-miR-191	hsa-miR-320a基因	0.691	-0.182
8	0.951	14	0.871	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.822	-0.009
		17	0.786	hsa-miR-103	hsa-miR-223	0.840	0.025
9	0.951	1	0.880	hsa-miR-191	hsa-miR-590-5p	0.764	-0.200
		15	0.745	hsa-miR-103	hsa-miR-222	0.622	-0.207
10	0.947	4	0.797	hsa-miR-103	hsa-miR-19b	0.776	-0.141
		14	0.871	hsa-miR-101	hsa-miR-191	0.822	-0.009

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^*：表中每对miRNA的原始秩和AUC表3。三粗体：前五个miRNAs

路径分析

我们对MCI中丢失和出现的相关网络进行了灵巧路径分析（IPA）。数字图44和和55通过IPA显示10和11个miRNAs上的估计网络，它们分别在正常和MCI中高度相关。IPA显示，正常人中10个高度相关的miRNA由围绕Akt、IGF1、PPARA、IL6和AGO2基因的网络组成。IPA显示TP53基因直接调控MCI中所有11个高度相关的miRNAs。表中显示了正常/MCI中10/11高度相关miRNAs靶基因富集的途径表66和和77.

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图4

通过IPA对正常人10个高度相关的miRNAs进行网络估计。基因/miRNAs直接(实心箭头)和间接(虚线箭头)与他们互动

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图5

通过IPA对11个高度相关的miRNAsin MCI进行网络估计。基因/miRNAs直接(实心箭头)和间接(断开的箭头)与他们互动

表6

正常人10个高度相关miRNAs靶基因富集的途径

#KEGG途径	对-价值	#基因	#微小RNA
1癌症途径（hsa05200）	2.13 ×10⁻¹⁹	101	9
2前列腺癌（hsa05215）	3.39 ×10⁻¹⁷	35	9
3 PI3K-Akt信号通路（hsa04151）	1.92 ×10⁻¹⁵	94	9
4 mTOR信号通路（hsa04150）	6.11 ×10⁻¹⁴	27	9
5胰岛素信号通路（hsa04910）	1.18 ×10⁻¹³	46	8
6子宫内膜癌（hsa05213）	4.34 ×10⁻¹³	22	9
7泛素介导的蛋白水解（hsa04120）	6.03×10⁻¹³	46	10
8焦点粘附（hsa04510）	5.48 ×10⁻¹²	60	9
9非小细胞肺癌（hsa05223）	5.16 ×10⁻¹⁰	21	8
10 Hedgehog信号通路（hsa04340）	6.68×10⁻¹⁰	20	7

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表7

MCI中11个高度相关miRNA靶基因富集的途径

#KEGG途径	对-价值	#基因	#微小RNA
1 MAPK信号通路（hsa04010）	1.81 ×10⁻¹³	79	11
2细胞内吞（hsa04144）	5.43 ×10⁻¹²	63	10
3 TGF-β信号通路（hsa04350）	5.43 ×10⁻¹²	31	10
4 PI3K-Akt信号通路（hsa04151）	3.88 ×10⁻¹⁰	91	11
5癌症途径（hsa05200）	4.62 ×10⁻¹⁰	92	11
6神经营养素信号通路（hsa04722）	5.66 ×10⁻⁸	38	11
7前列腺癌（hsa05215）	6.03 ×10⁻⁸	30	10
8泛素介导的蛋白水解（hsa04120）	1.37 ×10⁻⁷	41	11
9 ErbB信号通路（hsa04012）	5.11 ×10⁻⁷	29	10
10乙型肝炎（hsa05161）	6.96 ×10⁻⁷	41	11

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T试验

对30名对照组和23名MCI患者的年龄匹配样本进行85个miRNAs的相同数据集的传统t检验（表（表11和和2）。2). 有关详细信息，请参阅附加文件285种miRNA中的22种被检测为MCI标记（表（表55和其他文件2). 22个miRNAs的AUC值分别为0.784±0.017，范围在0.748和0.828之间。重要的是，与t检验相比，差异相关分析检测到差异较大且更敏感的MCI标记（表（表5）：5)：平均AUC值=0.800±0.051（差异相关分析），=0.784±0.017（t检验）。此外，22个miRNA中任意四个miRNA的最高AUC值（附加文件中的图42)在差分相关分析中，小于同时研究三到四个miRNAs性能的两对方法中的最高值。

表5

Left检测的两组miRNAs：差异相关分析和Right:t检验

微分相关				t检验
20个miRNA				22个miRNA
答：	hsa-miR-191	左侧：	hsa-miR-20a	hsa-miR-151-3p	hsa-miR-15b
B类：	hsa-miR-590-5p	男：	hsa-miR-106a	hsa-miR-126*	hsa-let-7d*
抄送：	hsa-miR-125b	编号：	hsa-miR-101	hsa-miR-23a	hsa-miR-197
医生：	hsa-miR-18a	O：	hsa-miR-24	hsa-miR-27b	hsa-miR-30b
电子邮箱：	hsa-miR-140-3p	对：	hsa-miR-222	hsa-miR-146a	hsa-miR-185
F：	hsa-miR-103	问：	hsa-miR-378	hsa-miR-30c	hsa-miR-191
德国：	hsa-miR-19b	回复：	hsa-miR-223	hsa-miR-151-5p	hsa-miR-26b
高：	hsa-miR-192	学生：	hsa-let-7b	hsa-miR-23b	hsa-miR-223
我：	hsa-miR-197	电话：	hsa-miR-484	hsa-miR-92a	hsa-miR-26a
记者：	hsa-miR-152			hsa-miR-24	hsa-miR-16
克：	hsa-miR-320a基因			hsa-miR-144	hsa-let-7f

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粗体：每次分析中排名前五的miRNAs

下划线：左右两侧的miRNA相同

图中使用了左侧的字母。图22

讨论

通路分析（IPA）使我们能够进一步了解检测到的20对微RNA MCI标记对的生物学意义。验证研究和基于大脑的以往研究可以支持差异相关分析和IPA的结果。

IPA显示，正常人中10个高度相关的miRNA由围绕Akt、IGF1、PPARA、IL6和AGO2基因的网络组成（图。（图4）。4). Akt、IGF1和Irs3是胰岛素信号通路中的关键分子，PPARA是脂代谢的调节器。此外，胰岛素、mTOR和PI3K-Akt信号通路在DIANA-miRPath分析的前5位信号通路中排名，该通路通过DIANA-microT-CDS预测miRNA靶点，并将其相互作用结合到KEGG通路中（表（表6）。6). 除miR-191外，这些通路包括9个miRNAs的靶基因。先前的研究一致报道，AD患者或AD模型中已鉴定的生物标志物、改变的基因和网络参与了胰岛素相关的信号传导[8,25,26]。事实上，实验验证的证据支持miR-103a-3p、miR-320a和miR-590-5p在代谢途径中的关键作用[27,28]miR-103a-3p与AD的相关性[29–31]。在图中。图2，2，我们发现miR-103a-3p和miR-191是Normal中12对相关边缘的中心miRNAs。miR-191也是癌症、2型糖尿病和AD等疾病的广泛使用的生物标记物[32]。考虑到miR-191在MCI中的显著上调（t检验），这些发现假设MCI阶段失去了miRNA相关性，这是miR-191和胰岛素相关信号传导成员之间表达平衡改变的原因和/或影响。失去相关性可能成为MCI的鉴别标志。

MCI患者血浆中有一个新出现的与中枢miRNA miR-125b相关的网络。IPA显示，TP53基因直接调节MCI中所有11个高度相关的miRNA（图。（图5）。5). TP53最初被认为是一种肿瘤抑制剂，但最近报道了它在控制衰老和新陈代谢等疾病方面的作用[33]。已有大量研究表明，在AD患者大脑中观察到TP53蛋白的变化及其修饰和构象[34–36]还有血[37]。有趣的是，Le等人证明miR-125b与TP53 mRNA的3'非翻译区结合，并作为TP53的负调控因子[38]，这意味着可能存在负反馈回路。DIANA-miRPath的结果表明，MAPK、TGF-β和神经营养素信号通路在MCI中具有特征性，尽管在正常和MCI中存在重叠的通路（表（表7）。7). 与TP53信号通路类似，这些通路具有共同的生物学功能，如细胞存活、细胞周期和凋亡。在本研究中，TP53功能的改变可能被检测为下游miRNAs产生的新相关性。

这项研究的重点是MCI的生物标志物检测，而不是大脑如何产生血浆miRNAs的机制。然而，基于大脑的研究也支持hsa-miR-191和hsa-125b作为MCI标记物的可靠性。例如，miR-191的表达变化是维持小鼠海马体脊柱重建所必需的[39]和miR-125b对小鼠海马神经元树突状棘形态和突触生理的影响[40]已经证明MCI和AD是突触衰竭[41–43].

总之，hsa-miR-191的相关性减弱和hsa-miR-125b的相关性出现可能在MCI和痴呆进展中起关键作用。

结论

对30名年龄和种族匹配的对照组和23名日本MCI患者的血浆miRNA表达谱进行差异相关分析，以检测病例/对照研究中相关性的差异。选择20对miRNA作为MCI的生物标记物。20个miRNAs更敏感，与t检验结果不同。

通路分析表明，尤其是hsa-miR-191的相关性减弱和hsa-miR-125b的相关性增强可能在MCI和痴呆进展中起关键作用。差异相关分析检测有效的MCI标记，这些标记无法通过单分子分析（如t检验）找到。此外，差异相关分析可以成为一种关键的生物信息学工具，用于发现敏感的生物标记物并阐明疾病背后的复杂生物系统。

致谢

不适用。

基金

这项工作得到了日本国立生物医学创新研究所健康科学基础研究促进计划（10-43和10-44）、日本国立老年医学和老年学中心长寿科学研究基金（23-9和26-20）的部分支持，和日本科学促进会KAKENHI#24700290。

数据和材料的可用性

数据可从NCGG生物银行（医学基因组中心，http://www.ncgg.go.jp/mgc/index.html[准备上传数据]）。如果您在访问网站时有任何问题，请联系作者。

作者的贡献

MK、SH、KM、EM、OT和SN设计了这项研究。MK、SH、KM和EM进行了分析。MK和SH写了手稿。JS、OT和SN对手稿的批判性审查做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终手稿。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版同意书

不适用。

道德批准和参与同意

本研究中使用的人类志愿者得到了日本国家老年医学和老年学中心伦理审查委员会（NCGG）和日本广崎大学医学院医学伦理委员会的批准：参考号443-6（2015年2月26日批准），2008–116（2008年11月28日批准）。我们使用了在NCGG生物库和广崎大学医学院和医院收集的血液样本。在研究之前，获得了所有参与者或其家人的书面知情同意。

缩写

广告	老年痴呆症
s病；AUC公司	（ROC）曲线下面积
投资促进机构	创意途径分析
MCI公司	轻度认知障碍
微小RNA	微小RNA
MMSE公司	小型精神状态检查
NCGG公司	国家老年医学和老年病学中心
世界车王争霸赛	接收器-操作器特性

其他文件

附加文件1^{（63K，pdf格式）}

补充A.通过正常和MCI之间的差异相关分析选择的前20对miRNAs的散点图和ROC曲线。（PDF格式63.2 kb）

附加文件2^{（55K，pdf格式）}

补充B.t检验和结果的详细信息。结果包括基于在正常和MCI之间通过t检验选择的22个miRNA中的每一个的箱线图和ROC曲线。（PDF 55.1 kb）

工具书类

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文章来自生物标记物研究由以下人员提供BMC公司

应用差异相关分析检测轻度认知障碍的血浆微小RNA生物标志物

三森克亚诺

小久里·平崎（Sayuri Higaki）

佐藤俊一

松本贤治

Etsuro Matsubara公司

Osamu Takikawa先生

Shumpei Niida公司

关联数据

摘要

背景

结果

结论

电子辅助材料

背景

方法

参与者

表1

样品制备

microRNA实时qPCR

数据筛选

表2

微分相关分析

结果

微分相关分析

表3

表4

路径分析

表6

表7

T试验

表5

讨论

结论

致谢

基金

数据和材料的可用性

作者的贡献

竞争性利益

出版同意书

道德批准和参与同意

缩写

其他文件

工具书类