跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
EMBO J。2004年8月18日；23(16): 3216–3226.
2004年7月22日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7600333
预防性维修识别码：PMC514507型
采购管理信息：15272311

BNIP1参与细胞凋亡和内质网膜融合

中岛贤一,1 Hidenori Hirose公司,1,* 梅田口,1 仓下博文,1 小平荒崎,1 长滨正美,1 卡佐科·塔尼（Katsuko Tani）,1 山本昭一,2和田谷光雄1,一
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

BNIP1是BH3-only蛋白家族的一员，首次被发现是能够与抗凋亡腺病毒E1B 19-kDa蛋白相互作用的蛋白之一。在这里，我们发现了一个完全出乎意料的发现，BNIP1是包含突触蛋白18的复合物的一个成分，突触蛋白是一种位于内质网（ER）的可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）附着蛋白（SNAP）受体（SNARE）。功能分析表明，BNIP1参与了内质网结构的形成，但不参与内质网和高尔基之间的膜运输。值得注意的是，BNIP1的BH3结构域中一个高度保守的亮氨酸残基不仅在诱导凋亡中起重要作用，而且在α-SNAP的结合中也起重要作用。这预示着α-SNAP可能通过与BNIP1的BH3结构域的抗凋亡蛋白竞争来抑制凋亡。事实上，α-SNAP的过度表达显著延缓了staurosporine诱导的细胞凋亡。我们的结果揭示了明显独立的细胞事件、凋亡和ER膜融合之间可能存在的串扰。

关键词：α-SNAP、凋亡、BH3结构域、内质网、膜融合

介绍

内质网是真核细胞内最大的膜系统，由膜小管、片状结构和片层组成的网状网络组成(Baumann和Walz，2001年;沃尔茨等, 2002). 内质网膜分化为几个形态和功能不同的区域，如核膜和粗糙光滑的区域。尽管结构复杂，内质网是一个高度动态的细胞器。在有丝分裂过程中，它在子细胞之间被分割，亚结构域被重建。即使在间期，新的膜小管也会不断产生，并与其他小管融合，以微管依赖的方式形成三向连接(Lee和Chen，1988年;Allan和Vale，1991年;德雷尔和拉波波特，2000年;李平科特-施瓦茨等, 2000).

内质网具有许多不同的功能，包括跨膜蛋白的转运、分泌蛋白和膜蛋白的折叠、修饰和输出、从内质网逃逸出来的内质网受体蛋白的回收、应激反应、脂质合成和钙2+存储。尽管已经对每个函数进行了详细的研究，但到目前为止，对不同函数之间的串扰的研究还很差。ER的不同功能如何以及在多大程度上相互关联是完全未知的。然而，必须有机制允许ER管理其多功能。事实上，Brown、Goldstein及其同事的一项开创性工作已经证明了应激反应与内质网膜结合转录因子ATF6的输出之间的联系(Ye（是）等, 2000).

最近，内质网已成为参与凋亡细胞死亡的细胞器，尽管众所周知线粒体是这一过程的核心(布雷肯里奇等2003年a;库瓦纳和纽梅耶，2003年;Thomenius和Distelhorst，2003年). 抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL（左）和促凋亡蛋白Bax和Bak分别位于内质网和线粒体中，并抑制和启动凋亡(克拉耶夫斯基等, 1993;Ng和Shore，1998年;哈基等, 2000;宗等, 2003). 这些蛋白似乎通过影响ER-Ca来调节细胞凋亡2+贮存：Bcl-2可以减少ER-Ca的释放池2+而Bax和Bak的行为则相反(福尤兹-优素福等, 2000;平通等, 2000;螺母等, 2002;斯科拉诺等, 2003). 除了Bax和Bak，促凋亡BH3-only蛋白家族的成员(布伊莱特和斯特拉瑟，2002年)，如BNIP1(博伊德等, 1994)和spike(穆德等, 2003)，位于ER中。

在这里，我们发现了一个完全出乎意料的发现，BH3-唯一蛋白BNIP1是合成蛋白18复合体的一个组成部分，合成蛋白18是内质网膜上的膜融合机制。功能分析表明，BNIP1是维持内质网完整性所必需的。重要的是，负责诱导细胞凋亡的BNIP1的BH3结构域为α-可溶性N个-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）附着蛋白（α-SNAP），增加了BNIP1在细胞凋亡和膜融合之间的串扰中发挥关键作用的可能性。

结果

BNIP1与酵母Sec20p具有序列相似性

膜融合通过囊泡相关SNAP受体（v-SNARE；VAMP家族）和靶膜相关SNARE（t-SNARE，syntaxin和SNAP-25家族）之间的特异性配对介导(韦伯等, 1998;Lin和Scheller，2000年;扬等, 2003). 我们最近从大鼠肝细胞膜中分离出一种syntaxin 18复合物，并测定了其亚单位组成(Hirose公司等, 2004). Syntaxin 18是一种位于内质网的SNARE，参与内质网和高尔基体之间的膜运输(Hatsuzawa公司等, 2000)，最有可能是酵母Ufe1p的直系同源物，它参与了ER同型融合(帕特尔等, 1998)以及从高尔基到ER的逆行运输(刘易斯和佩勒姆，1996年). 我们发现突触合蛋白18与包括ZW10（一种动粒相关蛋白）在内的几种蛋白质复合(陈等, 2000)，RINT-1（一种Rad50相互作用蛋白）(肖等, 2001)和p31（酵母Use1p/Slt1p的哺乳动物同源物）(贝尔格莱·图泽等, 2003;布里等, 2003;迪尔歇尔等, 2003). 已知酵母Ufe1p能结合Sec22p、Sec20p、Tip20p和Use1p/Slt1p(刘易斯等, 1997;布里等, 2003;迪尔歇尔等, 2003). 虽然在分离的结合蛋白18复合体中发现了假定的哺乳动物同源序列Sec22p、Tip20p和Use1p/Slt1p（分别为Sec22b、RINT-1和p31），但没有发现Sec20p的对应物(Hirose公司等, 2004).

为了确定可能的哺乳动物Sec20p同源物，我们搜索了NCBI数据库。搜索结果表明，BNIP1与Sec20p的序列相似性很低，但显著(图1A). BNIP1是一种ER-located BH3-only蛋白，是首次发现的能够与抗凋亡腺病毒E1B 19-kDa蛋白相互作用的蛋白之一(博伊德等, 1994). BNIP1的序列模体分析显示，存在一个N端假定的线圈区域、一个BH3结构域和一个Sec20p同源区域，其中包含t-SNARE模体，随后是一个C端跨膜结构域（TMD）(图1B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为7600333f1.jpg

BNIP1和Sec20p之间的序列相似性。(A类)相关蛋白质发现于智人（Hs.BNIP1），酿酒酵母（参见第20p节），葡萄裂殖酵母（参见CAA16989），白色念珠菌（约Sec20p），黑腹果蝇（图纸AAF51945）和拟南芥（位于BAB02931）。星形代表BNIP1和酵母Sec20p之间的相同氨基酸。(B类)BNIP1的域结构。恒星代表BH3结构域中高度保守的氨基酸残基。

BNIP1与syntaxin 18相关

与突触蛋白5和其他高尔基SNARE相比，突触蛋白18及其结合蛋白与酵母对应物的序列相似性相对较低(Hirose公司等, 2004). 结合BNIP1中t-SNARE基序的存在，这一事实鼓励我们探索BNIP1是syntaxin 18复合物的一个组成部分的可能性。首先，我们在293T细胞中表达FLAG标记的BNIP1，用Triton X-100溶解细胞，并使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀实验。如所示图2A第4车道，syntaxin 18与FLAG-BNIP1共沉淀。此外，α-SAP和突触合蛋白5的两种异构体，41kDa ER和34kDa高尔基体形式，也被共同沉淀。相比之下，其他高尔基SNARE如GS27/membrin和GS15或血浆膜定位的合成蛋白syntaxin 4没有共沉淀，这表明免疫沉淀的特异性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为7600333f2.jpg

BNIP1是syntaxin 18复合物的组成部分。(A类)用1μg的pFLAG-BNIP1（第2和第4道）或pFLAG（第1和第3道）转染293T细胞。24小时后，用Triton X-100裂解细胞，并用抗FLAG M2单克隆抗体和蛋白G珠免疫沉淀。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离免疫沉淀蛋白，并用所示抗体（3道和4道）进行免疫印迹分析。还分析了输入（占总输入的2.5%）（车道1和2）。星形表示免疫球蛋白轻链。注意，GS27没有与抗FLAG共沉淀。(B类)用对照IgG（第2道）或抗BNIP1抗体（第3道）免疫沉淀293T细胞裂解物。用所示抗体通过免疫印迹法分析共沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（车道1）。星形表示免疫球蛋白重链或轻链。(C类)293T细胞裂解物用对照抗体（第2道）或单克隆抗突触蛋白18抗体（克隆1E1）免疫沉淀（第3道）。用所示抗体通过免疫印迹法分析免疫沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（车道1）。

为了证实BNIP1与syntaxin 18的关联，我们针对一种缺乏TMD的细菌表达蛋白制备了抗BNIP1抗体。该抗体在几个细胞系中特异识别BNIP1(补充图1A)并且，与之前的结果一致(博伊德等, 1994)，将ER染色(补充图1B). 当293T细胞的Triton X-100提取物与抗BNIP1抗体孵育时，不仅syntaxin 18，而且RINT-1、ZW10、p31和Sec22b，所有这些都是已知的syntaxin18复合物的成分(Hirose公司等, 2004)，共免疫沉淀(图2B，车道3）。与过度表达BNIP1的免疫沉淀相比，syntaxin 5和α-SNAP均未与内源性BNIP1共沉淀。这可能意味着BNIP1与syntaxin 5或α-SNAP之间的相互作用相对较弱。在双向免疫沉淀实验中，BNIP1与单克隆抗咽炎素18抗体共沉淀(图2C，通道3），但不含对照抗体（通道2）。当使用1%胆酸盐或1%辛基葡萄糖苷制备细胞裂解物时，获得了类似的免疫沉淀结果（数据未显示）。这些结果明确证明BNIP1是syntaxin 18复合物的组成部分。由于BNIP1（～26 kDa）的分子量与免疫球蛋白轻链的分子量相似，因此在免疫亲和纯化的突触蛋白18结合蛋白的序列分析中，BNIP1的鉴定可能受到了免疫球蛋白轻链污染的阻碍(Hirose公司等, 2004).

SNARE能够形成络合物，在α-SNAP的帮助下，NSF催化ATP水解后，该络合物被分解(Söllner公司等, 1993). 这种分解被认为反映了膜融合后v-SNARE-t-SNARE复合体的分离(Lin和Scheller，2000年;扬等, 2003). 然而，在合成蛋白18复合物的情况下，包含RINT-1、ZW10和p31的亚复合物即使在与合成蛋白18分离后也不会被分解(广濑等, 2004). 为了检测BNIP1是否为亚复合物的组成部分，293T细胞裂解物在有利于SNARE复合物分解的条件下培养。与其他传统SNARE一样，BNIP1在α-SNAP-、NSF-和Mg中从syntaxin 18中释放2+-依赖ATP的方式(图3A，车道4），表明BNIP1和syntaxin 18之间的功能联系。此外，BNIP1确实与RINT-1、ZW10和p31分离，并伴随着syntaxin 18复合物（9巷）的分解。这表明BNIP1不是RINT-1/ZW10/p31子复合体的组件。使用抗p31和RINT-1抗体的类似免疫沉淀实验结果证实了这一结论(图3A，底部面板）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为7600333f3.jpg

BNIP1在有利于SNARE复合物分解的条件下与syntaxin 18及其结合蛋白分离。(A类)293T细胞裂解物在指定的条件下培养（NSF:10μg/ml；α-SNAP:5μg/ml，ATP:0.5 mM；MgCl2：8 mM）在16°C下培养60分钟。培养后，用抗syntaxin 18（1-4道）、BNIP1（6-9道）、p31（11-14道）或RINT-1（16-19道）的抗体对样品进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析沉淀蛋白。还分析了输入（占总输入的4%）（第5、10、15和20车道）。(B类)在诱使SNARE复合物分解的条件下未分离（顶面板）或培养（底面板）的293T细胞裂解物在12–48%甘油梯度上进行沉淀分析(Hirose公司等, 2004). 用所示抗体通过免疫印迹法分析每个组分。

为了获得BNIP1在与NSF介导的ATP水解相结合的过程中从RINT-1/ZW10/p31亚复合物中分离的另一系列证据，293T细胞裂解物未经培养或与α-SNAP、NSF和Mg-ATP孵育，然后进行甘油梯度沉降分析(图3B). 在未经培养的情况下，BNIP1在许多组分（上部面板）中广泛沉积，表明存在其自由形式（组分1-4）和复合形式（组份5-10）。第7–10组分的BNIP1可能代表与RINT-1、ZW10、p31和syntaxin 18复合的形式。在诱使SNARE复合物分解的条件下培养，导致所有BNIP1，如syntaxin 18，在对应于自由形式的部分沉积，而RINT-1、ZW10和p31仅轻微移动（底图）。后一个发现与RINT-1/ZW10/p31亚复合物与SNARE复合物的拆卸并不同时分离的观点一致。这些结果证实了免疫沉淀结果，即BNIP1在NSF介导的ATP水解后从亚复合物中分离。

我们之前的双杂交研究表明，RINT-1直接与ZW10相互作用，而两者都不与syntaxin 18或syntaxin18相互作用蛋白p31结合(Hirose公司等, 2004)提出了RINT-1/ZW10如何与syntaxin 18形成复合物的问题。因此，我们使用双杂交试验检测BNIP1是否与RINT-1或ZW10相互作用。结果总结如下表I发现BNIP1与RINT-1、syntaxin 18和α-SNAP相互作用。BNIP1和RINT-1之间的直接相互作用与它们的酵母对应物Sec20p和Tip20p物理相互作用形成稳定复合物的观察结果一致(Sweet and Pelham，1993年).

表1

BNIP1与syntaxin 18复合物中蛋白质的双杂交相互作用

Gal4 DNA结合域Gal4激活域β-半乳糖苷酶活性一
突触蛋白18BNIP1号机组+
α-捕捉BNIP1号机组+
α-SNAPBNIP1 L114A−
BNIP1号机组RINT-1系列b条+
BNIP1 L114ARINT-1系列+
ZW10型BNIP1号机组−
第31页BNIP1号机组−
如果滤镜在4小时内出现蓝色，则结果记录为阳性。
为了分析RINT-1和BNIP1之间的相互作用，将RINT-1的cDNA插入Gal4激活域的下游，因为其插入Gal4DNA-结合域的下游会发出无相互作用伙伴的阳性信号。

BNIP1过度表达导致内质网膜聚集

为了评估BNIP1的功能，我们首先研究了BNIP1过度表达细胞中的细胞器形态。如所示补充图2ABNIP1的过度表达导致HeLa细胞中ER蛋白、calnexin和prolyl 4-羟化酶的聚集。绿色荧光蛋白-细胞色素观察到类似的聚集模式b条5（GFP-b）5)这意味着观察到的聚集物代表聚集的内质网膜，而不是蛋白质聚集物。电子显微镜分析证实了这些免疫荧光观察结果：在BNIP1过度表达的细胞中，存在高度聚集的膜结构，偶尔有螺旋状的膜结构和相当完整的高尔基体结构(补充图2B). BNIP1过度表达细胞中的螺纹状结构让人联想到有组织的平滑内质网（OSER），众所周知，该内质网是在内质网相关膜蛋白过度表达后形成的，这些膜蛋白能够寡聚(捕捉等, 2003). 也许，BNIP1通过亲同相互作用连接ER膜而诱导ER聚集。

与内质网结构的这种剧烈变化相反，内质网出口位点（Sec23p）、高尔基体（GM130）、早期内体（EEA1）和线粒体（MitoTracker）的形态没有明显变化(补充图2C)表明BNIP1过度表达对膜结构的影响有限。

我们之前的研究表明，syntaxin 18的过度表达不仅导致内质网聚集，而且还导致内质网上膜交通的缺陷(Hatsuzawa公司等, 2000). BNIP1过度表达对内质网出口部位的形态学影响有限，高尔基体可能表明BNIP1不参与膜转运。为了验证这一想法，我们测量了VSVG-GFP的转运，这是一种包含GFP和水泡性口炎病毒编码糖蛋白（VSVG）的嵌合蛋白，其从内质网以温度依赖的方式输出(普雷斯利等, 1997). 如所示补充图3，在BNIP1过表达的细胞中，没有观察到VSVG-GFP通过高尔基体从内质网到质膜的运输显著延迟。

ER网络的组织需要BNIP1

BNIP1的过表达诱导内质网聚集，但不影响包括高尔基体在内的其他细胞器的形态，这一发现可能表明BNIP1参与了内质网膜融合。为了验证这一想法，我们通过RNA干扰（RNAi）降低了BNIP1的表达，并检查了活HeLa细胞中的ER网络结构。与固定细胞相比，活细胞分析使我们能够更清楚地检测ER网络结构中的细微变化。先前的一项研究表明，抑制内质网膜融合会导致内质网三向连接的丧失(内山等, 2002). 免疫印迹法检测到，小干扰RNA（siRNA（155-175））成功地抑制了BNIP1的表达(图4A)和免疫荧光分析(图4B). 随着BNIP1表达减少，HeLa细胞某些区域的网状内质网结构解体，而线粒体似乎相当完整(图4C和补充图4). 这种影响很可能是由于BNIP1表达水平降低，因为当细胞转染时，没有siRNA（模拟处理）或低效率RNA双链（siRNA（532-552）），ER结构没有明显变化。定量分析表明，与对照细胞相比，BNIP1缺失细胞中的三向连接数量减少了约50%(图4E).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为7600333f4.jpg

BNIP1功能丧失导致ER网络中断。GFP-b5-表达HeLa细胞(A类)或非表达细胞(B类)在没有（模拟处理）或低效RNA双链（siRNA（532-552））或高效RNA双链的情况下转染，并孵育24小时。免疫印迹（A）和免疫荧光显微镜分析（B）显示，转染siRNA的细胞中BNIP1表达显著降低（155-175）。(C类)如上所述进行转染。研究了活细胞的内质网形态。方框区域的放大图像显示在右侧。棒材，10μm。(D类)微量注射对照IgG或BNIP1抗体，并研究活细胞的内质网形态。棒材，10μm。(E类)ER的三向接头数量的量化。

为了获得维持ER网络结构需要BNIP1的另一系列证据，我们微量注射了抗BNIP1抗体。如所示图4D和补充图5注射抗BNIP1抗体导致ER网络解体，尤其是在细胞外围。这种模式与BNIP1缺失细胞中观察到的模式相似(图4C). 在微注射抗体的细胞中，三向连接的数量也减少了约50%(图4E). 总之，功能分析的结果强烈表明，BNIP1与内质网的组织有关，可能是通过介导内质网膜融合。

BNIP1的BH3域是绑定α-SNAP（快照）

BNIP1是一种促凋亡蛋白，也是syntaxin 18复合物的组成部分，这一事实提出了一种有趣的可能性，即该蛋白介导凋亡和膜融合之间的串扰。为了解决这种可能性，我们制作了一系列BNIP1构建物，每个构建物在BH3结构域都有一个点突变，并检测了它们与合成蛋白18及其结合蛋白的相互作用。如所示图5A，lane 19，L114A突变体，其中Leu-114是BH3结构域中最保守的氨基酸残基之一(图1B)，被Ala取代，不结合α-SNAP。酵母双杂交试验(表I)和GST下拉实验(图5B，通道9和10）证明BNIP1与α-SNAP直接相互作用，Leu-114对结合至关重要。除α-SNAP外，L114A突变结合RINT-1、ZW10、syntaxin 18和p31的效率与野生型BNIP1相同(图5A). L115A突变体也显示出α-SAP结合活性降低（泳道21）。然而，其他结构体在BH3结构域结合的α-SNAP处发生点突变，其程度与野生型BNIP1相似。为了消除L114A突变体在DNA操作过程中意外获得第二次突变的微小可能性，我们通过定点诱变产生了回复子。回复体结构结合α-SNAP的程度与野生型BNIP1（车道20）几乎相同。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为7600333f5.jpg

BH3结构域中的Leu-114是α-SNAP结合所必需的。(A类)用编码野生型BNIP1和所示BH3结构域突变体的pFLAG构建物转染生长在六孔板上的293T细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗FLAG抗体免疫沉淀FLAG标记蛋白。用SDS-PAGE分离免疫沉淀蛋白，并用所示抗体进行免疫印迹分析（下表）。还分析了输入（占总输入的4%）（上面板）。(B类)纯化GST（1号道）、GST-BNIP1野生型（2号道）和GST-BNIP 1 L114A（3号道）及His的考马斯染色6-α-SNAP（车道4）。伊斯6-α-SNAP（1μg）与GST、GST-BNIP1野生型或GST-BNIP 1 L114A（各1μg，4°C）孵育60分钟。用谷胱甘肽珠拖出GST融合蛋白。通过SDS–PAGE分离下拉蛋白，并使用针对His标签和GST的抗体进行免疫印迹分析（通道8–10）。还分析了输入（总计4.5%）（5-7车道）。星形代表假定的降解产物。

先前的研究表明，BNIP1 BH3结构域的缺失会导致凋亡诱导活性的大量丧失(安田和钦纳杜赖，2000年). 为了确定Leu-114对凋亡诱导活性是否重要，我们研究了L114A突变体抑制MCF-7细胞集落形成的能力。与之前的观察一致，BNIP1表现出相对较弱的促凋亡活性(安田和钦纳杜赖，2000年)，用野生型BNIP1质粒转染显著抑制了集落形成，但比用Bad质粒转染效率低，Bad是另一种仅BH3蛋白(布伊莱特和斯特拉瑟，2002年;Marsden和Strasser，2003年). 与野生型BNIP1相比，L114A突变体对菌落形成的抑制作用较小(图6A). 免疫印迹显示，野生型BNIP1和L114A突变体的表达水平相当，排除了突变体的低凋亡诱导活性可能是由于其在细胞中的表达效率低。在HeLa细胞中瞬时表达野生型BNIP1和L114A突变体的实验证实了Leu-114对凋亡诱导活性的重要性。L114A突变体促进细胞凋亡的效率很低(图6B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为7600333f6.jpg

Leu-114对凋亡诱导活性很重要。(A类)BNIP1和L114A突变体对菌落形成的抑制。用所示质粒转染MCF-7细胞。细胞在0.8 mg/ml G418存在下培养2周，固定，用Giemsa溶液染色并计数。免疫印迹显示野生型BNIP1（第2道）和L114A突变体（第3道）的表达相同。通道1中的带代表内生BNIP1。(B类)用GFP（对照）或FLAG标记蛋白的质粒转染HeLa细胞。转染后24小时，用Hoechst 33342观察细胞核形态，以计数活细胞和凋亡细胞的数量。测定表达GFP、野生型BNIP1、L114A突变体或Bad的细胞中凋亡细胞的百分比。使用抗FLAG抗体的免疫印迹显示野生型BNIP1（泳道1）、L114A突变体（泳道2）和Bad（泳道3）的等效表达。

的过度表达α-SNAP延缓staurosporine诱导的细胞凋亡

BNIP1的BH3结构域同时具有促凋亡活性和α-SNAP结合，这一发现促使我们询问α-SNAP的过度表达是否通过阻止BNIP1与抗凋亡蛋白结合来抑制凋亡。为此，我们建立了一种Tet-on-HeLa细胞系，该细胞系可以以多西环素依赖的方式表达血凝素（HA）标记的α-SAP。诱导HA-α-SNAP表达后48 h，用1μM staurosporine孵育细胞3.5 h，诱导细胞凋亡，并通过DNA染色和caspase-3活化试验监测细胞死亡。尽管这种凋亡刺激诱导了大多数对照细胞的死亡，但许多α-SNAP表达细胞存活了下来(图7A). 定量分析表明，只有10-17%的α-SNAP表达细胞在65-90%的非表达细胞死亡的情况下死亡(图7B). 与DNA染色法相比，使用蛋白酶-3激活法测定凋亡细胞的百分比较低，这可能是因为前者的灵敏度较低。时间进程分析显示，α-SNAP过度表达并不能完全抑制staurosporine诱导的凋亡，而是延缓其发生。超过65%的α-SNAP-表达细胞在staurospirine治疗7小时后死亡。当使用内质网应激诱导剂衣霉素时，也观察到α-SNAP的保护作用（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为7600333f7.jpg

α-SNAP过度表达可延缓细胞凋亡。(A类)HeLa-Tet-on细胞生长在盖玻片上，用1μg/ml多西环素诱导蛋白质表达。诱导后48 h，用1μM staurosporine处理细胞3.5 h。对于Tet-On HeLa/HA-α-SNAP细胞，用抗HA抗体固定细胞，然后用荧光素异硫氰酸标记的二级抗体孵育细胞。分别用Hoechst 33342和活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体观察细胞核形态和活性形式的半胱氨酸蛋白酶-3。箭头和箭头分别表示表达异位蛋白的细胞中的活细胞和凋亡细胞。注意，并非所有细胞都表达α-SNAP。这使我们能够确定在相同条件下，非表达或表达α-SNAP的细胞中凋亡细胞的百分比。棒材，20μm。(B类)表达异位蛋白的细胞凋亡的时间进程。通过Hoechst 33342染色（左侧）或caspase-3激活（右侧）评估细胞凋亡。NE代表非表达细胞。(C类)用编码FLAG-标记的BNIP1野生型、L114A突变体或Bad的pTRE质粒转染诱导α-SNAP表达40 h的HeLa-Tet-on细胞。在1μg/ml多西环素存在下转染后16 h，用1μM staurosporine处理细胞1.5 h。固定细胞，用Hoechst 33342观察细胞核形态。

由于凋亡途径涉及许多蛋白质-蛋白质相互作用，与信号通路无关的蛋白质如α-SNAP的过度表达可能通过以非特异性方式阻止蛋白质-蛋白质的相互作用来阻止凋亡。为了排除这种可能性，我们检测了ZW10和细胞色素过度表达的影响b条5细胞凋亡。前者和BNIP1是syntaxin 18复合物的组成部分(Hirose公司等, 2004)后者与BNIP1一样，是内质网整合膜蛋白。两种蛋白以Tet-on方式表达为GFP融合蛋白，staurosporine诱导细胞凋亡。如所示补充图6，许多GFP-b5-表达GFP-ZW10的HeLa细胞在与staurosporine孵育3.5小时期间死亡。定量数据显示GFP-b中细胞死亡的程度5-表达GFP-ZW10的HeLa细胞与不表达GFP-ZW10细胞相当(表二)这意味着α-SNAP过度表达对细胞凋亡的影响具有特异性。

表2

α-SAP过表达对细胞凋亡的抑制作用

表达式无HA-α-SNAP绿色荧光蛋白-b5GFP-ZW10型
凋亡细胞（%）一80.1±9.217.4±4.279.3±4.877.4±10.2
Tet-on HeLa/HA-α-SNAP、Tet-on HeaLa/GFP-ZW10和Tet-on HelLa/GFP-b5将盖玻片上生长的细胞与1μg/ml多西环素孵育48 h。用1μM staurosporine处理细胞3.5 h。对活细胞和凋亡细胞进行评分。

为了在α-SNAP、BNIP1和凋亡之间提供更直接的联系，我们检测了α-SNAP-过度表达是否抑制BNIP1的促凋亡作用，而不是其他BH3-only蛋白的促凋亡效应。为此，无论是否在HeLa细胞中表达α-SNAP，都可以诱导BNIP1的表达，并用staurosporine诱导细胞凋亡。如所示图7C，α-SNAP过度表达显著抑制BNIP1表达细胞的凋亡，但不抑制Bad表达细胞的细胞凋亡，Bad表达与α-SNAP无相互作用（数据未显示）。当staurosporine未诱导凋亡时，Bad-expressing细胞也获得了类似的结果。这些结果表明α-SNAP对BNIP1诱导的细胞凋亡具有特异性保护作用。

讨论

在本研究中，我们表明BNIP1是一种促凋亡的BH3-唯一蛋白，是syntaxin 18复合物的组成部分。功能分析表明，BNIP1用于维护ER网络结构，但不用于从ER到高尔基体的膜流量。BNIP1似乎是酵母Sec20p的哺乳动物同源基因(Sweet and Pelham，1992年)虽然它与Sec20p的序列相似性很低，但其分子量（26kDa）与Sec20p的分子量（44KDa）显著不同。与这个想法一致，BNIP1与RINT-1（Tip20p的哺乳动物对应物）直接相互作用，正如Sec20p与Tip20p相互作用一样(Sweet and Pelham，1993年). 构成内质网融合机制的蛋白质中氨基酸的保守性在酵母和哺乳动物之间非常低。Tip20p在RINT-1的300–620个氨基酸中仅表现出21%的一致性（总共792个氨基酸）(Sweet and Pelham，1993年;Hirose公司等, 2004). Ufe1p和syntaxin 18之间的总序列一致性仅为12%(刘易斯和佩勒姆，1996年;Hatsuzawa公司等, 2000). 这种情况与高尔基合成蛋白、酵母Sed5p及其哺乳动物对应物合成蛋白5的情况形成了鲜明对比。它们显示出30%的氨基酸特性(哈德威克和佩勒姆，1992年;贝内特等, 1993). 酵母和哺乳动物蛋白质一级结构的显著差异可能反映了这些生物体内质网的不同特征。在酵母菌中，与内质网膜相邻的核膜在有丝分裂过程中不被分解，核型形成过程中内质网/核膜融合以Ufe1p依赖的方式发生(帕特尔等, 1998). 另一方面，在哺乳动物中，核膜在有丝分裂开始时被分解，在末期重新组装。

目前和以前的研究表明，syntaxin 18复合体中的三种膜蛋白（syntaxin18、p31和BNIP1）能够与α-SNAP相互作用。为什么一个复合体中的复数蛋白质结合α-SNAP？一种可能性是，每个α-SAP结合蛋白都有独特的作用。如本研究所示，BNIP1的缺失导致内质网的解体。另一方面，合成蛋白18的缺失对内质网膜结构没有显著影响（未发表的数据）。p31可能参与内质网和高尔基体之间的膜转运，而不是内质网膜融合，因为包含p31的亚复合体的组成部分ZW10与内质网-高尔基体膜转运有关(Hirose公司等, 2004). 也许，对syntaxin 18复合物组分之间相互作用的综合分析有助于揭示复数α-SNAP-结合蛋白的作用。在这方面，本研究的一个进展是发现BNIP1与RINT-1直接相互作用。我们之前的研究未能显示存在一种蛋白，该蛋白可以作为syntaxin 18和RINT-1/ZW10/p31亚复合物之间的联系(Hirose公司等, 2004). 适配器蛋白很可能是BNIP1。在有利于SNARE复合物分解的条件下，BNIP1与亚复合物的分离可能意味着BNIP1和RINT-1之间的直接关联随着syntaxin 18复合物的分解而消除。

我们的结果表明，BNIP1的BH3结构域不仅对诱导细胞凋亡很重要，而且对α-SNAP的结合也很重要。与此一致，α-SNAP的过度表达显著抑制了staurosporine诱导的细胞凋亡。我们不能排除α-SNAP通过结合除BNIP1以外的BH3-蛋白抑制凋亡的可能性。BNIP3是另一种能够与腺病毒E1B 19-kDa蛋白相互作用的蛋白，是其潜在候选蛋白。BNIP3与BNIP1一样，具有BH3结构域，但定位于线粒体(博伊德等, 1994). α-SNAP可能通过与ER和线粒体蛋白相互作用来阻止细胞凋亡。

尽管发现BNIP1具有双重作用，即凋亡和内质网膜融合，这一发现非常令人惊讶，但其他仅BH3蛋白也可能具有除凋亡以外的作用。Bim是一种由细胞因子剥夺等信号激活的仅含BH3的蛋白质，通过与健康细胞中的动力蛋白轻链DLC1/LC8相互作用而被隔离到动力蛋白复合体中(普塔拉卡思等, 1999). 类似地，Bmf是另一种仅BH3的蛋白质，在健康细胞中与肌球蛋白V隔离，后者在失巢反应中导致细胞死亡(普塔拉卡思等, 2001). 尽管这些BH3-only蛋白与细胞骨架马达及其辅助蛋白的相互作用与它们的隔离有关，但它们可能在健康细胞中发挥更积极的作用，如BNIP1所示。在这种情况下，值得注意的是，内质网膜蛋白BAP31参与了内质网的细胞凋亡和膜流量的调节。在健康细胞中，BAP31似乎调节蛋白质的输出，如cellubrevin(安娜特等, 1997)，MHC I类分子(蜘蛛炎等, 2000)和免疫球蛋白D(阿达奇等, 1996). 细胞表面死亡受体的刺激激活caspase-8，导致BAP31分裂。BAP31的p20半胱天冬酶裂解片段诱导Ca2+从内质网释放，增强细胞色素c（c）线粒体释放(布雷肯里奇等2003年a,2003年3月).

材料和方法

抗体

为了制备抗BNIP1抗血清，细菌表达His6-使用Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）纯化缺少TMD的BNIP1，并与弗氏佐剂（Difco Laboratories）混合，注射到日本白兔体内。抗体在带有BNIP1ΔTMD的珠上亲和纯化。制备了抗α-SNAP、Sec22b、syntaxin 5、syntaxin 18、p31、RINT-1和ZW10的多克隆抗体和抗syntaxin 18的单克隆抗体(Hatsuzawa公司等, 2000;广濑等, 2004). 抗GS27、GS15、syntaxin 4、calnexin、GM130和EEA1的单克隆抗体从转导实验室获得。从亲和生物试剂公司购买了多克隆抗Sec23p抗体。从Daiichi Fine Chemical获得了单克隆抗脯氨酰4-羟化酶β亚基。抗FLAG的单克隆和多克隆抗体购自Sigma。抗-HA和抗GST来自圣克鲁斯生物技术公司。抗活性半胱天冬酶-3的抗体来自Promega。抗HA和penta-His的单克隆抗体分别来自Roche Diagnostics Corp.和Qiagen。

细胞培养

HeLa细胞在添加了50 IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素和10%胎牛血清的Dulbecco改良最小Eagle's培养基中培养。293T细胞和Vero细胞在添加了相同材料的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。MCF-7细胞取自人类科学研究资源库，并在Eagle的最低必需培养基中生长，该培养基补充有10%的胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和10μg/ml牛胰岛素（Sigma）。稳定表达HA-α-SNAP和GFP-b的HeLa-Tet-on细胞的建立5与GFP-ZW10稳定细胞上的HeLa-Tet-类似(Hirose公司等, 2004).

质粒构建和转染

细胞色素cDNAb条5（由九州大学的伊藤博士善意捐赠）被插入pEGFP-C3（Clontech）。以人肾脏cDNA文库为模板，通过聚合酶链反应扩增BNIP1全长cDNA。将编码全长BNIP1、L114A突变体和全长小鼠Bad（由东京大学Y Gotoh博士善意捐赠）的cDNA片段插入pcDNA3（Invitrogen）、pFLAG-CMV-2（Sigma）或pTRE（Clontech）。通过定点突变构建BH3结构域突变体。根据制造商的方案，使用LipofectAMINE PLUS（Invitrogen）进行转染。

免疫沉淀

在35 mm培养皿上生长的大约90%的融合细胞用0.5 ml的裂解缓冲液进行裂解，该裂解缓冲液由25 mm HEPES–KOH（pH 7.2）、150 mm KCl、2 mm EDTA、1 mm二硫苏糖醇、1%Triton X-100、0.5μg/ml亮氨酸蛋白酶、2μM胃蛋白酶抑制素、2μg/ml抑肽酶和1 mm苯甲基磺酰氟组成，并在17000下离心克进行10分钟的免疫沉淀试验(Hirose公司等, 2004).

细胞死亡分析

通过以下两种方法测量细胞凋亡诱导活性：

抑制菌落形成：MCF-7细胞（约1.0×105细胞/孔）在六孔板上生长，用上述结构转染，并将其置于100mm培养皿中。转染后48 h，添加0.8 mg/ml G418（钙生物化学），并培养细胞2周。G418-耐药菌落用Giemsa溶液染色并计数。

瞬时表达分析：HeLa细胞转染2μg pFLAG-CMV-2（对照）、pFLAG-BNIP1野生型、pFLAG-BNIP1 L114A或pFLAG-Bad。转染后24小时，回收附着细胞和漂浮细胞，并用2%多聚甲醛固定。细胞分别用抗FLAG抗体和Hoechst 33342染色，以显示表达的蛋白质和核DNA。计算活细胞（完整细胞核）和凋亡细胞（浓缩或破碎染色质）的数量。另一种方法是通过激活原蛋白酶-3对细胞凋亡进行评分。

RNA干扰

用siRNA靶向BNIP1（155-175）。该序列为5′-AAGAGTTGCGTCACAGATAC-3′，对应于起始密码子的155–175位。作为对照，使用低效寡核苷酸双链（siRNA（532-552）），其序列对应于位置532-552。siRNA是从日本生物服务公司购买的。根据制造商的方案，使用Oligofectamine（Invitrogen）进行转染。

微量注射抗体

将纯化抗体（对照兔IgG～13 mg/ml或抗BNIP1～10 mg/ml）注入细胞，并培养细胞20小时。

ER中三向接头的定量

利用稳定表达GFP-b的活细胞通过共焦显微镜计算ER网络中的三向连接数5.从每个细胞的细胞中心（细胞核除外）到外围，随机选择两个或三个区域（每个10×10μm），并对ER中的三向连接进行评分。

免疫荧光和电子显微镜

按照说明进行免疫荧光显微镜检查(多贺谷等, 1996). 对于内源性BNIP1，细胞在−20°C下用甲醇固定5分钟，对于表达的蛋白质，在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。共焦显微镜使用Fluoview 300激光扫描显微镜（奥林巴斯）或TCS SP2 AOBS（徕卡微系统）进行。按照说明进行电子显微镜检查(山口等, 1997)

补充材料

补充图1

单击此处查看。（93K，pdf格式）

补充图2

单击此处查看。（143K，pdf）

补充图3

单击此处查看。（82K，pdf格式）

补充图4

单击此处查看。（115K，pdf格式）

补充图5

单击此处查看。（180K，pdf格式）

补充图6

单击此处查看。（101K，pdf格式）

致谢

我们感谢伊藤博士和谷藤义夫博士的cDNA克隆。这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部资助科学研究基金13680792、10215205和11480183的部分支持。HH是日本青年科学家科学促进会研究奖学金的获得者。

工具书类

  • Adachi T、Schamel WW、Kim KM、Watanabe T、Becker B、Nielsen PJ、Reth M（1996）IgD分子与辅助蛋白BAP31/BAP29结合的特异性在于IgD跨膜序列.欧洲工商管理硕士J 15: 1534–1541[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Allan VJ，Vale RD（1991）微管膜转运和微管形成的细胞周期控制在体外.J细胞生物学 113: 347–359[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Annaert WG、Becker B、Kistner U、Reth M、Jahn R（1997）BAP31控制着纤维素酶从内质网的输出.J细胞生物学 139: 1397–1410[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Baumann O，Walz B（2001）动物细胞的内质网及其结构和功能域的组织.Int Rev细胞 205: 149–214 [公共医学][谷歌学者]
  • Belgareh-Touze N、Corral-Debrinski M、Launhardt H、Galan JM、Munder T、Le Panse S、Haguenauer-Tsapis R（2003）酵母功能分析：鉴定与ER向高尔基体转运相关的两个关键基因.交通 4：607–617[公共医学][谷歌学者]
  • Bennett MK、Garcia-Arraras JE、Elferink LA、Peterson K、Fleming AM、Hazuka CD、Scheller RH（1993）膀胱运输受体的突触结合蛋白家族.单元格 74: 863–873 [公共医学][谷歌学者]
  • Bouillet P，Strasser A（2002）仅BH3蛋白进化保守的促凋亡Bcl-2家族成员对启动程序性细胞死亡至关重要.细胞科学杂志 115: 1567–1574 [公共医学][谷歌学者]
  • Boyd JM、Malstrom S、Subramanian T、Venkatesh LK、Schaeper U、Elangovan B、D'Sa-Eipper C、Chinnadurai G（1994）腺病毒E1B 19 kDa和Bcl-2蛋白与一组常见的细胞蛋白相互作用.单元格 79: 341–351 [公共医学][谷歌学者]
  • Breckenridge DG、Germain M、Mathai JP、Nguyen M、Shore GC（2003a）内质网途径对细胞凋亡的调节.癌基因 22: 8608–8618 [公共医学][谷歌学者]
  • Breckenridge DG、Stojanovic M、Marcellus RC、Shore GC（2003b）BAP31的半胱氨酸蛋白酶裂解产物通过内质网钙信号诱导线粒体分裂，增强细胞色素c（c）释放到胞浆.J细胞生物学 160: 1115–1127[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Burri L、Varlamov O、Doege CA、Hofmann K、Beilharz T、Rothman JE、Söllner TH、Lithgow T（2003）逆行运输到内质网所需的陷阱.《美国科学院院刊》 100: 9873–9877[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chan GK、Jablonski SA、Starr DA、Goldberg ML、Yen TJ（2000）人类Zw10和ROD是与动粒结合的有丝分裂检查点蛋白.Nat细胞生物学 2: 944–947 [公共医学][谷歌学者]
  • Dilcher M、Veith B、Chidambaram S、Hartmann E、Schmitt HD、Fischer von Mollard G（2003）Use1p是逆行到ER所需的酵母SNARE蛋白.欧洲工商管理硕士J 22: 3664–3674[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dreier L，Rapoport TA（2000年）体外内质网的形成通过受控的融合反应独立于微管发生.J细胞生物学 148: 883–898[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Foyouzi-Youssefi R、Arnaudeau S、Borner C、Kelley WL、Tschopp J、Lew DP、Demaurex N、Krause KH（2000）Bcl-2降低游离钙2+内质网内的浓度.《美国科学院院刊》 97: 5723–5728[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Häcki J、Egger L、Monney L、Conus S、Rosse T、Felley I、Borner C（2000）Bcl-2控制的内质网和线粒体间的凋亡串扰.癌基因 19: 2286–2295 [公共医学][谷歌学者]
  • Hardwick KG，Pelham HR（1992年）SED5级编码内质网和高尔基复合体之间囊泡运输所需的39kD整合膜蛋白.J细胞生物学 119: 513–521[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hatsuzawa K、Hirose H、Tani K、Yamamoto A、Scheller RH、Tagaya M（2000）Syntaxin 18是一种SNAP受体，在内质网、中间隔室和顺式-高尔基体囊泡贩运.生物化学杂志 275：13713–13720[公共医学][谷歌学者]
  • Hirose H、Arasaki K、Dohmae N、Takio K、Hatsuzawa K、Nagahama M、Tani K、Yamamoto A、Tohyama M、Tagaya M（2004）ZW10在内质网和高尔基体间膜转运中的意义.欧洲工商管理硕士J 23: 1267–1278[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jahn R、Lang T、Südhof TC（2003）膜融合.单元格 112: 519–533 [公共医学][谷歌学者]
  • Krajewski S、Tanaka S、Takayama S、Schibler MJ、Fenton W、Reed JC（1993）bcl-2癌蛋白亚细胞分布的研究：位于核膜、内质网和线粒体外膜.癌症研究 53: 4701–4714 [公共医学][谷歌学者]
  • Kuwana T，Newmeyer DD（2003）Bcl-2家族蛋白与线粒体在细胞凋亡中的作用.Curr Opin细胞生物学 15: 691–699 [公共医学][谷歌学者]
  • Lee C，Chen LB（1988）活细胞内质网的动态行为.单元格 54: 37–46 [公共医学][谷歌学者]
  • Lewis MJ，Pelham HR（1996年）SNARE介导高尔基复合体到内质网的逆行交通.单元格 85: 205–215 [公共医学][谷歌学者]
  • Lewis MJ、Rayner JC、Pelham HR（1997年）囊泡与内质网融合的新型SNARE复合物.欧洲工商管理硕士J 16: 3017–3024[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lin RC、Scheller RH（2000年）突触小泡胞吐机制.年收入细胞开发生物 16: 19–49 [公共医学][谷歌学者]
  • Lippincott-Schwartz J、Roberts TH、Hirschberg K（2000）活细胞中分泌蛋白的运输和细胞器动力学.年收入细胞开发生物 16: 557–589[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Marsden VS，Strasser A（2003）免疫系统中细胞凋亡的控制：Bcl-2、BH3-only蛋白等.免疫年度收益 21: 71–105 [公共医学][谷歌学者]
  • Mund T、Gewies A、Schoenfeld N、Bauer MK、Grimm S（2003）Spike是一种新的BH3-only蛋白，调节内质网的凋亡.美国财务会计准则委员会J 17：696–698[公共医学][谷歌学者]
  • Ng FW，Shore GC（1998年）Bcl-XL与内质网中的Bap31复合物协同结合，依赖于原蛋白酶-8和Ced-4衔接子.生物化学杂志 273: 3140–3143 [公共医学][谷歌学者]
  • Nutt LK、Pataer A、Pahler J、Fang B、Roth J、McConkey DJ、Swisher SG（2002）Bax和Bak通过调节内质网和线粒体Ca促进细胞凋亡2+商店.生物化学杂志 277: 9219–9225 [公共医学][谷歌学者]
  • Patel SK、Indig FE、Olivieri N、Levine ND、Latterich M（1998）器官膜融合：突触素同源物Ufe1p在内质网膜融合中的新功能.单元格 92: 611–620 [公共医学][谷歌学者]
  • Pinton P、Ferrari D、Magalhaes P、Schulze-Othoff K、Di Virgilio F、Pozzan T、Rizzuto R（2000）细胞内钙负荷减少2+电容性钙的储存和下调2+Bcl-2过度表达细胞内流.J细胞生物学 148: 857–862[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Presley JF、Cole NB、Schroer TA、Hirschberg K、Zal KJ、Lippincott-Schwartz J（1997）活体细胞中ER-高尔基体转运的可视化.自然 389: 81–85 [公共医学][谷歌学者]
  • Puthalakath H、Huang DC、O'Reilly LA、King SM、Strasser A（1999）Bcl-2家族成员Bim的促凋亡活性通过与动力蛋白运动复合物的相互作用进行调节.分子电池 三: 287–296 [公共医学][谷歌学者]
  • Puthalakath H、Villunger A、O'Reilly LA、Beaumont JG、Coultas L、Cheney RE、Huang DC、Strasser A（2001）Bmf：一种由肌球蛋白V肌动蛋白运动复合物相互作用调节的促凋亡BH3-蛋白，由失巢凋亡激活.科学类 293: 1829–1832 [公共医学][谷歌学者]
  • Scorrano L、Oakes SA、Opferman JT、Cheng EH、Sorcinelli MD、Pozzan T、Korsmeyer SJ（2003）BAX和BAK对内质网钙的调节2+：细胞凋亡的控制点.科学类 300: 135–139 [公共医学][谷歌学者]
  • Snapp EL、Hegde RS、Francolini M、Lombardo F、Colombo S、Pedrazini E、Borgese N、Lippincott-Schwartz J（2003）低亲和力蛋白质相互作用形成堆积内质网池.J细胞生物学 163: 257–269[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Söllner T、Whiteheart SW、Brunner M、Erdjument-Bromage H、Geromanos S、Tempst P、Rothman JE（1993）与囊泡靶向和融合相关的SNAP受体.自然 362: 318–324 [公共医学][谷歌学者]
  • Spiliotis ET、Manley H、Osorio M、Zuniga MC、Edidin M（2000）MHC I类分子与TAP分离后从内质网选择性输出.免疫 13: 841–851 [公共医学][谷歌学者]
  • Sweet DJ，Pelham人力资源部（1992）这个酿酒酵母SEC20基因编码由HDEL检索系统分类的膜糖蛋白.欧洲工商管理硕士J 11：423–432[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sweet DJ，Pelham HR（1993年）TIP1基因酿酒酵母编码一种80kDa的细胞质蛋白，与Sec20p的细胞质结构域相互作用.欧洲工商管理硕士J 12: 2831–2840[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tagaya M、Furuno A、Mizushima S（1996）SNAP可防止镁2+-ATP诱导的释放N个-洋地黄素渗透PC12细胞高尔基体中的乙基马来酰亚胺敏感因子.生物化学杂志 271: 466–470 [公共医学][谷歌学者]
  • Thomenius MJ，Distelhorst CW（2003）内质网上的Bcl-2：远距离保护线粒体.细胞科学杂志 116: 4493–4499 [公共医学][谷歌学者]
  • Uchiyama K、Jokitalo E、Kano F、Murata M、Zhang X、Canas B、Newman R、Rabouille C、Pappin D、Freemont P、Kondo H（2002）VCIP135是p97/p47介导的膜融合的一种新的必要因子，是高尔基体和内质网组装所必需的体内.J细胞生物学 159: 855–866[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Voeltz GK、Rolls MM、Rapoport TA（2002）内质网的结构组织.EMBO代表 三: 944–950[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Weber T、Zemelman BV、McNew JA、Westermann B、Gmachl M、Parlati F、Söllner TH、Rothman JE（1998）SNAREpins：膜融合的最小机械.单元格 92: 759–772 [公共医学][谷歌学者]
  • 肖杰、刘CC、陈鹏、李惠华（2001）RINT-1是一种新型Rad50相互作用蛋白，参与辐射诱导的G2/M检查点控制.生物化学杂志 276: 6105–6111 [公共医学][谷歌学者]
  • 山口T、山本A、古鲁诺A、鸠泽康夫K、塔尼K、Himeno M、塔加亚M（1997）异三聚体G蛋白可能参与高尔基体的组织.生物化学杂志 272: 25260–25266 [公共医学][谷歌学者]
  • Yasuda M，Chinnadurai G（2000年）细胞蛋白BNIP1中凋亡效应子BH3结构域的功能鉴定.癌基因 19: 2363–2367 [公共医学][谷歌学者]
  • Ye J、Rawson RB、Komuro R、Chen X、Dave UP、Prywes R、Brown MS、Goldstein JL（2000）内质网应激通过处理SREBP的相同蛋白酶诱导膜结合ATF6的裂解.分子电池 6: 1355–1364 [公共医学][谷歌学者]
  • Zong WX、Li C、Hatzivassiliou G、Lindsten T、Yu QC、Yuan J、Thompson CB（2003）Bax和Bak可以定位于内质网，从而引发细胞凋亡.J细胞生物学 162: 59–69[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团