美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol。2016年9月1日；311（3）：R466–R477。
利格列汀治疗改善2型糖尿病患者的脑血管功能和重塑，并恢复减少的脑灌注
,2 ,2 ,1,2 ,1,2 ,2 ,1,2 ,三和
1,2 特雷弗·哈迪根
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
阿卜杜勒·亚希尔
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
穆罕默德·阿卜杜勒赛德
1佐治亚州奥古斯塔查理·诺伍德退伍军人管理医疗中心；
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
马哈·库查
1佐治亚州奥古斯塔查理·诺伍德退伍军人管理医疗中心；
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
萨利·埃尔·沙菲
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
李伟国
1乔治亚州奥古斯塔市查理·诺伍德退伍军人管理局医疗中心；
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
玛丽贝斯·约翰逊
三佐治亚州奥古斯塔大学研究生院生物统计学系
Adviye Ergul公司
1佐治亚州奥古斯塔查理·诺伍德退伍军人管理医疗中心；
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
1佐治亚州奥古斯塔查理·诺伍德退伍军人管理医疗中心；
2乔治亚州奥古斯塔乔治亚医学院生理学系；和
三佐治亚州奥古斯塔大学研究生院生物统计学系
通讯作者。 转载请求和其他信件地址：A.Ergul，佐治亚州奥古斯塔大学乔治亚医学院生理学系，佐治亚州奥古斯塔市第15街1120号，CA-2094，奥古斯塔，GA 30912（电子邮件：ude.atsugua@lugrea). 2016年2月18日收到；2016年6月24日接受。
摘要
降糖药利格列汀是一种二肽基肽酶-4（DPP-IV）抑制剂，已被证明可以减轻炎症并改善内皮细胞功能。在本研究中，我们假设利格列汀抑制DPP-IV可改善糖尿病大鼠受损的脑灌注，并改善胰岛素诱导的脑血管松弛和逆转病理性脑血管重塑。我们进一步假设，这些变化将导致随后认知功能的改善。用利格列汀治疗雄性2型糖尿病和非糖尿病Goto-Kakizaki大鼠4周，并评估血糖和DPP-IV血浆水平。使用激光多普勒成像技术评估治疗后的脑灌注，以及胰岛素的剂量反应（10−13M–10月−6M） 对大脑中动脉进行加压动脉造影。在生理相关压力范围内评估DPP-IV抑制对糖尿病脑血管重塑的影响，并使用新的对象识别测试观察短期海马依赖性学习的变化。利那列汀降低了DPP-IV活性，但没有改变糖尿病患者的血糖或胰岛素水平。利格列汀治疗糖尿病大鼠后，胰岛素介导的血管舒张和脑灌注得到改善。糖尿病血管重塑的指标，如横截面积、中膜厚度和壁腔比的增加也得到改善；然而，短期海马依赖性学习没有改善。本研究提供证据表明，利格列汀治疗可改善2型糖尿病模型的脑血管功能障碍和重塑，且不依赖于血糖控制。这对易患脑血管并发症（如中风和认知障碍）的糖尿病患者具有重要意义。
关键词：糖尿病、二肽基肽酶-4、利格列汀、脑血管病、认知障碍
糖尿病的发病率越来越高全球流行状况。美国近2900万人患有这种疾病，其中2型糖尿病是最常见的疾病形式(4). 高血糖对大血管和微血管的影响有助于发展并发症，如心血管疾病、糖尿病视网膜病变、肾病和神经病变(14,16). 此外，众所周知，糖尿病极大地增加了中风的风险和严重程度，以及认知功能障碍的发展，而认知功能障碍是研究最少的疾病并发症(16,21). 脑血管结构和功能的调节对于维持大脑的恒定和适当灌注至关重要。虽然还没有完全理解，但脑血管功能障碍和重塑导致的脑灌注减少被认为是导致认知功能障碍的原因(24). 糖尿病血管认知障碍的潜在机制无疑是复杂的，因此表明需要在治疗领域帮助预防和治疗这种并发症。
2型糖尿病患者经常出现高胰岛素血症，这与脑血管功能障碍有关(13,43). 大脑动脉不仅含有胰岛素受体，而且对胰岛素具有浓度依赖性的血管舒张作用(26). 内皮细胞上的胰岛素受体负责血管舒张，与平滑肌细胞上钾通道的下游激活协同工作，如BK钙因此，胰岛素水平的增加与皮质灌注的增加有关。胰岛素抵抗，如2型糖尿病和糖尿病前期患者的胰岛素抵抗，由于一氧化氮（NO）生物利用度降低以及氧化应激增加而减少了这种血管舒张(27). 然而，血糖控制对胰岛素依赖性血管舒张的影响尚不清楚。
脑血管结构对脑灌注的调节至关重要，因为它与血管直径直接相关。此外，血管平滑肌成肌反应性在很大程度上影响自身调节(5). 肌源性反应是平滑肌细胞在灌注压力升高时收缩的固有能力(9,17)尽管脑灌注压力发生了变化，但脑血管自动调节对维持脑持续灌注至关重要(38,42). 大脑中动脉（MCA）等动脉在很大程度上负责调节脑血管阻力和大脑中的自我调节，因此对脑灌注有很大影响(18,39). 我们之前已经表明，在2型糖尿病Goto Kakizaki（GK）大鼠中，脑灌注减少，肌源反应性丧失(1,28,29). 我们还发现糖尿病会导致MCA的肥厚性重塑，其特征是随着疾病严重程度的加重，内侧壁厚度和内侧壁与内腔的比率增加(22). 此外，二甲双胍控制血糖后，外周血管和脑血管的这些病理重塑指标都得到了预防和逆转，尽管老年GK大鼠肌源性反应的丧失未受影响(1,2,28,46). 其他控制血糖的治疗方法是否同样有益，还有待确定。
二肽基肽酶4（DPP-IV）抑制剂是一类较新的抗高血糖药物，用于治疗2型糖尿病(50). DPP-IV降解肠促胰岛素激素，尤其是胰高血糖素样肽1（GLP-1）和胃抑制肽（GIP）。GLP-1与GLP-1受体结合可导致信号级联，促进胰岛素分泌和胰高血糖素降低。此外，DPP-IV抑制剂已被证明可发挥多效性作用，而不依赖于其对血糖的影响。据报道，Alogliptin通过NO和内皮衍生超极化因子依赖（EDHF）途径对血管张力产生作用，这种作用与GLP-1无关(48). 利格列汀是最新的DPP-IV抑制剂之一，它通过增加血管舒张和抗炎作用而改善血管功能，而这种作用与血糖水平的任何变化无关(34). 重要的是，利格列汀可以改善糖尿病小鼠血脑屏障的完整性、认知功能和脑萎缩，而不依赖于其降血糖作用(36). 然而，利格列汀抑制DPP-IV对糖尿病脑血管功能障碍和重塑的影响尚未得到研究。本研究的目的是验证以下假设：用利格列汀抑制DPP-IV可通过改善胰岛素诱导的脑血管松弛和病理性脑血管重塑改善糖尿病大鼠受损的脑灌注，进而改善认知功能。
方法
动物。
所有实验均使用雄性GK大鼠（纽约州哈德逊市塔科尼实验室）进行。我们在本研究中使用雄性大鼠，因为我们对2型糖尿病雄性GK大鼠模型有丰富的经验。在我们实验室以前发表的工作中(1,28,45)，我们探讨了二甲双胍控制雄性GK大鼠血糖对各种脑血管终点的影响。本研究的目的是比较另一种降血糖药物利格列汀与我们之前使用二甲双胍的研究。这些动物被安置在奥古斯塔大学动物护理设施内，该设施由美国实验动物护理认证协会批准。所有方案均由机构动物护理和使用委员会批准。在实验方案之前，动物被随意喂食标准的大鼠食物和自来水，在实验方案完成后，他们接受标准饮食或治疗饮食。每两周测量一次体重和血糖。糖化血红蛋白值（HbA1c，A1CNow-plus，PTS Diagnostics，Indianapolis，IN）被用作长期血糖水平的测量。监测大鼠高血糖（HbA）的自发发展1c个% ≥7.0). 在实验治疗之前，所有的GK大鼠都被控制在产仔数下，并在相同的环境条件下喂养相同的饮食，因此，在本研究中，非糖尿病GK大鼠被用作糖尿病GK大鼠的血糖控制效果的基因匹配对照。
动物治疗。
在24周龄时，将非糖尿病和糖尿病大鼠随机分为载体组或利格列汀治疗组，在我们之前的研究中，这一年龄足以观察GK大鼠的脑血管并发症(2). 对非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠给予利格列汀治疗4周。正如其他研究报告和利格列汀供应商（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals）的建议所述，我们最初开始用83毫克利格列酮/公斤的食物治疗大鼠。这种治疗相当于～100 nM的血浆水平和5 mg/kg的口服剂量。动物被单独饲养，以确保每只动物都有平等的机会获得治疗食物。在监测1周的血糖水平后，我们没有发现治疗组大鼠的血糖有任何降低，随后将利格列汀的剂量加倍至166 mg/kg。本研究中使用的大鼠平均体重约为400克，这意味着给大鼠10毫克/千克体重的剂量，大鼠每天的剂量约为4毫克。这接近于人类糖尿病患者每天服用5毫克的剂量。然而，与其他人发表的研究结果类似，研究人员并未注意到对血糖水平的影响(32,34). 使用DPP-IV活性测定（Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY）确认药物递送，该测定显示治疗组的血浆DPP-IV活性水平降低。死亡时，用氯胺酮/甲苯噻嗪（80 mg/kg：10 mg/kg ip）麻醉动物，并通过心脏穿刺抽血。
脑灌注。
与之前在我们实验室进行的一样，我们使用PIM3扫描激光多普勒激光多普勒成像（瑞典斯德哥尔摩Perimed Systems公司）来评估大脑灌注(35,45). 在该系统中，内置光电探测器识别皮层表面0.5 cm范围内运动血细胞的反射光，并使用LDPIwin软件（俄亥俄州北罗亚尔顿佩里迈德）根据这些血细胞的浓度和平均速度获取彩色编码图像。简单地说，使用异氟醚对动物进行麻醉，体温保持在37±0.5°C，通过中线皮肤切口暴露颅骨。选择了两个半球的短角和λ之间的感兴趣区域。在单次扫描过程中，每只动物共进行了三次扫描，并平均了每个大脑半球λ和前角之间感兴趣区域（ROI）的平均脑血流量（CBF）。根据血细胞在组织中运动的浓度和平均速度，大脑灌注在彩色大脑皮层图像上表示为相对荧光单位（RFU）。
血管反应性。
从非糖尿病和糖尿病载体和利格列汀治疗的大鼠身上快速切除MCA，并在隔离后45分钟内使用，以确保血管的存活。将MCA安装在动脉造影室（弗吉尼亚州伯灵顿市Living Systems Instrumentation）的玻璃套管上，动脉造影室中含有5 ml HEPES缓冲液（单位：mM）：（130 NaCl，4 KCl，1.2 MgSO4，4氯化钠三，10 HEPES，1.18 KH2人事军官4在整个实验过程中，动脉造影室与温度控制器相连，该温度控制器将HEPES缓冲液保持在37±0.5°C的恒定温度。在1h平衡期的开始和结束时，用视频尺寸分析仪测量流明直径。随后，用5-羟色胺（5-HT；10−6M） 以实现基线直径至少30%的收缩。胰岛素累积反应曲线（10−13M–10月−6M） 已执行。松弛度计算为最大血清素预构后管腔直径增加的百分比，还评估了最大松弛反应（RMax）和曲线下面积（AUC）给出的总松弛反应。每个动脉段仅用于单剂量反应实验。通过内皮依赖性舒张至ACh（1μM）来验证所有动脉的内皮完整性。
血管结构评估。
死亡后立即采集的MCA被安装在加压动脉造影仪上，用视频尺寸分析仪测量壁厚、管腔和外径，压力增量为20 mmHg，压力范围为5至120 mmHg。在压力增加5分钟后进行测量。该系统在无钙Krebs HEPES缓冲液中平衡，该缓冲液在37±0.5°C下循环，以在被动条件下获得测量结果。肌源性反应性被定义为血管对压力增加作出收缩反应的能力，首先在钙的存在下获得压力-直径曲线2+（主动压力曲线），然后以Ca表示2+-添加0.2 mM盐酸罂粟碱的自由缓冲液（被动压力曲线）。介质厚度、内腔和外径以及血管横截面积的测定如下：介质厚度（MT，μm）=外径-内腔直径（即OD-LD）；中腔比（M:L）=MT/LD；横截面积（μm2)=外血管面积−管腔面积。
认知功能评估。
为了评估认知和记忆相关任务，我们按照之前的描述在实验室进行了自发新物体识别（NOR）测试(45)使用一个灰色塑料盒（63 L×38 W×42 H cm），上面有动物床上用品。在测试前3天，动物在盒子里没有物体的情况下习惯于盒子。选择细节相似的物体，以便进行平等和公正的测试。在测试当天，允许大鼠在A/A过程中探索两个相同的物体，持续5分钟。大鼠被送回其家中的笼子，延迟/保留时间间隔为15分钟，然后大鼠面对由5分钟组成的A/B过程，在此期间，一个新对象与a/a会话中使用的熟悉对象配对。每次治疗结束后，用30%乙醇清洗所有物品，并将床上用品揉搓干净，以丢弃线索。实验开始时，将物体放置在距离盒子壁等距的中央，间隔20厘米，将大鼠放在两个物体之间。记录A/B会话期间探索每个物体所花费的时间，并根据探索新物体所花费时间与探索两个物体所花费总时间的比率计算识别指数。d2比率是探索新物体所花费的总时间减去探索熟悉物体所花的总时间与探索两者的总时间之比，它解释了探索时间的差异，正比率表示对新颖性的偏好(三).
数据分析。
使用NCSS 2007（NCSS，LLC，Kaysville，UT）测定每条血管的胰岛素诱导脑血管舒张和血管重塑指数的AUC。在分析之前，使用对数变换来稳定胰岛素曲线下面积的方差。使用2种疾病（非糖尿病vs.糖尿病）×2种治疗（溶媒vs.利格列汀）方差分析对利格列汀治疗的效果进行分析。这种相互作用测试了利格列汀对疾病状态的不同依赖性。在确定显著ANOVA交互作用的平均差异时，Tukey校正用于调整多重比较。对于行为测试，学生的t吨-该测试用于基线时疾病组之间的比较，并使用单向方差分析评估疾病组内随时间的变化。SAS 9.4用于这些分析（SAS、Cary、NC）。使用GraphPad Prism 6.0对脑灌注与血管功能和结构指数进行相关分析。重要性评估于P（P）< 0.05. 结果以平均值±SE表示。
结果
利格列汀治疗不会影响血糖和胰岛素水平。
基线检查时，糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠的体重没有显著差异[F类(1,19) = 0.52,P（P）=0.48]，利格列汀治疗4周对各组体重也没有影响[F类(1,17) = 0.03,P（P）= 0.87] (). 在28周龄治疗后从尾静脉采集血样，与非糖尿病组相比，糖尿病大鼠的血糖水平显著升高，其HbA测定结果如下1c个值[F类(1,15) = 100.41,P（P）<0.001]，平均血糖水平超过2-3个月。利那列汀治疗4周对降低HbA没有任何显著影响1c个非糖尿病或糖尿病大鼠的数值[F类(1,15) = 0.56,P（P）= 0.47] (). 非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠的血浆胰岛素水平也没有显著差异[F类(1,15) = 2.14,P（P）=0.16]，利格列汀治疗也没有任何效果[F类(1,15) = 1.45,P（P）= 0.25] (). 糖尿病大鼠的空腹血糖水平增加同样不受利格列汀治疗的影响（mg/dl；非糖尿病载体：107.4±3.5，非糖尿病利格列汀：97.2±3.1，糖尿病载体：222.8±26.9，糖尿病利格列汀：193.5±40.9），这促使我们对我们的方案中的药物输送方法是否有效提出质疑。为了确认利格列汀是否能够抑制DPP-IV，我们使用市售的DPP-IV活性测定法测试了四组的血浆样品。与非糖尿病动物相比，糖尿病车辆治疗大鼠的DPP-IV活性水平显著增加，与未治疗组相比，非糖尿病和糖尿病大鼠用利格列汀治疗4周后，血浆DPP4活性降低[F类(1,8) = 4,630,P（P）< 0.0001] (). 这证实了治疗是有效的，但达到的抑制水平无法影响血糖状态。
利格列汀治疗不会降低糖尿病患者的血糖水平。24周龄非糖尿病和糖尿病Goto-Kakizaki（GK）大鼠接受了4周的利格列汀（非糖尿病+利那格列汀，糖尿病+利那格列汀）治疗。A类：基线检查时和服用佐剂佐剂或利格列汀佐剂治疗后的体重均未受影响。B类：分析死亡动物血浆中的胰岛素水平和二肽基肽酶-4（DPP-IV）活性(D类)测量为相对荧光单位（RFU）/s。C：糖尿病大鼠HbA升高1c个与非糖尿病大鼠相比，无论是糖尿病组还是非糖尿病组，利格列汀治疗对长期血糖控制均无影响。结果表示为平均值±SE；n个=5/组，双向方差分析***P（P）<0.001 vs.非糖尿病车辆。血浆胰岛素水平无显著差异(n个=4或5/组）。糖尿病载体组和非糖尿病载体组的血浆DPP-IV活性在统计学上显著增加，利格列汀治疗4周后，无论血糖水平如何，这两个组的活性都会降低。结果表示为平均值±SE；n个=3/组，双向方差分析***P（P）<0.001 vs.非糖尿病车辆###P（P）<0.001 vs.糖尿病车辆。
利格列汀治疗可恢复糖尿病大鼠的脑灌注。
尽管利格列汀在降低血糖或提高胰岛素水平方面缺乏作用，但我们试图确定该治疗是否会像其他人所建议的那样产生独立于血糖控制的作用(34,36,48). 糖尿病通过血管功能和结构的病理变化降低大脑灌注，因此，我们选择评估MCA供应区域的皮层灌注，MCA是糖尿病血管并发症（如中风）中经常受影响的动脉。在用PIM3激光多普勒扫描后，选择了两个半球的前角和λ之间的ROI，因为该区域由MCA灌注，因此，灌注与随后的血管功能数据相关(). 与非糖尿病载体大鼠相比，糖尿病载体治疗大鼠的脑灌注显著减少。利格列汀治疗可显著改善糖尿病大鼠的脑灌注(P（P）=0.0088 vs.糖尿病溶媒），将灌注恢复到非糖尿病组的水平(P（P）=0.94，与非糖尿病患者相比，P（P）=0.85 vs.非糖尿病利格列汀）(). 然而，利格列汀对对照组无影响(P（P）=0.0050与非糖尿病患者相比，P（P）=0.0032 vs.非糖尿病性利格列汀），表明疾病和治疗之间存在显著的相互作用[F类(1,14) = 5.50,P（P）= 0.034]. 鉴于利格列汀和其他DPP-IV抑制剂已被证明会导致NO增加和血管扩张增加，我们接下来试图确定脑灌注的改善是否与血管功能的改善有关。
利格列汀治疗后，糖尿病大鼠脑灌注减少得到改善。在治疗4周后的28周龄时，使用激光多普勒扫描测量所有四组的脑灌注。由于大脑中动脉（MCA）对这一区域进行灌注，因此选择了大脑两半球的前角和λ之间的感兴趣区域，并将灌注与血管功能数据相关联。A类：显示了四组的代表性图像，灰色圆圈表示每个半球的ROI。B类：与非糖尿病大鼠相比，糖尿病媒大鼠的脑灌注减少，利格列汀治疗能够将脑灌注恢复到非糖尿病组的水平。结果以平均值±SE表示；n个=4-5/组，双向方差分析#P（P）<0.05与糖尿病车辆†疾病和治疗相互作用，P（P）= 0.0343.
利格列汀治疗可改善胰岛素诱导的脑血管松弛。
大脑中动脉（MCA）和大脑的其他大动脉是大脑中血管阻力的主要部位，这些动脉的正常功能对大脑灌注有很大帮助。众所周知，糖尿病会降低NO的生物利用度，降低血管舒张功能；因此，我们研究了利格列汀治疗是否有助于改善这种功能障碍。我们用载体或利格列汀治疗后，从非糖尿病和糖尿病大鼠身上采集MCA，并将血管安装在加压动脉造影系统上。我们对胰岛素进行了剂量-反应曲线分析，结果表明胰岛素会导致脑动脉中的一氧化氮依赖性血管舒张。与非糖尿病溶媒组相比，糖尿病溶媒大鼠的MCA表现出受损的血管舒张反应。对糖尿病大鼠进行利格列汀治疗能够将这种血管舒张反应恢复到非糖尿病载体大鼠的水平(). 该治疗有效地增加了RMax()以及AUC给出的总松弛()在糖尿病大鼠中，由显著的相互作用决定[F类(1,16) = 6.71.P（P）=0.020和F类(1,16) = 9.44,P（P）分别=0.0073]，表明用利格列汀治疗的糖尿病大鼠的反应增加，而在非糖尿病大鼠中没有观察到。利格列汀治疗能够显著改善糖尿病大鼠的RMax(P（P）=0.0011 vs.糖尿病赋形剂），并将RMax恢复到非糖尿病组的水平(P（P）=0.69与非糖尿病患者相比，P（P）=1.0 vs.非糖尿病利格列汀）()但对对照组无影响(P（P）=0.010与非糖尿病患者相比，P（P）=0.0011 vs.非糖尿病性利格列汀）。利格列汀治疗能够显著改善糖尿病大鼠的总体放松状态(P（P）<0.0001 vs.糖尿病组），并将总松弛度恢复到非糖尿病组的水平(P（P）=0.48与非糖尿病患者相比，P（P）=0.95 vs.非糖尿病利格列汀）()但对对照组无影响(P（P）=0.0009相对于非糖尿病载体，P（P）<0.0001 vs.非糖尿病性利格列汀）。用利格列汀治疗后，非糖尿病大鼠对胰岛素舒张血管的敏感性增加（−log[M]：非糖尿病载体：−9.189±0.2813，非糖尿病利格列丁：−10.361±0.3865）(P（P）=0.035 vs.非糖尿病车辆）；然而，在接受治疗的糖尿病大鼠或糖尿病媒大鼠中未观察到这种敏感性增加（−log[M]：糖尿病媒：−10.37±0.3755，糖尿病利格列汀：−10.07±0.3587），表明两者之间存在显著的相互作用[F类(1,25) = 6.016,P（P）= .0215] (). 这些改善可能有助于增加脑灌注，并解释了利格列汀治疗后糖尿病皮质灌注增加的原因。
利格列汀治疗可改善糖尿病和非糖尿病大鼠MCA中胰岛素介导的血管舒张。将各组大鼠的MCA安装在加压动脉造影仪上，以评估血管功能。A类：对非糖尿病、非糖尿病+利那列汀、糖尿病和糖尿病+利那列汀患者的胰岛素进行了剂量-反应曲线分析。B类：在糖尿病溶媒组，与非糖尿病溶媒动脉相比，最大松弛度降低，利格列汀治疗改善了这种反应。C利格列汀治疗后，糖尿病组的总松弛反应得到改善。D类：用利格列汀治疗的非糖尿病大鼠对胰岛素反应的敏感性显著增加，但糖尿病大鼠的敏感性没有改善。松弛响应表示为与基线相比减少的%，结果以平均值±SE表示；n个=5/组，双向方差分析*P（P）<0.05与非糖尿病车辆###P（P）<0.001 vs.糖尿病车辆†疾病和治疗相互作用，P（P）= 0.019.
利格列汀治疗可改善糖尿病患者的血管重塑指数。
糖尿病还导致以肥厚性重塑为特征的病理性血管重塑，这可能会由于适当的血管功能和自身调节能力的破坏而导致脑灌注减少。为了确定利格列汀是否可以通过血管结构的改变介导脑灌注的变化，我们使用了相同的加压动脉造影系统并测定了MCA结构。与非糖尿病大鼠相比，糖尿病媒鼠表现出病理性重塑。横截面积最大值的增加（CSA）()，介质厚度（MT）()，以及介质与管腔（M:L）的比率()已观察到[F类(1,16) = 7.45,P（P）= 0.015,F类(1,16) = 9.55,P（P）=0.007，以及F类(1,16) = 5.05,P（P）分别=0.039]。在60–120 mmHg的压力范围内，观察到总CSA和MT也有类似的增加[F类(1,16) = 8.44,P（P）=0.010和F类(1,16) = 7.91,P（P）分别=0.013]。利格列汀治疗能够通过降低CSA、MT和M:L比率来逆转既定的血管重塑(,A–C). 在CSA、MT和M:L比率的最大值中观察到了这种影响[F类(1,16) = 5.15,P（P）= 0.037,F类(1,16) = 6.96,P（P）=0.018，以及F类(1,16) = 4.25,P（P）分别=0.056]，以及生理相关压力范围为60–120 mmHg的总CSA和MT[F类(1,16) = 6.44,P（P）=0.022和F类(1,16) = 7.15,P（P）分别=0.017(,A–C). 疾病和利格列汀治疗的效果是相加的。糖尿病有增加AUC总M：L比率的趋势[F类(1,16) = 3.40,P（P）=0.084]，利格列汀可以减少这种影响[F类(1,16) = 3.90,P（P）= 0.066]; 然而，结果并没有达到统计学意义。这些结果表明，不依赖血糖控制的利格列汀有助于逆转病理重塑，通过降低中风和血管认知障碍等脑血管并发症的风险，糖尿病患者可从中受益匪浅。
利格列汀治疗逆转糖尿病大鼠的病理性血管重塑。糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠在24至28周期间均服用166 mg/kg的利格列汀。死亡时，使用动脉造影仪评估MCA结构，并显示了5-120mmHg压力范围内的结果。糖尿病大鼠的横截面积增加（CSA；A类)、介质厚度（MT；B类)，和中腔比（M:L比；C)被动管腔直径无变化(). 利格列汀通过降低糖尿病患者的CSA、MT和M:L比率，逆转了糖尿病患者的血管重塑。结果以平均值±SE表示；n个=5/组，双向方差分析*P（P）<0.05与非糖尿病车辆#P（P）<0.05 vs.糖尿病车辆。
脑血流（CBF）与脑血管反应性和重塑的相关性。对胰岛素的最大反应与CBF之间存在显著的正相关(A类)和MT之间的显著负相关(C)和M:L比率(D类).B类：CSA呈不显著的负相关趋势。n个= 13–18. *P（P）<0.05，CBF与各血管指数的相关性。
脑灌注增加与血管功能和重塑的改善相关。
虽然利格列汀治疗显示可以改善胰岛素诱导的血管舒张和血管重塑指数，但评估这些影响是否独立于或与我们观察到的脑灌注改善相关很重要。我们使用四组动物进行了相关分析，并检查了脑灌注、胰岛素诱导的血管舒张和血管重塑指数之间的相关关系。胰岛素介导的血管舒张与脑灌注增加呈正相关() (P（P）< 0.05). 两个MT()和M:L比率()与脑灌注呈负相关(P（P）<0.05），而CSA之间的相关性()倾向于与脑灌注呈负相关，但没有达到显著性(P（P）= 0.18). 这些相关性提供了证据，证明我们在使用利格列汀治疗后观察到的脑灌注改善可能是由于血管扩张增加和脑血管重塑逆转所致；然而，这些关联的确切因果机制仍有待澄清。
利格列汀治疗不能改善肌源性反应。
脑血管的自我调节能力对脑灌注有很大影响。肌源性反应，即脑血管系统对灌注压力增加作出收缩反应的能力，在这种自我调节中起着重要作用，因此，在维持适当的脑灌注中也起着重要的作用。成肌反应受糖尿病和衰老的影响，因此，我们试图确定本研究中动物的MCA是否表现出可通过利格列汀治疗改善的肌反应性改变。所有四组大鼠均表现出肌源性反应受损，表现为活动管腔直径未随压力增加而减小(). 在最大压力下，糖尿病状态与利格列汀治疗之间存在显著的相互作用[F类(1,16) = 5.78,P（P）=0.029]，生理相关范围为60–120 mmHg[F类(1,16) = 6.80,P（P）=0.019]对于活动管腔直径，其中利格列汀治疗糖尿病增加了活动管腔直径，但在非糖尿病大鼠的血管中，它导致活动管腔直径减小。然而，在Tukey调整后，两组之间没有观察到统计上的显著差异。在60-120 mmHg的压力范围内，最大被动式管腔直径和被动式管腔直径的相互作用模式相似，但两者均未达到统计显著性[F类(1,16) = 2.89,P（P）=0.11和F类(1, 16) = 2.36,P（P）分别=0.14(). 虽然通过测量主动压力和被动压力发展来确定肌源性张力是一种适当的测量方法，但这些结果表明缺乏肌源性反应，因此肌源性紧张程度有限。这可能是由于衰老对脑血管肌源性反应的影响，我们之前已经证明，这会降低非糖尿病和糖尿病大鼠的肌源性张力(1,29).
利格列汀治疗后，老年糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠的肌源性反应受损没有改善。治疗后28周龄动物的血管因管腔内压力增加而收缩；所有四组均表现出压力诱导反应性受损。A类：在积极的条件下，利格列汀治疗糖尿病大鼠使这种反应恢复到非糖尿病媒大鼠的水平；然而，无论是糖尿病组还是非糖尿病组，利格列汀治疗都没有改善肌源性反应，两组之间也没有观察到显著差异。观察到糖尿病和利格列汀之间存在显著的相互作用，其中活动管腔直径增加，但在非糖尿病大鼠中，其减少。B类：在被动状态下，四组之间没有观察到显著差异，因为所有组都进行了类似的放松。结果以平均值±SE表示；n个=5/组，双向方差分析†疾病和治疗相互作用，P（P）=0.029，对于最大有效流明直径和P（P）=0.019，用于有效流明直径的曲线下面积。
在NOR测试中，利那列汀治疗不能改善短期海马依赖性学习。
我们之前已经证明，根据NOR测试评估，2型糖尿病GK大鼠表现出短期海马依赖性学习障碍。糖尿病与整体认知功能降低有关，这可能是由于血管并发症导致脑灌注减少所致。考虑到利格列汀治疗后大脑灌注、血管功能和血管结构的改善，我们试图确定短期海马依赖性学习是否有后续改善。我们再次在15分钟的短时间延迟内使用认知功能的NOR任务。与我们之前的研究类似，在治疗前的基线（24周龄），糖尿病导致NOR指数下降[F类(1,19) = 9.88,P（P）= 0.0054] ()和d2指数[F类(1,19) = 9.75,P（P）= 0.0056] (). 在用载体或利格列汀治疗4周后，无论是识别指数还是识别指数都没有显著差异或改善[F类(1,17) = 0.23,P（P）= 0.64] ()或d2指数[F类(1,17) = 3.50,P（P）= 0.079] ()对于非糖尿病组和糖尿病组++还评估了治疗期间的组内变化。确认指数无重大变化[F类(1,9) = 0.02,P（P）=0.90]出现在非糖尿病溶媒或利格列汀治疗组或糖尿病溶媒和利格列丁治疗组[F类(1,8) = 0.34,P（P）= 0.58] (). 非糖尿病组的d2指数也没有显著的组内变化[F类(1,9) = 0.51,P（P）=0.49]或糖尿病组[F类(1,8) = 2.39,P（P）=0.16]治疗后(). 这些结果表明，利格列汀治疗4周不能影响这种特殊的认知功能；然而，由于脑灌注增加，认知功能的其他任务是否会显示出有益的影响，仍有待观察。
用利格列汀治疗后，糖尿病大鼠的基线认知功能下降并没有改善。在治疗前24周龄时进行新的物体识别测试，以建立认知基线测量。两者的识别指数(A类)和d2指数(B类)这些实验表明，糖尿病大鼠的认知功能基线下降。结果以平均值±SE表示；n个=10或11/组，学生t吨-测试**P（P）与非糖尿病车辆相比，<0.01。用利格列汀治疗4周后，再次评估认知功能，两项识别指数均未发现显著改善(C)或d2指数(D类). 这些结果表明，无论是非糖尿病组还是糖尿病组，与基线相比，识别指数或d2指数均无显著变化或恶化。结果以平均值±SE表示；n个=5或6/组，单向方差分析。
讨论
本研究的主要发现是，利格列汀恢复了2型糖尿病大鼠受损的脑灌注，同时改善了胰岛素介导的血管舒张和病理性脑血管重塑，但这些结果与糖尿病大鼠短期海马依赖性学习的改善无关。此外，这些变化与利格列汀的降血糖作用无关。
在本研究中，我们使用了2型糖尿病模型，即自发胰岛素抵抗的GK大鼠。这是一种胰岛素抵抗的瘦模型，动物不存在代谢综合征的共病状态，如高血压、肥胖或高脂血症。这允许对血管结构和功能的胰岛素抵抗和高血糖进行专门检查。我们以前曾报道过糖尿病的进展与显著的血管重塑有关，其特征是多血管床血管中CSA、MT和M:L比率增加，如肠系膜动脉和MCA(22,29,46). 这些研究是用GK大鼠进行的，并证实了该模型中肥厚性重塑的发展。虽然口服降糖二甲双胍能够改善脑血管重塑和肌源性功能，但对改善患有糖尿病的GK大鼠MCA中受损的内皮依赖性舒张功能没有任何作用(2). 考虑到脑灌注与血管半径的四次方有关(41)，管腔直径的任何减小都可能导致脑灌注的显著减少。因此，血管结构的任何改善都有可能对脑缺血和中风的发展提供治疗益处(39). 我们关于二甲双胍改善血管结构的研究结果表明，二甲双胍在预防糖尿病脑血管病方面具有治疗益处。然而，糖尿病的特点是血管收缩剂化合物（如内皮素-1）增加，血管舒张NO的生物利用度降低，从而导致血管功能障碍(25). 由于二甲双胍不能改善脑血管功能障碍，我们试图确定这些结果是否是二甲双胍的特异性结果，或者用另一种治疗药物控制血糖是否会提供类似的结果。
虽然利格列汀是FDA批准的降糖药，但我们发现它不能控制糖尿病动物的血糖。肠促胰岛素激素GLP-1和GIP由肠道的肠内分泌细胞分泌，以响应富含碳水化合物的膳食，它们有助于增加胰腺β细胞的胰岛素分泌，并减少胰腺α细胞的胰高血糖素分泌(12,30,47). DPP-IV是一种降解这些糖调节化合物的酶，抑制这种蛋白水解活性已被证明可以延长GLP-1和GIP的生理作用(33). 肠促胰岛素激素也能在心脏骤停后急性输注后保护微血管内皮功能，提示肠促胰岛素水平升高对心血管疾病有益(10). 重要的是，DPP-IV抑制剂发挥的多效性作用与其抗高血糖作用无关。费雷拉等人(19)显示西他列汀在消除血糖功能障碍、高甘油三酯血症、炎症和高血压方面是有效的。在实验性动脉粥样硬化模型中，DPP-IV抑制剂的抗炎作用在调节内皮细胞生长和单核细胞募集方面得到了进一步证实(37,49). 利那列汀是最新的DPP-IV抑制剂，与药物类别的其他成员相比，具有更高的结合亲和力和效力(11). 我们能够证明利格列汀治疗能够降低非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠的血浆DPP-IV活性水平，这表明血糖水平缺乏降低并不是因为缺乏药物疗效。然而，由于治疗组和未治疗组之间的胰岛素水平没有差异，DPP-IV抑制的减少并没有导致随后的胰岛素分泌增加。我们推测长期血糖控制缺乏降低（由观察到的血红蛋白A指示1c个DPP-IV水平的抑制可能需要大于我们在本研究中所取得的结果，才能显著增强肠促胰岛素激素的作用。其他研究也同样表明，用利格列汀治疗后，大鼠和小鼠的血糖水平都没有降低，并且他们的DPP-IV活性降低（～50%）与当前研究大致相同(32,34,36).
功能良好的血管系统是通过优化脑灌注来响应脑组织代谢需求的必要条件(6)我们以前曾报道过，在年轻的糖尿病大鼠中，基线脑灌注减少(28). 在本研究中，这种减少在老年糖尿病大鼠中持续存在。我们在这里证明，利格列汀治疗4周可以改善糖尿病组中观察到的脑灌注减少，将灌注恢复到非糖尿病组的水平。与溶媒组相比，非糖尿病组的利那列汀治疗并未增加脑灌注，这表明这些大鼠的脑灌注可能已经达到适当的最大水平。胰岛素治疗可以改善皮层灌注(26)我们推测，利格列汀治疗后胰岛素介导的血管舒张功能的改善，加上血管结构的改善，可能是糖尿病患者脑灌注减少的改善原因。
我们的发现是，用利格列汀治疗的非糖尿病大鼠MCA中胰岛素介导的舒张功能也得到改善，这表明利格列汀能够改善不依赖血糖控制的内皮依赖性血管舒张功能。我们的研究使用的胰岛素浓度范围为0.1 pM至1μM。正常空腹血浆胰岛素水平通常低于46.6 pM的近似值，并且可以达到进食后胰岛素水平的5倍(44). 糖尿病和肥胖患者的胰岛素水平也高于正常人(13,43)接受诺和诺德0.15单位/千克体重胰岛素注射的患者（新泽西州普林斯顿诺和诺德斯处方信息）平均血浆胰岛素水平达到586.2纳姆左右。本研究中使用的动物的血浆胰岛素水平均为～1 ng/ml（170 pM），因此本研究剂量反应实验中使用的胰岛素浓度范围包括生理、病理生理和药理水平。因此，在本研究观察到的时间点，糖尿病媒大鼠大脑中动脉对胰岛素诱导的血管舒张反应缺乏可能不是由于高胰岛素血症引起的受体下调所致。其他研究表明，胰岛素诱导的血管舒张依赖于内皮源性NO和EDHF，并以血管平滑肌细胞钾通道为靶点发挥其作用。在胰岛素抵抗的肥胖模型中，由于NOS解偶联和NADPH氧化酶活性异常导致NO生物利用度降低，这在很大程度上是由于氧化应激循环导致的血管舒张反应降低(27). 我们的结果表明，在2型糖尿病患者中，脑血管系统对胰岛素的反应能力减弱，导致血管舒张功能降低，从而增加脑灌注。我们证明，在胰岛素诱导血管舒张增加的动物血管中，与脑灌注增加显著正相关，这支持了这种关联。利格列汀治疗可能会降低脑血管重塑引起的内皮损伤，从而提高NO的生物利用度。利格列汀治疗后，糖尿病患者发生的病理性脑血管重塑指标，即MT、CSA和内侧壁与管腔比率的降低也与脑灌注增加显著相关。这些改善独立于血糖或血浆胰岛素水平的变化，表明利格列汀治疗能够独立于其预期用途改善脑血管功能和结构，从而为其用作脑血管疾病治疗剂开辟了可能性。
脑灌注在很大程度上取决于功能良好的血管系统，因此，任何对脑血管结构或功能的病理损伤都会产生重大影响。肌源性反应，即脑血管系统对灌注压力增加作出收缩反应的能力，在自我调节中起着重要作用，因此，在维持适当的脑灌注中也起着重要的作用。大血管（如MCA）在维持脑灌注中至关重要，因为它们对大脑中的血管阻力起着重要作用(40)我们观察到，在所有四个组中，对灌注压力增加的肌源性反应均受损。虽然利格列汀治疗增加了活动管腔直径，但在60–120 mmHg的自动调节范围内管腔直径仍然没有减少。这表明老年大鼠失去了肌源性反应，尽管利格列汀治疗后血管结构有所改善，但无论是非糖尿病组还是糖尿病组，这种反应都没有伴随改善。这与我们实验室先前对年轻和老年大鼠肌源性反应的研究一致。我们已经表明，在糖尿病GK大鼠的MCA中，肌原性张力增加，以及在较高压力下的强迫扩张(29). 肌原性张力的增加与年龄有关，因为老年糖尿病大鼠在18周时失去了自我调节能力，并且与10周时相比，肌原性紧张度大大降低(28,29)，这种影响持续了22周(2). 与本研究中使用的逆转策略相比，早期使用利格列汀治疗的预防策略可能更有效地改善肌源性反应。此外，鉴于我们之前的研究结果表明，二甲双胍治疗也可以改善血管结构，二甲双酮和利格列汀联合治疗2型糖尿病患者可能比单独治疗更有效。
有证据表明，糖尿病引起的脑血管疾病会导致脑灌注的改变，从而导致中风和阿尔茨海默病和痴呆症等神经变性疾病(15,31). 糖尿病患者的脑灌注减少已被证明与认知障碍和神经退行性疾病的进展有关(23,24). 我们之前使用GK模型表明，10–12周龄糖尿病大鼠表现出短期海马依赖性学习障碍，这是通过基线时的新目标识别进行评估的(45)这种损伤在我们的老年糖尿病GK大鼠中持续存在，同时大脑灌注减少。
DPP-IV抑制剂的多效性作用已被证明可以改善糖尿病患者的认知功能，这是由低灌注和缺血引起的。由于中风是糖尿病患者脑缺血和认知功能障碍的主要原因，一些研究已经检验了DPP-IV抑制剂治疗在这种情况下是否可以导致神经保护。利格列汀对2型糖尿病小鼠的治疗不依赖于对血葡萄糖的影响，能够显著减少缺血性脑损伤(8)，该效应后来被证明是GLP-1依赖性的(7). 在表现出学习和记忆缺陷的高脂肪喂养小鼠中，用西他列汀治疗能够通过减少氧化应激和增强神经发生来改善识别记忆和学习(20). 利格列汀还可以改善2型糖尿病小鼠因短暂脑缺血而导致的认知障碍和脑萎缩(36). 在我们的研究中，虽然利格列汀治疗能够将脑灌注恢复到非糖尿病组的水平，但根据NOR评估，短期海马依赖性学习没有相关改善。这表明，利格列汀治疗对脑灌注的改善无法在4周内显著改善这一认知功能指标。利格列汀治疗持续时间延长可能有助于逆转这种特定的认知障碍。鉴于前面提到的研究表明，使用DPP-IV抑制剂治疗后，认知功能的各项指标都有所改善，本研究中未进行的其他认知功能测量也可能受到影响，值得使用一系列认知测试进行进一步探索，包括NOR，评估长期海马依赖性学习。此外，利格列汀治疗可能无法挽救受脑灌注减少影响的脑组织，因此，采取预防性策略更为合适。
当前研究存在一些局限性。虽然这项研究是有意的，但仅使用雄性大鼠限制了我们对不同性别的研究结果的推断，因此，需要比较利格列汀对两性血管结构和功能的影响。鉴于利格列汀改善了糖尿病大鼠的脑灌注减少，对其他认知领域的检查显示出益处。关于脑灌注结果，必须考虑到异氟醚的潜在影响。然而，我们在之前的研究中测量了氯胺酮/噻嗪和异氟醚麻醉下的脑灌注和功能性充血，发现这两种麻醉方法的测量结果相似。我们也没有观察到对照组与糖尿病组动物之间的差异。此外，虽然在脑灌注、胰岛素诱导的血管舒张和脑血管重塑之间发现了关联，但这些发现之间的因果机制联系仍有待完全确定。
观点和意义
本研究提供的证据表明，在2型糖尿病模型中，利格列汀治疗可以改善脑血管功能障碍和重塑，而不依赖于血糖控制。这对易患脑血管并发症（如中风和认知障碍）的糖尿病患者具有重要意义。这些结果强烈表明，使用利格列汀等DPP-IV抑制剂治疗已确诊血管疾病的糖尿病患者，其疗效与抗高血糖药物的作用无关。
披露
这项研究在一定程度上是通过向Adviye Ergul（来自Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals）的独立拨款实现的，后者为该研究提供了研究材料和资金支持。
作者贡献
T.H.和A.E.研究的概念和设计；T.H.、A.Y.、M.A.、M.C.、S.E.-S.和W.L.进行了实验；T.H.、A.Y.和M.H.J.分析数据；T.H.和A.E.解释了实验结果；T.H.准备的数字；T.H.起草的手稿；T.H.、M.C.、M.H.J.和A.E.编辑和修订手稿；T.H.和A.E.批准了手稿的最终版本。
致谢
Adviye Ergul是佐治亚州奥古斯塔查理·诺伍德退伍军人事务医疗中心的研究职业科学家。作者符合国际医学期刊编辑委员会（ICJME）推荐的作者标准，并全面负责试验和出版物开发的所有方面。内容并不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。
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