一种新型斑马鱼ret（雷特）先天性巨结肠的杂合模型确定了其功能性作用地图10作为肠神经系统表型严重程度的修正

ENCC迁移缺陷导致肠神经元丢失ret（雷特）^胡2846/+幼虫

确定肠系膜远端肠区肠神经元的减少或缺失ret（雷特）^胡2846/+和ret（雷特）^{胡2846/胡2846}幼虫分别是由祖细胞的异常肠道定植或其神经分化缺陷引起的，我们使用独立的ENCC标记分析了迁移神经嵴衍生细胞的肠道定植nadl1型.2[24]. 在3dpf时，nadl1型.2-在所分析的所有WT幼虫中，沿肠管全长检测到表达细胞(图1B). 相反，nadl1型.2⁺在同一阶段的肠道内不同位置发现细胞ret（雷特）^胡2846/+幼虫，肠道中没有ret（雷特）^{胡2846/胡2846}幼虫(图1B). 基于这些实验，我们认为ret（雷特）突变斑马鱼反映了ENCC在发育过程中未能定植器官。

ENCC肠道定植缺陷ret（雷特）^胡2846/+幼虫可能是由于祖细胞池尺寸减小，与细胞增殖减少或细胞死亡增加有关，或ENCC迁移潜力减弱，或这些因素的组合。为了区分这些机制，我们利用斑马鱼提供的独特潜力，直接可视化ENS祖细胞的迁移体内首先，我们探索了用于标记其他神经外胚层谱系的二进制报告系统可用于标记ENCC的可能性。通过杂交表达Gal4转录激活物基因陷阱结构的SAGFF234A转基因鱼[28,29]UAS:GFP转基因动物[28]，我们能够标记出中枢神经系统和肠道内的几个神经谱系。仔细检查发现GFP在ENCC和几乎所有肠神经元中表达(S2图). 使用该工具，我们随后检查了增殖减少和/或细胞死亡增加是否会导致ENCC定植肠道的能力受损。BrdU掺入（标记细胞周期S期的细胞）表明，在48hpf时，ENCC的增殖在ret（雷特）^胡2846/+和WT胚胎(S3A–S3C图). 此外，没有TUNEL⁺在表达GFP的WT或ret（雷特）^胡2846/+胚胎(S3F–S3I图). 这些观察结果表明，在ret（雷特）^胡2846/+杂合子幼虫不太可能是由于ENS祖细胞池的缩小造成的。

在这些研究过程中，我们注意到，前进ENCC组的形状在ret（雷特）^胡2846/+胚胎与WT胚胎的比较(S3D和S3E图)增加了移民赤字的可能性。我们通过使用延时共焦显微镜记录ENCC的迁移行为直接验证了这一观点。我们观察到，在48hfp和72hpf时，迁徙人口前沿的前进速度分别降低了30%和25%(图2A和2B,S1（第一阶段）和S2系列电影）。我们得出结论，肠道神经元未能完全定植ret（雷特）^胡2846/+斑马鱼的内脏可能是由于肠道定植期间ENCC种群的迁移速度降低所致。

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图2

ret（雷特）^胡2846/+幼虫表现出ENS祖细胞迁移缺陷。

借助SAGFF234A实时可视化偏移前沿（波前）的ENS祖细胞偏移；UAS:GFP背景标签ENCC。（A） 来自WT共焦延时记录的代表性静态图像（深度编码以解析2个迁移流）(ret（雷特）^+/+)和ret（雷特）^胡2846/+胚胎在0分钟（48hpf）和500分钟（56hpf）时，表明在ret（雷特）^胡2846/+幼虫相对于WT幼虫。星号表示ENS列外的GFP+细胞保持在相同位置。（B） 计算的波前偏移速度（微米/分钟）在ret（雷特）^胡2846/+幼虫在48-56hpf（p=0.0022）和72-80hpf（p=0.0182）时相对于WT。

正常肠道运动需要Ret

检查ret（雷特）视频记录了7dpf幼虫ENS运动输出和肠道运动的突变。与之前的观察结果一致[30]在WT幼虫的肠球中，我们观察到翻转逆行波（肛门到口腔），而在肠道中我们观察到顺行波（推进口腔到肛门）蠕动波(图3A,S3电影). 重要的是，记录的肠道运动模式具有可重复性，显示出规则的方向性和频率、一致的行进距离和固定的速度(图3A)，可以量化和详细评估ret（雷特）突变。ret（雷特）^{hu2846/hu2846}幼虫在肠道的顺行蠕动活动中表现出严重缺陷，包括收缩丧失(图3A和3C,S5电影)频率、距离和速度降低，间隔增加(图3B). 正常的周期性逆行运动模式也在ret（雷特）^{胡2846/胡2846}幼虫和肠球的运动变得几乎连续(图3C). 这些发现清楚地表明，肠道内存在肠神经元是正常肠道运动所必需的。

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图3

肠动力受损ret（雷特）^胡2846/+和ret（雷特）^胡2846/2846幼虫。

（A） 为量化活的7dpf斑马鱼幼虫400秒肠道运动记录而生成的时空图（STM）。重量(ret（雷特）^+/+)幼虫在肠球（括号）中表现出周期性的逆行（肛门到口腔）运动模式，在肠中表现出从肠球/肠交界处开始的顺行（口腔到肛门）蠕动波（白色箭头）；黑色箭头表示运动终点。的STMret（雷特）^胡2846/+ENS表型和ret（雷特）^胡2846/2846幼虫表现出周期性逆行运动模式（括号）以及顺行运动波的频率和距离（白色到黑色箭头）的改变。（B） 顺行收缩特征。表型的(ret（雷特）^胡2846/+P） 和非表型(ret（雷特）^胡2846/+NP）幼虫的免疫组织化学鉴定。减小的蠕动频率ret（雷特）^胡2846/2846幼虫和ret（雷特）^胡2846/+P相对于WT（单因素方差分析，P=0.0004；Bonferroni事后分析，P=0.0001和P=0.0367），并且在ret（雷特）^胡2846/2846幼虫与ret（雷特）^胡2846/+NP（p=0.0002）和ret（雷特）^胡2846/+P（P=0.0035）。缩短收缩行程ret（雷特）^胡2846/2846幼虫相对于WT（单向方差分析，p=0.0005；Bonferroni's post-hoc，p=0.002），以及相对于两者ret（雷特）^胡2846/+P（P=0.0232）和ret（雷特）^胡2846/+NP（p=0.0237）。收缩速度降低ret（雷特）^胡2846/2846相对于WT（单因素方差分析，p=0.0212；Bonferroni的事后检验，p=0.0138）。收缩间隔增加ret（雷特）^胡2846/2846幼虫相对于WT和ret（雷特）^胡2846/+NP（单向方差分析，p=0.0078；Bonferroni's post-hoc，p=0.0053，p=0.0097）。（C） 失去顺行收缩ret（雷特）^{hu2846/hu2846}幼虫与WT和ret（雷特）^胡2846/+NP（#，费希尔精确，p=0.0198和p=0.028）。ret（雷特）^胡2846/2846与所有其他基因型相比，幼虫表现出逆行运动改变，收缩失去循环模式（Fisher精确，vs.WT:p=0.0001，vs。ret（雷特）^胡2846/+NP:p=0.001，与。ret（雷特）^胡2846/+P： P=0.0082）。（D） SAGFF234A中的等效分析；UAS:GFP背景，在ENS细胞及其过程中表达GFP，能够绘制相对于细胞体位置（GFP）的收缩终点⁺户口C/D⁺单元格，r_秒=0.8857，p=0.0333）和细胞过程（GFP⁺户口C/D⁺过程，r_秒=0.942，p=0.0167）。黑线表示线性拟合。

接下来，我们分析了减少ret（雷特）肠蠕动的表达ret（雷特）^胡2846/+幼虫。由于ENS肠道定植表型在该基因型中是可变的(S1B–S1D图)，运动记录后进行HuC/D免疫染色⁺肠神经元位置。的时空图（STM）ret（雷特）^胡2846/+幼虫完全定殖（非表型，NP；S1B图)与野生动物基本上没有区别(图3B和3C). 相比之下ret（雷特）^胡2846/+幼虫具有明确的定殖表型（表型，P；S1C和S1D图)顺行收缩频率有显著变化(图3B)运动波过早终止(图3A，黑色箭头，S4电影). 为了更准确地确定神经元缺失对运动的影响，我们分析了ret（雷特）^胡2846/+SAGFF234A中的胚胎；UAS:GFP背景，允许我们绘制相对于最后一个GFP位置的顺行收缩终点⁺户口C/D⁺细胞体或神经元过程（参见S2E图). 我们观察到蠕动端点和HuC/D的位置之间存在紧密的相关性⁺肠道细胞及其过程(图3D)进一步表明肠神经元对正常肠道运动的需求。这些发现，加上我们未能观察到神经元分化或亚型组成的缺陷ret（雷特）^胡2846/+幼虫(S3K和S3M图)表明ret（雷特）^胡2846/+幼虫的主要原因是ENCC无法在远端肠道定植，并伴有肠神经元减少。综合这些研究表明ret（雷特）^胡2846/+该线为分析与肠道无胶质细胞病和HSCR相关的肠道运动障碍提供了一个极好的模型。

地图10作为ENS发育的修饰基因

尽管RET信号的改变是几乎所有HSCR病例的基础，但与该基因座相关的绝大多数遗传改变表现为非编码、调节性突变[18]. 尽管这种突变被认为会增加HSCR的易感性，但疾病表型的充分表达需要与未连锁修饰基因的突变相互作用[18]. 为了测试ret（雷特）^胡2846/+基因型代表一个敏感的遗传背景，适用于基于表型的修饰位点筛选，以影响ENS定植表型的严重程度和HSCR疾病的表现，我们检测了地图10ENS表型基因ret（雷特）^胡2846/+幼虫。我们的重点是地图10因为几个原因被导演。第一，地图10在屏幕上突出显示，以识别新的脊椎动物ENS标记，并在哺乳动物ENS中高度表达[31]. 第二，Mapk家族成员（也称为Jnks）在癌细胞信号中作用于Ret下游[32]. 第三，马普RET中信号受损^S697A系列突变小鼠和Mapk抑制剂阻断ENCC在培养肠道中的迁移[33]. 最后，复制中的编号变量地图10在HSCR患者中发现[34]. 通过比较地图10WT肠道中的转录物，ret（雷特）^胡2846/+和ret（雷特）^{胡2846/胡2846}幼虫，我们首先确定与哺乳动物胚胎相似[31],地图10在斑马鱼ENS中表达(图4A，另请参见S4图). 接下来，我们使用一个MO进行了基因敲除实验，该MO旨在阻止地图10外显子4内含子4/5边界(地图10MO），并产生缺乏所有已知保守功能结构域的截短蛋白(S5A图).地图10对WT和WT杂交产生的胚胎进行MO注射ret（雷特）^胡2846/+动物，预计会产生WT和ret（雷特）^胡2846/+胚胎比例为1:1。相对于对照MO，注射地图10MO进入WT胚胎后，4dpf幼虫肠道中的肠神经元数量显著减少，具有统计学意义(图4B和4C)，建议角色地图10ENS开发期间。有趣的是，注射地图10MO进入ret（雷特）^胡2846/+胚胎导致肠道神经元相对于ret（雷特）^胡2846/+注射对照MO或WT胚胎的胚胎注射地图10生产任务单(图4B和4C). 这些结果确定了地图10在ENS发展过程中，并表明地图10和ret（雷特）从而为独立分离位点的突变修改模型提供了支持房地产税活动和HSCR疾病表现。

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图4

使用ret（雷特）^胡2846/+作为敏感背景来测试地图10作为ENS发育修饰基因。

（A） 核糖核酸就地杂交显示地图10表达与ENS在WT中的位置相关(ret（雷特）^+/+),ret（雷特）^胡2846/+、和ret（雷特）^{胡2846/胡2846}3dpf幼虫（星号表示肠道末端，填充箭头表示地图10⁺细胞，开放箭头表示肠道区域缺乏地图10⁺单元格）。（B） MO基因敲除地图10（使用拼接块MO，地图10MO）在WT x的胚胎上进行ret（雷特）^胡2846/+交叉以允许WT和ret（雷特）^胡2846/+与对照MO进行比较。4dpf下HuC/D免疫染色显示，当地图10MO被注入ret（雷特）^胡2846/+胚胎。星号表示肠管末端（肛孔），箭头表示最后一个HuC/D的位置⁺神经元。（C） 最后5个体节长度的神经元数量量化显示地图10与注射对照MO的WT幼虫相比，MO进入WT胚胎会导致肠道中肠道神经元的中度、统计显著性减少（单向方差分析，p<0.001；Bonferroni的事后检验，p=0.0033），这表明了MO在肠道中的作用地图10ENS正常发育。注入地图10MO进入ret（雷特）^胡2846/+胚胎导致肠神经元严重减少，这与上述两种情况在统计学上都不同ret（雷特）^胡2846/+注射对照MO（单向方差分析，p<0.001，Bonferroni事后检验，P（P）<0.0001）或地图10MO注射到WT胚胎中（单向方差分析p<0.001，Bonferroni的事后检验p=0.006）。

一本小说地图10突变斑马鱼表现出温和的ENS定殖表型

虽然MOs是宝贵的筛查工具，但它们的使用可能会导致非特异性效应，混淆实验解释[21]. 因此，我们采用了基因组编辑技术[35]生成地图10突变株系并完善我们的分析。使用TALEN[36]，除其他突变外，我们在外显子4中产生了一个10碱基对缺失(地图10^Δ10)导致开放阅读框架中的移码，导致终止密码子提前终止和蛋白质截断，从而缺乏整个蛋白激酶催化结构域和所有Mapk/Jnk保守结构域(S5B图).地图10^Δ10/+和地图10^Δ10/Δ10斑马鱼可以存活和繁殖，没有明显的形态或行为表型。

为了进一步检查地图10在ENS发育过程中，我们比较了4dpf WT远端肠道的肠神经元数量，地图10^Δ10/+和地图10^Δ10/Δ10幼虫。虽然在WT和杂合子之间没有检测到差异地图10^Δ10幼虫，地图10^Δ10/Δ10幼虫肠道中ENS细胞数量相对于WT的减少相对较小，但在统计学上显著(图5A). 在所有基因型中，远端肠道中含有一定范围肠道神经元的动物百分比呈正态分布(图5B). 总之，这些观察结果与观察到的地图10MO注入并确认角色地图10ENS正常发育。虽然两者都是地图10功能丧失实验表明，减少ENS神经元数量的效果相同地图10MO对ENS定植的影响比在纯合型中观察到的更为深远地图10^Δ10（比较图​图4C4摄氏度到​至5A）。5A级). 一种可能的解释是，由MO引起的非特异性缺陷，如细胞死亡和发育延迟，可能会加剧表型[21]. 或者，最近有人认为斑马鱼遗传突变体中可能存在补偿机制，导致遗传突变体的表型比MO产生的表型温和[37]. 因此，这些观察结果强调了采用一系列功能分析来验证结果的实用性。

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图5

地图10作为候选，以解释HSCR中不同的表达能力。

（A） 4dpf仔鱼远端肠道中肠神经元数量的测定地图10^Δ10/+和ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/+斑马鱼。WT和杂合子之间未检测到差异地图10^Δ10幼虫，但地图10^Δ10/Δ10幼虫肠道中ENS细胞数量相对于WT略有减少，但在统计学上有显著意义（单向方差分析，p=0.0442，Tukey post-hoc），这表明地图10ENS正常发育。未检测到两者之间的显著差异ret（雷特）^胡2846/+和地图10^Δ10/+;ret（雷特）^胡2846/+然而，幼虫的损失地图10在中ret（雷特）^胡2846/+背景导致神经元数量的统计学显著减少（Welch的单因素方差分析，第页= 0.048). （B） 为了检查表型分布，根据远端肠道中的神经元数量对斑马鱼个体进行分类。重量，地图10^Δ10/+和地图10^Δ10/Δ10幼虫表现出正态分布的表型（分别为蓝色、红色和绿色条，Shapiro-Wilk正态性检验，WT:p=0.776地图10^Δ10/+：p=0.910，对于地图10^Δ10/Δ10：p=0.1149）。尽管ret（雷特）^胡2846/+幼虫肠道具有表型，在远端肠道区域显示出一系列神经元数量，反映了轻度和逐渐加重的定植表型的正常分布（夏皮罗-威尔克正态性检验，p=0.5720，蓝条）ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/+（红色条）和ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/Δ10幼虫肠道（绿色条）呈现非正态分布模式（Shapiro-Wilk正态性检验ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/+：p=0.0054，对于ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/Δ10p=0.0014），肠神经元计数ret（雷特）^胡2846/+;地图10^Δ10/Δ10与ret（雷特）^胡2846/+幼虫（Brown-Forsythe，0.0445）。

ENCC迁移速度降低是HSCR样表型的主要原因

功能性肠神经回路的组装依赖于重叠的发育过程，即ENCC的存活和增殖、沿肠道的迁移以及分化为多种神经元和胶质细胞类型[12,13]. 尽管这些过程中的任何一个缺陷都可能导致肠道无神经节细胞病[12,13]它们对ENS发展的相对贡献尚不清楚。通过将斑马鱼遗传学的力量与斑马鱼的光学可及性相结合，我们在这里证明，ENCC流的迁移速度降低是ENS在肠道远端丢失的主要决定因素ret（雷特）^胡2846/+幼虫。这些实验证实了最近使用小鼠器官型培养物进行的研究，这些培养物受到了内皮素受体信号转导，其结论是ENCC迁移速度降低是该范式中无神经节细胞增多症的主要机制[38]. 自从房地产税和EDNRB公司是家族性HSCR病例中最常见的遗传改变（约5%的HSCR患者检测到EDNRB突变）[8]我们的数据，以及Young等人的数据[38]提示ENCC迁移减少是HSCR患者远端结肠神经节形成失败的关键致病机制。虽然我们没有获得细胞增殖缺陷或凋亡细胞死亡的证据ret（雷特）^胡2846/+胚胎，这些过程在HSCR样表型中的潜在贡献仍有待确定。然而，我们目前的研究强调了不同细胞过程对Ret活性降低的不同敏感性。

与肠神经元的存在和位置相关的有组织运动模式

虽然ENS在调节肠道运动方面的重要性已得到公认[11]，在无神经节细胞增生症小鼠模型中观察到的肠道运动障碍仍然缺乏特征体内通过对活斑马鱼幼虫的视频记录进行系统分析，我们证明ret（雷特）^胡2846纯合子幼虫表现出明显的肠道运动缺陷，表现为几乎完全消除了顺行蠕动波。这一发现与在sox10型^无色的缺乏肠神经元的纯合斑马鱼[39]钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX）处理的WT幼虫的运动性变化[30]. 在ret（雷特）^胡2846杂合子幼虫，可能反映了HSCR患者的运动障碍[40]. 肠道神经元的可控制数量，以及清楚地显示神经元胞体及其沿肠道的投射的能力，使我们能够使用个体ret（雷特）^胡2846杂合子幼虫代表不同程度的远端无神经节细胞增多症，以高分辨率绘制运动波终点相对于最后一个神经元和/或神经投射的位置。我们显示的有组织蠕动和神经元位置之间的密切联系建立在先前观察到的神经节状态和运动之间的相关性之上[41]并明确了神经网络对肌肉局部控制的要求。神经节状态与产生运动波能力之间的关系具有临床意义[42]. 我们的研究可以解释为什么在HSCR患者中观察到过渡区牵拉（TZPT）（手术后部分降神经节肠道仍保留）后运动能力受损（包括便秘）[43]. 此外，我们的观察结果表明，通过干细胞移植成功治疗长段HSCR的前景[44–47]，将需要沿其全长定植无神经节肠段。使用这种斑马鱼模型的进一步研究有可能在神经节增生状态与其调节蠕动和其他ENS调节过程的能力之间建立联系，并确定恢复有组织运动所需的最小神经功能单位。最后，我们建议，对实际肠道运动的STM分析可以作为高灵敏度分析的基础，以评估遗传途径和环境（包括管腔）因素（即[48]关于控制肠道运动行为的神经元回路的组装。

核糖核酸就地杂交和抗体染色

原位RNA如前所述，使用nadl1型.2探针[24]PTU处理的胚胎。的探针地图10是通过RT-PCR扩增产生的[62]针对NM_001037701.1（GATTCAGCACACTCA和GCCGAAATCCAAAAATCTTCA）的引物扩增出一个837bp的片段，该片段对应于地图10). 该产品被克隆到pGEMT-Easy中并进行序列验证，命名为地图10-3，线性化SalI公司，并用T7聚合酶转录。胚胎和幼虫的免疫染色基本上如所述[63]，除了在4°C的4%PFA中过夜固定后，将样品在含有0.1%TritonX（PBT）的PBS中洗涤3次，在水中平衡1分钟，在-20°C的丙酮中透化，在水中重新平衡1分钟，并在封闭前在PBT中洗涤，与一级抗体孵育，如前所述，用二级抗体清洗和孵育[63]. RNA后免疫染色就地固定后处理样品20分钟，在PBT中洗涤5次，然后与一级抗体孵育后进行杂交，所有后续步骤如上所述。使用的抗体如下：Hu（小鼠，Life Technologies A21272，1:200）、GFP（小鸡，Abcam ab13970，1:500）、BrdU（大鼠，Abcam，ab6326，1:2000）、5-HT（兔，Sigma，1:2000，）和适当的Alexa Fluor结合二级抗体（分子探针）。

用于细胞增殖分析的BrdU掺入

胚胎与BrdU孵育30分钟，基本上如所述[64]除胚胎在PTU中饲养，固定后，在甲醇中脱水、复水、PBT中洗涤、在10mg/ml蛋白酶K中消化10分钟、在PBT中清洗、在4%PFA中后固定20分钟外，其余均进行免疫染色。然后在水中清洗胚胎，在2N HCl中平衡，然后在室温下在2N盐酸中变性1小时，用两个10分钟的0.1M四硼酸钠洗涤液中和，并在PBT中清洗，然后如上所述进行封闭和免疫染色。

TUNEL染色用于凋亡细胞死亡分析

使用TUNEL方法检测凋亡DNA片段。免疫染色后进行，如上所述[65]并使用ApopTag Red现场细胞凋亡检测试剂盒，用于直接检测DNA片段。

ENS祖细胞迁移的延时成像

胚胎在PTU中饲养至48hfp，轻度麻醉（鱼水中0.15mg/mL Tricaine），并安装在胚胎阵列中[66]嵌入0.6%的低熔点琼脂糖中（用0.5倍达尼奥溶液与PTU和Tricaine制成）。在徕卡TCS SP5共焦仪上进行延时成像36小时，以成像设置的最大采集速度（帧间隔374秒）采集每个胚胎的z堆栈。斐济[67,68]带有Trackmate插件[69]用于计算移动距离并计算迁移波前的迁移速度（定义为最远端GFP+细胞的位置）。

ENS神经元计数

使用组织标记来定义肠道长度，对远端肠道中神经元的数量或位置进行标准化量化。在大多数分析中，HuC/D⁺分别对4dpf和3dpf幼虫的ENS神经元进行计数，从肛孔开始，一直到肠球，直到5或10个体节长度被覆盖为止。此外，10的位置^第个最远端HuC/D⁺根据肛孔体节长度对3dpf幼虫的ENS神经元进行评分。

肠道运动的视频成像和分析

未经PTU培养胚胎。在5dpf和6dpf喂食后，幼虫于6日晚转移到新鲜的盘子中^第个dpf，以使肠道运动在7dpf时可视化，而无内腔内容物。将单个幼虫转移到含有麻醉剂的鱼水中（鱼水中含有0.15mg/mL Tricaine），然后放置在琼脂糖槽中，在侧面自由漂浮，并使用QCapture Pro 6.0软件（Q-Imaging）的QICAM-Fast相机以每秒2.5帧的速度拍摄16分钟的图像。使用Igor Pro（WaveMetrics）和自定义编写的算法对电影进行分析，从而可以在成像期间计算和绘制肠壁的运动。生成时空图并用于确定收缩的存在和方向以及收缩频率（1000 s波^-1，行进距离（mm），速度（总传播距离上的平均速度；mm/s^-1)、和间隔，类似于以前的方法[30].

吗啉寡聚注射液

全部地图10序列信息基于合奏Zv9内部版本。这个地图10拼接-嵌段吗啉寡核苷酸（MO）（GeneTools LLC）地图10MO靶向内含子3/4外显子4剪接连接（TGCCAAAACCTCTGTGGGAGATAAA），导致第4外显子切除，经测序证实。对照胚胎注射Gene Tools标准对照MO（CCTCTTACCTCAGTTACATATA）。的功效地图10MO基本上按照所述通过RT-PCR测试[24]用外显子3和7的引物（TGTGAAGATGCCTTTTGTCA和AATGCAGGTTTGATTCCA）扩增500 bp的带，如果外显子4被切除，则扩增330 bp的带。凝胶分离预期尺寸的条带，并按所述验证序列[24].

TALEN基因靶向

根据TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0（康奈尔大学，http://boglab.plp.iastate.edu) [70,71]如下：TALEN目标站点T CCACCTTCACGGTTCCAAA cggtaccaaaatctaaa GCCCATTGTCTGGCTC A（包括一个Kpn1站点），地图10TAL左HD HD NI HD NG HD NI-HD NN NN NG NG HD NG ND NI-NI，地图10好吧，NN NI NN HD HD ND NI NI HD NI NG NN NN ND HD。使用的最终质粒，pCS2-TALDD和pCS2-TALRR，如所述[36]. 人力资源管理筛查协议基本如所述[36]，使用引物fwd:ATTCCACCTTCACGGTTCC，版本：CTGAATGTGAATACTCACCACC。高保真PCR扩增、克隆和测序地图10的目标站点地图10Δ10创始人斑马鱼（zebrafish）证实，10个基点的缺失导致了帧移位肯尼亚卢比限制站点。上述靶向等位基因的PCR基因分型。

我们要感谢Steve Martin、Kaska Koltowska、Megan Addison、Xu Qiling和Sean Constable提供的实验和分析建议，以及Malcolm Logan和Pachnis实验室成员的讨论和建议。