机械生产血吸虫作为药物敏感性试验中表型预筛选的高通量工具：当前研究和未来趋势

摘要

背景

数亿人面临着感染血吸虫病的风险[1]。全世界有2.07亿多人受到感染，其中85%生活在非洲。这使得血吸虫病成为世界上最具破坏性的热带疾病之一，并且仍然是发展中国家，尤其是萨哈兰非洲国家发病率和死亡率的主要来源[1]。血吸虫病也称为“蜗牛热”，是一种由淡水蜗牛携带的水传播性吸虫病，感染了五种寄生虫中的一种血吸虫但三个主要品种主要是人类血吸虫病的病原体：曼氏血吸虫,血吸虫和日本血吸虫与血吸虫病相关的病理生理学，主要是由于对滞留在组织和器官中的血吸虫卵的免疫反应。肝脏、肠道和膀胱通常会在卵子离开宿主时将其困住。脾脏作为一个淋巴器官，会变大（脾肿大），伴随着肝脏的增大，会导致肝脾肿大。血吸虫病有急性期和慢性期。急性血吸虫病通常是短期的、轻度的，在血吸虫寄生虫首次侵入宿主皮肤后几周就会发生。但如果不进行治疗，上述三种血吸虫病中的任何一种引起的血吸虫病都可能成为慢性炎症，缓慢发展为肠器官、肝脏和膀胱等受感染组织的肿胀、纤维化和坏死，以及一系列其他症状，这些症状会逐渐损害宿主的生理甚至认知功能[2,三].

流行地区使用吡喹酮（PZQ）的大规模药物管理（MDA）仍然是血吸虫病控制计划的主要基石[4]。吡喹酮于20世纪70年代被发现，并于1988年以Biltricide的名义上市[5,6]。它是迄今为止世界卫生组织（WHO）唯一可用和推荐的治疗血吸虫病的药物。这种单一药物PZQ每年用于治疗数百万人，如最近的出版物所述，预计到2018年其覆盖范围将达到2.35亿人，这引起了人们对药物压力增加的担忧[7,8]。此外，尽管这种药物有几个优点，特别是它对所有医学上重要的成虫的高疗效血吸虫病PZQ有一些缺点，主要是对较年轻阶段的血吸虫无效[9]。这意味着治疗并不排除感染者体内的所有蠕虫，因此需要重复治疗。同样，依赖单一药物作为唯一的治疗方法，同时积极降低发病率，导致人们对潜在耐药性的发展产生了很大的担忧[10]。这些事实强调了寻找下一代抗血吸虫病药物的必要性。因此，许多研究一再建议需要新型药物，因为药物的发现和开发管道实际上是干涸的[11]。只有少数候选化合物在临床前阶段进行了研究[12]而且没有一个达到临床试验阶段。例如，一种新型抗血吸虫药物的目标产品简介[12]甲氟喹和青蒿素不能满足[13,14].

以前，TDR指定的化合物筛选中心建立的程序依赖于成虫与候选药物孵育72小时[15]。潜伏期过后，用显微镜评估寄生虫的生存能力[15]。这种基于整个成虫有机体表型的体外药物筛选方法通常需要大量使用实验动物（仓鼠、大鼠、小鼠），因为不存在体外生命周期血吸虫这种方法也很耗时且吞吐量低，并且依赖于少数能够处理复杂生命周期的研究小组专家血吸虫并致力于从哺乳动物宿主中高回收成体寄生虫和长屏幕时间表。后者是长期以来血吸虫感染需要变得明显，因为在小鼠模型中，可能需要不少于30天的时间曼索尼感染成为专利[16]其他物种甚至超过30天，例如埃及血吸虫.

不久前，使用新转化血吸虫（NTS）的筛查方法作为一种高吞吐量的方法得到了推广[17–20]。在这里，我们概述了表型筛查年轻寄生虫的替代方法，这些年轻寄生虫可以很容易地从中间宿主蜗牛中获得，数量比成虫多。本综述介绍了迄今为止使用NTS测定药物化合物、天然产物和衍生物抗血吸虫活性的体外药物敏感性分析的现状，并强调了使用NTS进行体外化合物筛选所面临的一些挑战。

在哪个阶段血吸虫生命周期是否发现血吸虫？

血吸虫有一个复杂的生命周期（图1). 血吸虫病的传播发生在携带寄生虫的人用尿液（用于泌尿生殖道血吸虫病）或粪便（用于肠道血吸虫病）污染蜗牛居住的淡水源（湖泊、池塘、河流和大坝）时。在最佳条件下，受精卵在水中孵化并释放毛蚴。一旦从卵中释放出来，奇迹虫就会在淡水中游泳，并穿透特定的中间蜗牛宿主。在蜗牛宿主中，毛蚴通过2代孢子囊（初级和次级孢子囊）的无性分裂繁殖，并在4至6周内产生尾蚴[21,22]。从蜗牛身上释放后，受感染的尾蚴可以在淡水中保持感染1到3天[22]。它们在水中游泳寻找最终的宿主。尾蚴一旦与宿主接触，就会穿透宿主皮肤，失去分叉的尾巴，变成血吸虫[22]。片理从皮肤进入静脉循环，然后进入肺部需要几天时间[22]。此路径通常在穿透后5至7天内完成。血吸虫需要至少15天的时间通过循环系统到达肝门静脉循环，在那里它们生长、成熟为成虫并结对。在人类中，成虫居住在不同位置的囊周或肠系膜微静脉中。这似乎是每个物种特有的。明确地，日本血吸虫经常发生在肠系膜上静脉引流小肠，而曼索尼常见于肠系膜上静脉，引流大肠。然而，日本血吸虫和曼索尼它们可以占据任何一个位置，并且能够在两个位置之间移动，因此不可能明确地声明在一个位置发现了一个物种。一般来说，埃及血吸虫位于膀胱的静脉丛中，但有时也可以在直肠小静脉中发现。雌性在感染后4至6周开始在其最终感染部位（膀胱或肠道）产卵。这通常持续3-5年，相当于蠕虫的寿命[22]。卵产于门静脉和膀胱周围系统的小静脉。对于曼索尼和日本血吸虫，卵子逐渐向肠腔、膀胱和输尿管移动埃及血吸虫和分别通过粪便或尿液从体内排出[22]。中间宿主蜗牛是传播的主要媒介，因此，人类接触淡水是血吸虫感染的必要条件，淡水中含有感染性幼虫形式的尾蚴[22].

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图1

的生命周期血吸虫（来源：[22])

利用新转化血吸虫（NTS）进行体外药物筛选的重要性

在成功建立寄生虫的生命周期后，开发了寄生虫体外培养技术曼索尼在实验室里[15]。该过程依赖于与候选药物一起孵育72小时的成虫，之后用显微镜评估寄生虫的生存能力[15]。这种使用全蠕虫生物进行表型筛选的方法需要大量使用仓鼠、大鼠和小鼠等实验动物，因为目前还没有体外生成成虫的程序。此外，这种方法耗时且吞吐量低。难怪近年来，研究人员将新转化血吸虫（NTS）用作抗血吸虫药物发现领域药物敏感性分析的高通量筛选工具[12,17–20,23–27].

研究血吸虫的时代始于从受感染的实验动物肺部回收成熟的片状菌体。这与仅恢复有限蠕虫带来的不便有关[19]。利用离心、针头反复抽吸或化学刺激等简单技术将尾蚴转化为血吸虫是血吸虫养殖领域的一项重要发现。如今，研究人员使用尾蚴作为血吸虫体外研究的起始材料，因为从经济角度来看，很容易获得大量血吸虫[18,19]。此外，最重要的是，根据动物保护的3Rs（减少、替换、改良）原则，使用机械转化血吸虫限制并取代了使用活动物。使用人工生产的血吸虫体外药敏试验可能作为预筛查工具。

尾蚴/血吸虫转化相关的变化

血吸虫当人们接触淡水蜗牛释放的自由游动的寄生虫幼虫（尾蚴）时，就会发生感染。尾蚴在尾鳍的帮助下在水中游动，直到它们在接触受污染的水时穿透最终宿主的皮肤。尾蚴从中间宿主到最终宿主（人类）经历了一系列适应性变化。所有这些变化都被称为转换。在转化过程中，尾蚴的尾部消失，分泌腺释放两种物质：促进皮肤附着的粘液和降解皮肤的酶[28]。此外，在血吸虫表面出现短暂的微绒毛，在被膜上形成双单位膜[29]。同时，一些糖萼丢失[29]。McLaren和Hockley报告称，在体内，通过穿透宿主皮肤获得的血吸虫表面发育有微绒毛。这种情况也发生在穿透体外制备的小鼠皮肤的血吸虫和通过机械分离尾蚴头部的尾巴制备的人工血吸虫上[30]。根据他们的调查，他们报告说，三种血吸虫的微绒毛几乎同时出现，寿命大致相同，并且表现出相同的形态特征[30].

为了适应宿主的内部环境，血吸虫在最终宿主体内迅速发生显著的生理和超微结构变化[31]。其中一些变化是糖萼的丢失，三胺酸盐转化为七胺酸盐皮层膜[29]、血吸虫对水的敏感性（失去耐水性）[28]以及分泌腺的排出。所有这些变化都导致了血吸虫病阶段。大约2-3小时内完成转换[30,32]。Brink等人于1977年发表了一项研究，对人工生产的血吸虫和尾蚴侵入隔离皮肤后恢复的血吸虫病进行了比较[33]。他们得出结论，通过机械分离尾蚴头部的尾蚴制备的血吸虫符合尾蚴向血吸虫转化的主要标准。事实证明，所有类型的血吸虫（机械获取的和尾蚴穿透隔离皮肤后恢复的）表面膜已从三胺结构变为七胺结构，并在转化后2小时内失去尾蚴糖萼[33]。他们还报告说，在体外，机械转化血吸虫的发育与尾蚴穿透隔离皮肤后获得的血吸虫相似，尽管到第12天，只有25-50%的机械转化血块达到“肠道闭合”阶段，而50-70%的皮肤转化血吸虫达到了这个阶段[33]。因此，作者提出了两个主要标准，以帮助确定尾蚴转化为血吸虫是否有效。这两个标准是，NTS必须已经形成了七胺表面膜，并且必须能够在体外生长和发育，至少达到“肠道闭合”阶段[33].

使用NTS进行体外药物筛选的要求

蜗牛和尾蚴

这些蜗牛可能是该属的布林斯它是埃及血吸虫以及的间插裂体吸虫或属生物鞭毛虫属或钉螺对于曼索尼和日本血吸虫分别是。每只蜗牛平均感染10个毛蚴[26]。在我们的实验室里，平均5个可以成功感染蜗牛。通常，蜗牛与脱氯水一起存放在水族馆的潮湿房间中，模拟12小时的昼夜循环。中间宿主蜗牛感染毛蚴后4至6周开始脱落尾蚴。根据昼夜节律，然后收集每种蜗牛，并将其单独放入24或48孔板中或试管中（每孔或每管1毫升蒸馏或脱氯自来水）。每个试管或孔板可暴露在人造光下30分钟[39]，1小时[17]，或2小时[40–43]。然后将尾蚴悬浮液收集、清洁并浓缩，使其在冰上静置30至60分钟。在这段时间里，尾蚴形成一团，沉淀并粘附在管的底部。倒出上清液，用冰镇蒸馏水代替。这种悬浮液用于制备血吸虫。有几种技术可以将尾蚴转化为血吸虫并对其进行维护[18,33,44–46]。其中一些技术在体内进行，其他技术在体外进行。宿主皮肤穿透后发生体内转化[33]当寄生虫侵入切除的皮肤时，可以获得体外转化[33,47]或者当尾蚴尾部被机械去除时[12,18–20,23–25,27,33,34,45]或化学性质[26]尾蚴体在生理介质中孵化（图2).

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图2

新改造血吸虫（NTS）程序流程图

血吸虫培养及培养基

体外培养寄生虫所需的技术是当今研究人员关注的主要领域。除了动态研究和了解寄生虫的生理、行为和新陈代谢外，在成功建立寄生虫体外培养物后，还需要大力研究和分析其排泄和分泌产物中发现的抗原分子的性质。然而，这是一项艰巨的任务，因为寄生虫有复杂的生命周期，包括不同的阶段和宿主物种需求。值得一提的是寄生蠕虫。寄生虫培养技术需要了解所有类型的微生物培养物，因为不同的寄生虫需要特定的培养条件，例如营养物、温度甚至培养条件。

寄生虫培养在生产疫苗、测试疫苗效力和生产抗原以获得血清学试剂、检测耐药性、筛选潜在治疗药物和进行流行病学研究方面有着巨大的用途。寄生虫培养一直是一项挑战。在以下情况下血吸虫转化的血吸虫可以在复杂的培养基中体外生长和维持[35]。体外培养的血吸虫的生长速度与在允许宿主中的生长速度不同，它们也不会成为成虫。使用良好和适当的方法，大约50%的培养寄生虫将在肠道完全形成的情况下成熟，10%将发育成有性别的雄性和雌性蠕虫[31]。从大量的寄生虫开始，大量的蠕虫可以很容易地被维护，并为检测提供大量的寄生虫材料。也有可能增加血吸虫形成肠道和正常生长的百分比（50%对20%）。这可以通过在培养的第一周用条件培养基补充生长培养基来实现[31]。使用Tucker等人描述的方法.[31]补充DMEM或RPMI1640介质，血吸虫属。血吸虫可以在培养基中生长至少两个月。Abdulla等人.[18]注意到选择Basch培养基169而不是RPMI进行血吸虫培养，因为蠕虫在Bash培养基中存活更多，死亡率为10%，持续长达4周，而在RPMI培养基中，平均40%至60%的寄生虫在3天内死亡，持续死亡率高达两周。Keiser在2010年报告称，片状菌在不同培养基（如MEM、DMEM、Basch或TC 199）中可以存活至少96小时[19]。Marxer等人.[26]表明补充的培养基199最适合于通过在补充的HBSS中转化获得的血吸虫的孵育。在对三种培养基（DMEM、Medium 199、Basch培养基）进行比较研究后，他们报告说，在补充的培养基199中，寄生虫在120小时后仍然存活，平均存活值为2.5，而血吸虫在Basch介质中72小时死亡，在DMEM中144小时死亡，如图所示三[26]。血吸虫在37°C和5%CO中培养₂培养箱[12,17,20,23,25–27,31,34,37,43,45,54]。研究还表明，在一周的培养过程中，Basch Medium 169中的寄生虫看起来健壮且形状和外观均匀。表中总结了培养基对血吸虫生长的影响2.

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图3

的生存时间埃及血吸虫不同文化媒体中的NTS（来源：[26])

虽然更合适的培养基因研究而异，但我们可以观察到，开始筛选化合物FDA文库的研究[25]、疟疾药物风险投资（MMV）盒子化合物[12]，甲氟喹相关芳醇[34]使用补充介质199。因此，补充培养基199似乎是培养血吸虫最合适的培养基，并可能证明为什么它被广泛用于体外筛选其他具有已知抗血吸虫活性的化合物血吸虫新转化血吸虫[12,23–25,34].

血吸虫培养成功的最大障碍是受到真菌和细菌的污染，这主要是因为寄生虫来源于非无菌蜗牛。因此，使用抗生素（青霉素和链霉素）有助于防止细菌生长和两性霉素B，一种防止真菌生长的真菌酮。使用上述不同浓度。

新转化血吸虫体外药敏试验

结论

大量抗血吸虫新药的发现之一依赖于体外全寄生虫筛选。获得足够数量的完整寄生虫生物和大量寄生虫生物来源一直令人担忧。因此，机械转化的血吸虫可能被用作抗血吸虫药物发现领域中高通量工具的替代品。这可能有助于迅速发现急需的新药，这些新药将有助于控制作为主要毁灭性寄生虫感染之一的片断病。尽管从最近的出版物中可以清楚地看出，NTS生存能力、运动能力和表型的主观测量仍然是金标准，但迄今为止尚未验证表型的自动评估。

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亚历山大·夸德沃·尼亚尔科，电子邮件：hg.ude.gu.ihcugon@okrayNA.

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